גני הכנת rAAV9 כדי overexpress או מציאת עכבר לבבות
Summary
In this manuscript, a method to prepare recombinant adeno-associated virus 9 (rAAV9) vectors to manipulate gene expression in the mouse heart is described.
Abstract
שליטה על הביטוי או פעילות של גנים ספציפיים באמצעות משלוח שריר הלב של חומרים גנטיים במודלי Murine מתירה חקירת פונקציות גן. הפוטנציאל הטיפולי שלהם בלב ניתן לקבוע גם. ישנן גישות מוגבלות להתערבות מולקולרית in vivo בלב העכבר. Adeno הקשורים וירוס רקומביננטי (rAAV) הנדסת הגנום מבוססת נוצלה ככלי חיוני מניפולצית גני in vivo לב. היתרונות הספציפיים של טכנולוגיה זו כוללים יעילות גבוהה, סגולי גבוהה, שיעור אינטגרציה הגנומי נמוך, מינימאלית immunogenicity, ו פתוגניות מינימלי. כאן, נוהל מפורט לבנות, חבילה, ולטהר את וקטורי rAAV9 מתואר. הזרקה תת עורית של rAAV9 לתוך גורים בילוד תוצאת ביטוי חזק או מציאה יעילה של הגן (ים) של עניין בלב העכבר, אך לא בכבד וברקמות אחרות. שימוש-ספציפי הלבאמרגן ג TnnT2, ביטוי גבוה של גן GFP בלב הושג. בנוסף, למקד mRNA היה עצור בלב כאשר rAAV9-U6-shRNA נוצל. עבודת ידע טכנולוגי rAAV9 עשויה להיות שימושית עבור חקירות לב וכלי דם.
Introduction
שליטת ביטוי או פעילות של גנים ספציפיים במערכות ביולוגיות שונות הפכה אסטרטגיה יקרה בחקר גן הפונקציה 1. אמצעי ישיר יותר לביצוע מטרה זו היא לתפעל רצפי נוקליאוטידים וליצור אללים מוטנטים. למרות ביצוע שינויים מדויקים, ממוקד הגנום של תא חי הוא עדיין זמן רב ותרגול עתיר עבודה, פיתוח כלי Talen ו Crispr / Cas9 עצמת פתחת עידן חדש של עריכת הגנום 2-5. שיטת מעבדה שיגרתית יותר למניפולציות גן התמקדה הנהגת חומרים הגנטי (DNAs ו RNAs המכיל רצפי קידוד או siRNAs / shRNAs) לתוך התאים לבטא או מציאת הגן (ים) של עניין 1,6.
במקרים רבים, צוואר הבקבוק העיקרי עבור מניפולצית גן הוא המשלוח של DNA, RNA, או חלבון לתוך התאים. בכל הקשור ללימודי חוץ גופית, transfecti ביותרעל מערכות הוקמו שורות תאים בתרבית רבות. עם זאת, במודל העכבר בפרט, למסירת גן vivo ב היא אתגר גדול יותר. יש סדרה של מחסומי חוּץ ו תאיים שצריכים לעקוף אותו כדי להשיג ספיגת הסלולר יעילה של חומרים כימיים אקסוגניים. מכשולים נוספים כוללים את האישור המהיר משך הקצרה של 7,8 חומרים הנמסרים. אסטרטגיה אחת לעקוף בעיות אלה היא להשתמש וקטורים ויראליים כמו "ספקים" או "כלי רכב" למסירת גן vivo. המאפיינים התמרה טבעי- התפתחו של וירוסים לאפשר אספקה יעילה של הגן של עניין לתאים 7,9,10. סוגים רבים של וקטורים ויראליים פותחו ולאפשר גמישות מניפולציה גן vivo בסוגי תאים שונים ואיברים בעכברים.
המערכות ויראלי הנפוץ ביותר בשימוש כוללים רטרו-וירוס, Lentivirus, Adenovirus, ו-associated virus Adeno (AAV) <sעד> 11. רטרווירוסים הם וירוסי RNA חד-גדילים ויכולים להציג חומר הגנטי שלהם לגנום התא המארח באופן יציב במהלך חלוקת mitotic, מתן פוטנציאל הביטוי לאורך כל חייהם של גני transduced בתאי המטרה והאיברים 12-14. עם זאת, סוגים רבים של רטרווירוסים רק להדביק חלוקת תאים, והיעילות שלהם בתאים שאינם מתחלקים מאוד נמוכה 15. זה מגביל השירות שלהם למסירת גן. Lentivirus הוא סוג של משפחה Retroviridae. שונה רטרווירוסים אחרים, Lentivirus יכול להדביק שני התאים המתחלקים ולא להתחלק כבר בשימוש נרחב עבור העברת גנים לתוך-mitotic פוסט ותאי-מובחנים מאוד 16. מחזור החיים של Lentivirus כרוך גם שילוב של DNA וקטור לתוך הגנום המארח. לפיכך, למסירה גן Lentivirus בתיווך מאפשרת ביטוי יציב וארוך משך אלמנטים גנטיים transduced 16-18. עם זאת, תכונה זו יכולה לייצג-e כפולחרב dged בשימוש וירוסים אלה כדי לתפעל ביטוי גנים, כמו שילוב של DNA וקטור עלול להוביל mutagenesis insertional בתאים הפונדקאי ויכול לגרום לתופעות artefactual. Adenovirus הוא בשימוש נרחב אחר מערכת למסירת הגן. בניגוד רטרווירוסים ו lentiviruses, adenoviruses הם שאינם משולבים ואינם מפריעים שלמות הגנומי של תאים לארח 8,10,11,19. בנוסף, adenoviruses יכול transfect DNA לתוך תאים מסוגים רבים, והזיהום אינו תלוי 19 חלוקת התא פעיל. מאפיין נוסף חשוב של adenoviruses היא הקלות של טיהור וקטור, כמו וקטורים ויראליים יש את היכולת להיות משוכפל 19,20. עם זאת, האזהרה העיקרית של מערכת זו היא כי זיהום Adenovirus יכול לעורר תגובות חיסוניות חזקות בתאי יעד ואיברים 19, הגבלת שימוש בחקירות רבות, במיוחד בלימודי ריפוי גנטי.
לעומת אלה מסוג אחרים של וקטורים ויראליים, רקומביננטי Adeno הקשורים וירוס (rAAV) נראה כי מערכת למסירה גן אידיאלי 21,22. הוא מציג immunogenicity מינימלי פתוגניות 23,24. בנוסף, rAAV מדביק מגוון רחב של סוגי תאים, כולל שני המפריד תאים שאינם מתחלקים. ברוב המקרים, rAAV לא להשתלב בגנום המארח; וכך, את הסיכון של שינויים גנטיים או הגנומי רצויים בתאי המטרה הוא 22 נמוך.
לאחרונה, מערכות rAAV שימשו בהצלחה עבור משלוח in vivo של חלבונים קידוד DNA, miRNAs, shRNAs, ו Crispr-gRNAs לעכבר הלב שרירים 23,25-29. מתודולוגיה זו יש להקל חקירות יסוד ולימודי ריפוי גנטי בתחום מחקר לב וכלי דם. כאן, הנוהל המפורט ליצור וקטורי rAAV9 ביעילות ביטוי יתר או מציאת הגנים של עניין לבבות עכבר תוארה. הפרוטוקול מספק שיטה פשוטה ויעילה שלמניפולציה ביטוי גנים הלב במודלים ניסיוניים בעכברים.
Protocol
Representative Results
Discussion
חשוב למזער רקומבינציה ITR הרצויה במהלך בניית פלסמיד. לפני יצירת הווירוס, אחד חייב תמיד לפקח על שלמות ITR של פלסמידים AAV באמצעות עיכול הגבלה ו ג'ל אלקטרופורזה agarose. אי אפשר להשיג 100% פלסמידים ללא פגע, אך יחס רקומבינציה יש לצמצם ככל האפשר. פחות מ -20% מקובלים לאריזת rAAV9 מוצלחת…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Zaffar Haque for careful reading of the manuscript. We thank Drs. Masaharu Kataoka and Gengze Wu for discussions and help. Work in the Wang lab is supported by the American Heart Association, Muscular Dystrophy Association, and NIH (HL085635, HL116919, HL125925).
Materials
| Polyethylenimine, Linear (MW 25,000) | Polysciences, Inc. | #23966-2 | |
| Tube, Polypropylene, 36.2 mL, 25 x 87 mm, (qty. 56) | Beckman Coulter, Inc | # 362183 | |
| Nuclease, ultrapure | SIGMA | #E8263-25KU | |
| Density Gradient Medium(Iodixanol) | SIGMA | #D1556-250ML | |
| Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane | EMD Millipore Corporation | #UFC910008 | |
| Laboratory pipetting needle with 90° blunt ends,gauge 14, L 6 in., nickel plated hub | SIGMA | #CAD7942-12EA | |
| Poloxamer 188 solution (Pluronic® F-68 solution) | SIGMA | P5556-100ML | |
| Proteinase K | SIGMA | 3115828001 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| Centrifuge machine | Thermo Scientific | 75004260 | |
| Centrifuge System | Beckman Coulter | 363118 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| DMEM medium | Fisher Scientific | SH30243FS | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| rAAV9 vector | Penn Vector Core | P1967 |
Riferimenti
- Primrose, S. B., Twyman, R. . Principles of gene manipulation and genomics. , (2013).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346, 1258096 (2014).
- Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends Biotechnol. 31, 397-405 (2013).
- Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157, 1262-1278 (2014).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat. Biotechnol. 32, 347-355 (2014).
- Szulc, J., Wiznerowicz, M., Sauvain, M. -. O., Trono, D., Aebischer, P. A versatile tool for conditional gene expression and knockdown. Nat. Methods. 3, 109-116 (2006).
- Nimesh, S., Halappanavar, S., Kaushik, N. K., Kumar, P. Advances in Gene Delivery Systems. BioMed Res. Int. 2015, 610342 (2015).
- Kamimura, K., Suda, T., Zhang, G., Liu, D. Advances in gene delivery systems. Pharm. Med. 25, 293-306 (2011).
- Thomas, C. E., Ehrhardt, A., Kay, M. A. Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy. Nat. Rev. Genet. 4, 346-358 (2003).
- Giacca, M., Zacchigna, S. Virus-mediated gene delivery for human gene therapy. J. Control Release. 161, 377-388 (2012).
- Witlox, M., Lamfers, M., Wuisman, P., Curiel, D., Siegal, G. Evolving gene therapy approaches for osteosarcoma using viral vectors: review. Bone. 40, 797-812 (2007).
- De Miguel, M. P., Cheng, L., Holland, E. C., Federspiel, M. J., Donovan, P. J. Dissection of the c-Kit signaling pathway in mouse primordial germ cells by retroviral-mediated gene transfer. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 10458-10463 (2002).
- Nagano, M., Shinohara, T., Avarbock, M. R., Brinster, R. L. Retrovirus-mediated gene delivery into male germ line stem cells. FEBS Lett. 475, 7-10 (2000).
- Scharfmann, R., Axelrod, J. H., Verma, I. M. Long-term in vivo expression of retrovirus-mediated gene transfer in mouse fibroblast implants. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88, 4626-4630 (1991).
- Katz, R. A., Greger, J. G., Skalka, A. M. Effects of cell cycle status on early events in retroviral replication. J. Cell. Biochem. 94, 880-889 (2005).
- Escors, D., Breckpot, K. Lentiviral vectors in gene therapy: their current status and future potential. Arch. Immunol. Ther. Exp. 58, 107-119 (2010).
- Mátrai, J., Chuah, M. K., VandenDriessche, T. Recent advances in lentiviral vector development and applications. Mol. Ther. 18, 477-490 (2010).
- Miyazaki, Y., Miyake, A., Nomaguchi, M., Adachi, A. Structural dynamics of retroviral genome and the packaging. Front. Microbiol. 2, 1-9 (2011).
- Douglas, J. T. Adenovirus-Mediated Gene Delivery. Gene Delivery to Mammalian Cells: Volume 2: Viral Gene Transfer Techniques. , 3-14 (2004).
- Armendáriz-Borunda, J., et al. Production of first generation adenoviral vectors for preclinical protocols: amplification, purification and functional titration. J. Biosci. Bioeng. 112, 415-421 (2011).
- Snyder, R. O. Adeno-associated virus-mediated gene delivery. J Gene Med. 1, 166-175 (1999).
- Samulski, R. J., Muzyczka, N. AAV-mediated gene therapy for research and therapeutic purposes. Annu. Rev. Virol. 1, 427-451 (2014).
- Kaplitt, M. G., et al. Long-term gene transfer in porcine myocardium after coronary infusion of an adeno-associated virus vector. Ann. Thorac. Surg. 62, 1669-1676 (1996).
- Kaspar, B. K., et al. Myocardial gene transfer and long-term expression following intracoronary delivery of adeno-associated virus. J. Gene. Med. 7, 316-324 (2005).
- Ding, J., et al. Trbp regulates heart function through microRNA-mediated Sox6 repression. Nat. Genet. 47, 776-783 (2015).
- Lin, Z., et al. Cardiac-specific YAP activation improves cardiac function and survival in an experimental murine MI model. Circ. Res. 115, 354-363 (2014).
- Wahlquist, C., et al. Inhibition of miR-25 improves cardiac contractility in the failing heart. Nature. 508, 531-535 (2014).
- Carroll, K. J., et al. A mouse model for adult cardiac-specific gene deletion with CRISPR/Cas9. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 113, 338-343 (2016).
- Jiang, J., Wakimoto, H., Seidman, J., Seidman, C. E. Allele-specific silencing of mutant Myh6 transcripts in mice suppresses hypertrophic cardiomyopathy. Science. 342, 111-114 (2013).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat. Methods. 6, 343-345 (2009).
- Rychlik, W., Spencer, W., Rhoads, R. Optimization of the annealing temperature for DNA amplification in vitro. Nucleic Acids Res. 18, 6409-6412 (1990).
- Allocca, M., et al. Serotype-dependent packaging of large genes in adeno-associated viral vectors results in effective gene delivery in mice. J. Clin. Invest. 118, 1955-1964 (2008).
- Wu, Z., Yang, H., Colosi, P. Effect of genome size on AAV vector packaging. Mol. Ther. 18, 80-86 (2010).
- Li, J., Sun, W., Wang, B., Xiao, X., Liu, X. -. Q. Protein trans-splicing as a means for viral vector-mediated in vivo gene therapy. Hum. Gene Ther. 19, 958-964 (2008).
- Piras, B. A., O’Connor, D. M., French, B. A. Systemic delivery of shRNA by AAV9 provides highly efficient knockdown of ubiquitously expressed GFP in mouse heart, but not liver. PLoS One. 8, e75894 (2013).
- Lovric, J., et al. Terminal differentiation of cardiac and skeletal myocytes induces permissivity to AAV transduction by relieving inhibition imposed by DNA damage response proteins. Mol. Ther. 20, 2087-2097 (2012).
