Flüoresan Korelasyon Spektroskopisi Ölçülen İlköğretim Lenfositler Plazma Membranlarda moleküler difüzyon
Summary
A method to measure protein diffusion in membranes of primary immune cells using fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is described. In this paper, the use of antibodies for fluorescent labeling is illustrated.
Abstract
Flüoresan korelasyon spektroskopisi (FCS) yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlüğe sahip biyolojik membranların içindeki moleküllerin difüzyon çalışmak için güçlü bir tekniktir. FCS hücre zarındaki floresan etiketli moleküllerin moleküler konsantrasyon ve difüzyon katsayısının ölçmek olabilir. Bu teknik, (gerçek ölçüm süresi boyunca sonucu etkileyen işlemleri olmadan IE) sürekli halde bağışıklık hücrelerinin plazma membranında moleküllerin moleküler difüzyon karakteristiklerini yeteneğine sahiptir. FCS çok endojen proteinler için tipik bir seviyede ifade edilen proteinleri difüzyonunu çalışmak için uygundur. Burada, birincil lenfositleri üzerinde hücre zarı proteinlerinin difüzyon oranını belirlemek için basit ve sağlam bir yöntem olduğunu göstermiştir. antikor lekeli canlı hücreler ve kazanılmasından sonra sık görülen gözlemlere ölçümleri gerçekleştirmek için etkili bir yoldur açıklanmıştır. son gelişmelerverilmedi-kararlı floresan boyalar geliştirilmesinde ölçümler sırasında yoğun ağartıcı olmayan boyalar, uygun ilgi antikorlar eşleştirilmesiyle kullanılabilir. Buna ek olarak, bu hücre zarlarında ifade edilen proteinlerin genel bir özelliğidir yavaş difüzyon kişiler tespiti için verir. Oluşturulan otokorelasyon eğrileri moleküler konsantrasyon ve difüzyon parametreleri ayıklamak için analiz prosedürü vurgulanır. Özet olarak, FCS ölçümleri için temel protokol sağlanmıştır; o konfokal mikroskopi anlayışı ile ancak böyle moleküler difüzyon oranları gibi dinamik parametrelerini, ölçme teknikleri başka hiçbir önceki deneyimi ile immünolojistler tarafından takip edilebilir.
Introduction
Birçok bağışıklık hücreleri fonksiyonlarını moleküler difüzyon ve zarlar içinde etkileşimler güveniyor. Biyolojik zarlar karmaşıktır ve hücre membranları 1 içindeki proteinlerin geçiş yayılma hızını etkileyebilir immün hücrelerin fonksiyonu için önemli olabilir birçok faktör. Son zamanlarda, doğuştan gelen bağışıklık sistemine ait, doğal öldürücü (NK) hücreler, lenfosit, NK hücreleri 2 durumuna bağlı olarak, hücre zarı iki çalışılan protein ayırıcı difüzyon sergilediklerini göstermiştir.
Flüoresan korelasyon spektroskopisi (FCS), biyolojik zarlar içinde moleküler difüzyon oranları miktarının kapasitesine sahip bir tekniktir. Bu floresan sabit hacimde molekülleri etiketli ortalama difüzyon oranı, bir konfokal mikroskop tipik odak bildirir. Bu moleküler hareketi üzerine ortaya floresan dalgalanmaların ölçülmesine dayanırkararlı halde bir sistem. FCS yaygın çözelti içinde ve lipid zarlar içinde hem de floresan boyalar ve proteinlerin difüzyon incelemek için kullanılmıştır. Difüzyon hızını etkileyen diğer çıkış parametreleri de dolaylı olarak, bu şekilde incelenebilir (örneğin, protein ya da hücre membranları üzerinde moleküllerinin etkileşimleri konformasyonel değişiklikler) 3, 4. FCS tek-molekül tespiti için olasılığını sağlayan yüksek duyarlılığı nedeniyle diğer tekniklerle karşılaştırıldığında göze çarpıyor. Bu, çoğu proteinin 5 'nın endojen ekspresyonunun seviyeleri tipik milimolar aralığına nanomolar, moleküler konsantrasyonları için çalışır. çoğu diğer teknikler sadece protein ekspresyon düzeyleri hakkında nispi bilgi verirken Ayrıca, FCS, çalışılan hacmi içindeki proteinlerin mutlak sayısının bir yaklaşım verebilir. membranlar fluo dahil olan diğer yöntemler moleküler difüzyon oranlarını ölçmek için(Sıkı bağlamak) photobleaching sonra rescence kurtarma, tek parçacık izleme (SPT), çoklu iğne deliği FCS ve görüntü korelasyon yöntemleri. Sıkı bağlamak ve görüntü korelasyon yöntemleri genellikle moleküllerin 10 mutlak sayısı hakkında bilgi vermeyin topluluk teknikleri vardır. SPT ile karşılaştırıldığında, FCS verimi nüfusun ortalama karakterize açısından yüksektir. lazer odak içinde mevcut moleküllerin ortalama difüzyon oranı oldukça tek moleküllerin oranından daha ölçülür çünkü analizi de daha az talep ediyor. Özel mikroskoplar 11 mevcut değilse, standart SPT etiketleme tek moleküllerin tanımlanmasına olanak sağlamak için çok düşük olması gerektiğinden Ayrıca, SPT, konsantrasyonları hakkında herhangi bir bilgi veremem. Öte yandan, FCS çalışılan moleküller mobil olmasını gerektirir. Bu sadece çok yavaş hareket eden herhangi bir farazi hareketsiz kesirleri veya molekülleri tespit olmayacaktır. moleküllerin difüzyon oranı ouzun edinimi süresi yaklaşık onda biri doğru FCS ölçümlerinin 3, 12 temsil olmayacak daha odak içinde bulunur. Bu nedenle, FCS tarafından kaydedilen difüzyon katsayıları to-hareketsiz-yakın ve çok yavaş fraksiyonlar yanı sıra dikkate alınır FRAP ve SPT gibi tekniklerden rapor difüzyon oranlarından daha hızlı olma eğilimindedir. SPT da olacak FCS daha moleküler nüfus içerisindeki difüzyon oranlarının değişkenliği daha ayrıntılı bir açıklama verecektir.
FCS heyecanlı hacmi içinde zamanla floresan dalgalanma rakamlarla. Membran ölçümleri durumunda, bu zarın aydınlatılmış bölgeye çevirir. Bu yazıda, bu tür dalgalanmalar Brown difüzyon sergileyen molekülleri tarafından uyarılan ve böylece ve uyarma hacminin dışında hareket gerçeğini kullanmaktadır. fluctua için birkaç olası kaynak vardırBu tür bağlayıcı unbinding tüm hücre zarı ligandı ya da hareket, yanıp sönen veya flüoroforlar, çevresel etkiler bir triplet halinin varlığı olarak floresans sinyalinde yonlar. Bu farazi hata kaynakları sonuçları doğru 12, 13 yorumlamak amacıyla bir FCS deney tasarımı dikkate alınması gerekir. Tipik olarak, biyolojik zarların yanal difüzyon oranları zar proteinleri arasında proteinler ve hücre iskeletinin arasında hem kalabalık ve etkileşimleri nedeniyle düşüktür. Tarihsel, zarlarında FCS kullanımı dolayısıyla uyarma odak 14 boyunca uzatılmış geçiş zamanlarında ağartma önlemek için gerekli olan foto stabil fluorophores, eksikliği engel olmuştur. Ancak, bugün, uygun foto stabil boyalar için pek çok seçenek vardır. detektör ve diğer donanım önemli gelişmeler de floresan prote algılanmasına izinins ve alt parlaklık boyalar. Burada, antikor etiketli ilgili protein flüoresan ile etiketlenmiş olan fare primer lenfositleri kullanılarak FCS uygulama için temel protokol, tarif edilmektedir. difüzyon katsayısı ve moleküler yoğunluğu elde etmek için otokorelasyon eğrileri uygun bir yaklaşım da gösterilmiştir. protokol kolayca moleküllerin difüzyon çalışması için teknikler daha önce hiç deneyimi olan immünolojistler tarafından takip ediliyor amaçlamaktadır. Ancak, konfokal mikroskopi temel bir anlayış beklenmektedir (referans 15'e bakın, bu temel anlayış kazanmak için). Bu protokol, nispeten kolay bir şekilde, diğer süspansiyon hücreleri hücre hatları ve primer hücreler hem de adapte edilebilir. Daha tecrübeli FCS kullanıcılar için, daha rafine analiz yöntemleri olan bazı tartışmalar anlatılmıştır, mevcuttur.
Protocol
Representative Results
Discussion
FCS Bu protokol bağışıklık hücrelerinin (murin, insan ya da diğer türlerin) her türlü yüzey moleküllerinin moleküler dinamiklerini değerlendirilmesi için de kullanılabilir. aşağı canlı hücrelerde tek-molekül çözünürlüğü FCS önlemler uzay-zamansal moleküler dinamik. Moleküler yoğunluğu, hem de ilgi konusu olan proteinlerin difüzyon hızı ve kümelenme dinamiği, otomatik korelasyon eğrisi elde edilebilir.
floresan etiketleme başarılı FCS deneyler için …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz Zeiss Confocor 3 aracın bakımı için ve hücre ölçümleri konusunda yararlı ipuçları Dr. Vladana Vukojeviç, Moleküler Tıp Merkezi, Karolinska Enstitüsünde teşekkür ederim. Bu çalışmada, Magnus Bergvalls Stiftelse ve Stiftelsen Claes Groschinskys minnesfond gelen Vetenskapsrådet hibe (1629 hibe sayısı 2012-) tarafından finanse edildi.
Materials
| MACS NK Cell Isolation Kit mouse II | Miltenyi Biotec NordenAB | 130-096-892 | Negative selection of NK cells |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Adlrich | F7524 | Heat inactivated |
| Phosphate Buffered Saline | – | – | Made in house |
| Roswell Park Memorial Institute medium 1640 | PAA The Cell Culture Company | E15-848 | Transparent medium |
| Antibody clone 2.4G2 | Thermo Fischer Scientific | 553140 | For blocking Fc-receptors. |
| Anti-Ly49A antibody | Monoclonal antibody made in house and conjugated in house to Alexa fluor 647 | ||
| Clone JR9.318 | |||
| Anti-H-2Dd antibody | BD Pharmingen | 558915 | Conjugated in house to MFP488 |
| Clone 34.5.8S | |||
| MFP488 | Mobiotech | MFP-A2181 | Fluorescent dye for antibody conjugation. |
| Poly-L-Lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | Diluted in distilled water (1.10) |
| Poly-L-Lysine (20 kDa) grafted with polyethylene glycol (2 kDa) | SuSoS AG | PLL(20)-g[3.5]-PEG(2) | Diluted in PBS (pH 7.4) to 0.5 mg/ml. |
| Rhodamine 110 chloride | Sigma-Aldrich | 432202 | Known diffusion coefficient: 3.3 × 10−10 m2/s 19 |
| Alexa fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A20006 | Known diffusion coefficient: 4.4 × 10−10 m2/s 20 |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM510 | |
| Software: Confocor 3 | Zeiss | ||
| Software: Matlab with curve fitting toolbox | Matlab | Version R2013b | |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | Thermo-scientific | 155411 | 8 wells, 1.0 borosilicate bottom |
Riferimenti
- Goni, F. M. The basic structure and dynamics of cell membranes: an update of the Singer-Nicolson model. Biochim Biophys Acta. 1838, 1467-1476 (2014).
- Bagawath-Singh, S., et al. Cytokines Induce Faster Membrane Diffusion of MHC Class I and the Ly49A Receptor in a Subpopulation of Natural Killer Cells. Front Immunol. 7, (2016).
- Garcia-Saez, A. J., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy for the study of membrane dynamics and protein/lipid interactions. Methods. 46, 116-122 (2008).
- Machan, R., Wohland, T. Recent applications of fluorescence correlation spectroscopy in live systems. FEBS Lett. 588, 3571-3584 (2014).
- Mutze, J., Ohrt, T., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy in vivo. Laser Photon Rev. 5, 52-67 (2011).
- Lidke, D. S., Wilson, B. S. Caught in the act: quantifying protein behaviour in living cells. Trends Cell Biol. 19, 566-574 (2009).
- Manzo, C., Garcia-Parajo, M. F. A review of progress in single particle tracking: from methods to biophysical insights. Rep Prog Phys. 78, 124601 (2015).
- Wiseman, P. W. Image correlation spectroscopy: principles and applications. Cold Spring Harb Protoc. , 336-348 (2015).
- Sankaran, J., Shi, X., Ho, L. Y., Stelzer, E. H., Wohland, T. ImFCS: a software for imaging FCS data analysis and visualization. Opt Express. 18, 25468-25481 (2010).
- Liu, P., Ahmed, S., Wohland, T. The F-techniques: advances in receptor protein studies. Trends Endocrinol Metab. 19, 181-190 (2008).
- Manley, S., et al. High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy. Nat Methods. 5, 155-157 (2008).
- Bacia, K., Haustein, E., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy: principles and applications. Cold Spring Harb Protoc. , 709-725 (2014).
- Haustein, E., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy: novel variations of an established technique. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 36, 151-169 (2007).
- Widengren, J., Thyberg, P. FCS cell surface measurements–photophysical limitations and consequences on molecular ensembles with heterogenic mobilities. Cytometry A. 68, 101-112 (2005).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners’ guide to practical pitfalls in image acquisition. J Cell Biol. 172, 9-18 (2006).
- Meinhardt, K., et al. Influence of NK cell magnetic bead isolation methods on phenotype and function of murine NK cells. J Immunol Methods. 378, 1-10 (2012).
- Bacia, K., Schwille, P. Practical guidelines for dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy. Nat Protoc. 2, 2842-2856 (2007).
- Gendron, P. O., Avaltroni, F., Wilkinson, K. J. Diffusion coefficients of several rhodamine derivatives as determined by pulsed field gradient-nuclear magnetic resonance and fluorescence correlation spectroscopy. J Fluoresc. 18, 1093-1101 (2008).
- Petrasek, Z., Schwille, P. Precise measurement of diffusion coefficients using scanning fluorescence correlation spectroscopy. Biophys J. 94, 1437-1448 (2008).
- Stromqvist, J., et al. A modified FCCS procedure applied to Ly49A-MHC class I cis-interaction studies in cell membranes. Biophys J. 101, 1257-1269 (2011).
- Widengren, J., Mets, U., Rigler, R. Fluorescence Correlation Spectroscopy of Triplet-States in Solution – a Theoretical and Experimental-Study. J Phys Chem. 99, 13368-13379 (1995).
- Humpolickova, J., et al. Probing diffusion laws within cellular membranes by Z-scan fluorescence correlation spectroscopy. Biophys J. 91, L23-L25 (2006).
- Guo, S. M., et al. Bayesian approach to the analysis of fluorescence correlation spectroscopy data II: application to simulated and in vitro data. Anal Chem. 84, 3880-3888 (2012).
- Ries, J., et al. Automated suppression of sample-related artifacts in Fluorescence Correlation Spectroscopy. Opt Express. 18, 11073-11082 (2010).
- Chiu, C. L., et al. Intracellular kinetics of the androgen receptor shown by multimodal Image Correlation Spectroscopy (mICS). Sci Rep. 6, 22435 (2016).
- Wegel, E., et al. Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison. Sci Rep. 6, 27290 (2016).
