利用功能基因组筛选识别在肿瘤细胞球体培养潜在的新药物靶标

在超低附着96-孔板球体测定提供在该更容易地概括在体内的肿瘤中发现的生理条件的上下文潜在致癌高通量的表型评估。事实上，癌细胞系MCF10DCIS.com和BT474形式紧球体结构（ 图1A）和球体部分的免疫组织学调查表明在细胞和核形态截然不同的空间变化。随着时间的推移，有些球体如BT474球体开发坏死区，攻击实体肿瘤（ 图1B）的一个共同特点。一些球状体不发展坏死核心，如MDA-MB-231细胞系，但这样做在增殖标记Ki67的，它反比裂解caspsase-3表达，细胞凋亡的标志物（ 图1C）相关的显示标记的变化。以建立多个细胞系是确实雷杰普略去对的siRNA介导的基因沉默的BT474，MCF10DCIS.com，MDA-MB-231和JIMT1细胞反向用siRNA转染的七天。转染试剂（模拟）或对照siRNA转染的存在下对球状体存活力没有效果，而在测试的所有细胞系（ 图1D）沉默必需基因泛素B（UBB）显著减少球体生存能力。 我们设计了包含在未选择的最常突变的基因，ER +，HER2 +和三阴性乳腺癌人类的siRNA库。这个库由已知功能的基因，如MYC，PIK3CA和TP53和那些贡献致癌是不成立的。屏幕还包含几个非靶向对照siRNA（对照＃1，对照＃2）和siRNA的靶向必需基因，例如PLK1和UBB，它作为杀对照（ 表1）。我们选择使用乳房CANC儿细胞系BT474，因为它们容易形成不加入重组基底膜的球状体，建立主力细胞系和具有已知的基因组结构。例如，BT474细胞是阳性对雌激素受体（ER +），过表达人类表皮生长因子受体2（HER2 +）和海港突变TP53（E285K）和PIK3CA（K111N）13。 采用以上概述的协议中，我们监测了冲击基因耗竭对球体的尺寸和生存能力七天后的siRNA的反向转染的（ 图1E）。有趣的是，大多数的基因并没有对球体区域或活力（ 图2A）一个显著效果。 FOXO3，PIK3CA，ERBB2和SF3B1的沉默导致球体大小的最显著重现性减少。这种减少也有人在球体的可行性后观察ErbB2和SF3B1沉默。令人鼓舞的是，我们的confirmed的PIK3CA，ERBB2和SF3B1使用明场显微镜（ 图2B）中球体大小沉默的影响。我们先前确定SF3B1在众多细胞系模型必需基因，从而siSF3B1代表除了UBB 14良好的杀灭控制。有趣的是，所有的200个基因的仅E-钙粘蛋白的沉默导致球体活力（ 图2A）一个显著增加。球体形态的调查显示，E-钙粘蛋白沉默导致球体结构的彻底破裂，用活细胞停留在低附着孔的底部（ 图2B）。球体体积屏幕数据的手动重新调查表明，这也已经观察到，但已经从区域量化淘汰，由于其目标是高于设定大小限制。正如前面所强调的，BT474细胞过度表达受体酪氨酸激酶HER2和在港的致癌基因突变 PIK3CA（K111N）。我们证实ERBB2和PIK3CA的那沉默导致降低的球体可行性，同时用非靶向对照转染均无影响（ 图2C）。 接下来我们调查的siRNA消耗对球体组织学的影响。 BT474球状体反向与非靶向对照siRNA和siRNA的靶向PIK3CA，ERBB2和UBB转。 ErbB2和UBB的沉默导致减少亲增殖标记Ki67的比较对照siRNA（ 图2D）的。促凋亡标记物的活化裂解的caspase-3 UBB沉默之后才观察到，这表明HER2和PIK3CA的该耗尽不导致细胞凋亡，但均抑制细胞生长的，而非细胞毒性的。的确，HER2和PIK3CA的沉默也导致增加相比，控制转球体的细胞周期阻滞的蛋白的p27蛋白的表达。 ENT“FO：保持-together.within页=”1“>总之，这些结果表明BT474细胞由致癌HER2和PIK3CA当作为三维球状体生长信令从动更重要的是，这些结果表明，这是可能的。设计和实施数百个基因在癌细胞系球体稳健和可重复的定制的siRNA筛选库。 图1：3维生长细胞系优化。 答乳腺癌细胞系，MCF10DCIS.com和BT474均低装接板培养7天。使用倒置显微镜拍摄明代表性图像。比例尺= 100微米。 B. MCF10DCIS.com和BT474球状体28天培养。 4天 – 新鲜培养基100μL的每3补充。球状体固定在3.8％的甲醛，Embedded，切片，用苏木精和伊红（H＆E）染色。代表图像在低和高放大倍数示出。比例尺分别代表100微米和33微米。 C. MDA-MB-231球状体21天培养。 4天 – 新鲜培养基100μL的每3补充。球状体被固定在3.8％的甲醛，包埋，切片，并与Ki67染色和裂解的caspase-3。代表图像被示出。比例尺= 100微米。 D. BT474，MCF10DCIS.com，MDA-MB-231，和JIMT1细胞系反向故作（仅转染试剂）和对照siRNA和UBB转染，超低附着板然后纺成球状体。天1和4 7天后，加入新鲜培养基（100微升），细胞存活率进行定量。数据代表平均值±一式三份标准化控制＃1中执行两个独立的生物学重复的标准差。统计显着性使用UNPA计算IRED学生t检验（P <0.05）。 E.的流程图总结了用于在功能上审问癌症细胞系的基因球体的依赖反向转协议。 请点击此处查看该图的放大版本。 图2：BT474 球体揭示致癌依赖的功能基因组研究。 A. BT474细胞与反一式三份200人的基因的siRNA siGENOME转库。观察球体的大小和生存能力。原始数据值分别为板中位数标准化和z值分别计算以确定显著离群大于1.7倍大于该板中位数15的标准偏差。注意边远基因ERBB2，SF3B1，PLK1和UBB一ND E-cad的。 siRNA来显著增加或减少球体面积和生存能力都在阴影蓝色和红色，其中红色描绘了对照siRNA的。 B.细胞反向与非靶向对照，E-钙粘蛋白（E-CAD），PIK3CA，ERBB2或UBB siRNA转，然后在超低附着板纺成球状体。 7天之后，明代表球体图像使用倒置显微镜拍摄。比例尺= 100微米。 C.细胞反向与非靶向对照，PIK3CA，ERBB2或UBB siRNA转，然后在超低附着板纺成球状体。 7天之后，细胞生存力进行定量。数据代表平均值±一式三份标准化控制＃1中执行两个独立的生物学重复的标准差。统计显着性使用非配对学生t检验（P <0.05）来计算。 D. 7天后，球状体固定，包埋，切片，染色为H＆E，Ki67的，裂解的caspase-3和p27。代表图像被示出。比例尺= 100微米。注意siControl球体的H＆E由于选择了染色加工和个人完整的球体的假象显得更小。然而，这并没有从扫描图像和细胞活力结果观察到的变化得出。 请点击此处查看该图的放大版本。 1 2 3 4 五 6 7 8 9 10 11 12 非定向1 TP53 DST KMT2C 未处理1 FCGBP ARID1B FBXM7 TTC40 非瞄准2 GATA3 TTN MUC12 MUC4 AHNAK HUWEI1 DNAH11 ITPR2 ABCA13 CREBBP MAP2K4 PIK3CA F5 载脂蛋白B ANKRD30A MUC17 DNAH17 LAMA2 高手 CSMD2 STARD9 USH2A FAT3 LPR2 CSMD3 MYO18B DNAH5 MDN1 ARHGAP5 DNAH9 CXCR3 MUC16 RB1 PKHD1L1 DNAH2 SYNE2 DYNC1H1 PCLO CACNA1B ERBB2 PLK1 SYNE1 LYST PTEN SPTA1 未处理2 VHL RYR1 COL6A3 UBB 1 2 3 4 五 6 7 8 9 10 11 12 非定向1 ENAM RYR2 BRCA2 未处理1 FMN2 HECW1 LAMB4 SI 非瞄准2 FHOD3 MACF1 RYR3 C2ORF16 DMD FRG1 HERC2 MYH11 STAB1 ZDBF2 GOLGA6L2 鼻 SMG1 CACNA1E DNA14 GCC2 HIVEP2 NIPBL TANC1 ZNF536 HMCN1 NF1 UBR5 CACNA1F DYNC2H1 GON4L HYDIN PKD1L1 TF ANK3 HRNR OBSCN USP34 CYMA5 FAM208B GPR112 ITSN2 RNF213 TPR ASPM </tD> PLK1 PCDH15 XIRP2 COL7A1 FLG2 未处理2 VHL SAGE1 UNC80 UBB 1 2 3 4 五 6 7 8 9 10 11 12 非定向1 DCHS2 MUC5B ZFHX4 未处理1 MYO9A SPHKAP CXORF22 NCOR1 VPS13D <tD> ATR DMXL2 MXRA5 ANK2 KIAA1210 PRUNE2 TCHH DANH6 NOTCH2 ANKRD12 BIRC6 DNAH10 TENM1 自动取款机 LRP1 SCN10A VPS13C DNAH7 SPEN C5ORF42 CDH1 DNAH3 PEG3 DIDO1 MAP1A SCN2A IPTR3 ERBB3 SRRM2 CCDC88A CUBN NOCK11 RELN DNAH8 MED12 SHROOM2 CEP350 FAT4 SZT2 CHD4 PLK1 余仁生 SACS KIAA1109 MED13 未处理2 <tD> VHL KMT2A VPS13A UBB 1 2 3 4 五 6 7 8 9 10 11 12 非定向 QSER1 ARID1A WDFY3 未处理1 SDK1 TEX15 LAMA1 非瞄准2 COL14A1 SHROOM3 ATRX EFCAB5 SF3B1 CBFB AHNAK2 </tD> CSMD1 TBX3 KIAA0947 FOXA1 ITPR1 DDX3X KIF4A MEFV UBR4 MYCBP2 INPPL1 FLG HECTD4 FAT2 MGAM VCAN NBEAL1 MAP3K1 AKAP9 GPR98 FOXO3 PLK1 ZNF462 SETX NRP1 HERC1 未处理2 VHL UBB </tD> 表1：平板布局和人类的siRNA库去卷积。表中包含的每个所述siRNA池和布局在屏幕中使用的低附着板的内容。