Preparação de rAAV9 para superexpressão ou Knockdown Genes em mouse Corações

Controlando a expressão ou actividade de genes específicos em vários sistemas biológicos tornou-se uma estratégia terapêutica valiosa no estudo da função do gene ^1. Uma forma directa de alcançar este objectivo é para manipular sequências de nucleótidos e de gerar alelos mutantes. Apesar de fazer, alterações específicas precisos para o genoma de células vivas ainda é um demorado e práticas de trabalho intensivo, o desenvolvimento das poderosas ferramentas TALEN e CRISPR / Cas9 abriu uma nova era de edição genoma ^2-5. Um método de laboratório mais rotina para manipulação genética tem-se centrado sobre a introdução de materiais genéticos (DNAs e RNAs contendo sequências codificantes ou siRNAs / shRNAs) nas células de expressar ou knockdown do gene (s) de interesse ^1,6.

Em muitos casos, o principal ponto de estrangulamento para a manipulação de genes é a entrega de ADN, ARN, ou proteínas nas células. No que se refere a estudos in vitro, transfecti eficienteem sistemas foram estabelecidas em muitas linhas de células cultivadas. No entanto, no modelo de ratinho, em particular, na entrega de genes in vivo é mais difícil. Há uma série de barreiras extra e intracelulares que precisam ser contornado, de modo a conseguir a absorção celular eficiente dos reagentes exógenos. Obstáculos adicionais incluem a rápida depuração ea curta duração do ^7,8 materiais entregues. Uma estratégia para contornar esses problemas é a utilização de vetores virais como "portadores" ou "veículos" para na entrega de genes in vivo. As propriedades de transdução naturalmente evoluídos de vírus permitir o fornecimento eficiente de um gene de interesse em células ^7,9,10. Numerosos tipos de vectores virais têm sido desenvolvidos e permitir flexível na manipulação de genes in vivo em diferentes tipos de células e órgãos de ratinhos.

Os sistemas virais mais comumente usadas incluem retrovírus, lentivírus, adenovírus, e vírus adeno-associado (AAV) <s-se> 11. Os retrovírus são vírus de ARN de cadeia simples e pode introduzir o seu material genético para o genoma da célula hospedeira de uma forma estável durante a divisão mitótica, proporcionando o potencial para a expressão ao longo da vida dos genes transduzidas nas células e órgãos alvo ^12-14. No entanto, muitos tipos de retrovírus apenas para infectar células em divisão, e a sua eficácia nas células que não se dividem ¹⁵ é muito baixa. Isto limita a sua utilidade para a entrega de genes. Lentivírus é um gênero da família Retroviridae. Diferente de outros retrovírus, lentivírus pode infectar tanto células em divisão e que não se dividem e tem sido amplamente utilizado para a transferência de genes em pós-mitótico e células altamente diferenciadas ^16. O ciclo de vida de lentivírus também envolve a integração do ADN do vector no genoma do hospedeiro. Assim, a entrega de genes, mediada Lentivírus permite a expressão estável e de longa duração dos elementos genéticos transduzidas ^16-18. No entanto, esse recurso pode representar um duplo-eespada DGED na utilização destes vírus para manipular a expressão de genes, a integração do DNA vector pode levar a mutagénese de inserção nas células hospedeiras e podem causar efeitos artefatuais. O adenovírus é um outro sistema de entrega de genes amplamente utilizado. Ao contrário dos retrovírus e lentivírus, adenovírus são não integrado e não interfere com a integridade genómica de células hospedeiras ^8,10,11,19. Além disso, adenovírus pode transfectar ADN em muitos tipos de células, e a infecção não é dependente de divisão celular activa ^19. Outra característica importante de adenovírus é a facilidade de purificação do vector, como os vectores virais têm a capacidade de ser replicado ^19,20. No entanto, a ressalva importante deste sistema é que a infecção com adenovírus pode provocar fortes respostas imunitárias em células e órgãos alvo ^19, limitando o seu uso em muitas investigações, particularmente em estudos de terapia génica.

Comparado com estes diferentes tiposs de vectores virais, vírus recombinante adeno-associado (rAAV) parece ser o sistema de entrega de genes ideal ^21,22. Ela exibe imunogenicidade mínima e patogenicidade ^23,24. Além disso, de rAAV infecta uma ampla gama de tipos de células, incluindo ambas as células que não se dividem e divisória. Na maioria dos casos, rAAV não se integra nos genomas de acolhimento; Assim, o risco de alterações genéticas ou genómicas indesejáveis nas células alvo é baixa ^22.

Recentemente, sistemas de rAAV foram usadas com êxito para a administração in vivo de ADN que codifica proteínas, miARNs, shRNAs, e CRISPR-gRNAs no músculo cardíaco do rato ^23,25-29. Esta metodologia tem facilitado investigações fundamentais e estudos de terapia gênica no domínio da investigação cardiovascular. Aqui, o procedimento detalhado para gerar vectores rAAV9 que sobre-expressam de forma eficiente ou eliminação dos genes de interesse em corações de rato foi descrito. O protocolo proporciona um método simples e eficaz demanipular a expressão de genes cardíacos em modelos experimentais de murino.