Изучение белка качества системы управления<em> D. discoideum</em> Использование Терморегулируемая живых изображений сотовый
Summary
The social amoebae Dictyostelium discoideum has recently been established as a system to study protein misfolding and proteostasis. Here, we describe a new imaging-based methodology to study temperature-induced protein aggregation and the cellular stress response in D. discoideum.
Abstract
The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we showed that D. discoideum is remarkably resilient to protein aggregation and can be used to gain insights into the cellular protein quality control system. However, the use of D. discoideum as a model system poses several challenges to microscopy-based experimental approaches, such as the high motility of the cells and their susceptibility to photo-toxicity. The latter proves to be especially challenging when studying protein homeostasis, as the phototoxic effects can induce a cellular stress response and thus alter to behavior of the protein quality control system.
Temperature increase is a commonly used way to induce cellular stress. Here, we describe a temperature-controllable imaging protocol, which allows observing temperature-induced perturbations in D. discoideum. Moreover, when applied at normal growth temperature, this imaging protocol can also noticeably reduce photo-toxicity, thus allowing imaging with higher intensities. This can be particularly useful when imaging proteins with very low expression levels. Moreover, the high mobility of the cells often requires the acquisition of multiple fields of view to follow individual cells, and the number of fields needs to be balanced against the desired time interval and exposure time.
Introduction
Dictyostelium discoideum являются одиночными почва живой амебы , которые питаются бактериями и другими микроорганизмами, которые захватываются фагоцитоза. Он имеет уникальный и замечательный жизненный цикл , который был одним из главных направлений исследований с момента его открытия 1. Ранний интерес к многоклеточного развития 2 и молекулярных основ хемотаксиса 3 вскоре была дополнена исследованиями с акцентом на подвижность клеток, клеточной полярности, врожденного иммунитета. Кроме того, Д. discoideum был введен в качестве модельной системы для биомедицинских исследований 4,5.
Недавно мы установили D. discoideum как новая система для изучения контроля качества белка (PQC) системы 6,7. Его протеом обогащен агрегации подверженных прионными-подобных белков, что создает проблему для контроля качества 8 белков. Для того, чтобы исследовать вопрос о том D. discoideum разработала специальные молекулярные механизмы для контроля его высоко AGкупности подверженных протеом, мы изучили поведение агрегации подверженных маркерных белков как при нормальных условиях роста и во время стресса. Стрессовые условия, такие как тепловой стресс, можно использовать для увеличения скорости белка неправильного сворачивания 9. Таким образом, мы стремились создать систему, где мы могли бы привести к изменениям температуры и одновременно следить за поведением белков-маркеров. Для этой цели мы объединили живых клеток с Пельтье-контролируемым нагревом с использованием стадии вставки теплового (камеру охлаждения). Этот метод позволил нам поддерживать постоянную и равномерную температуру, а также, чтобы вызвать быстрое, но точное изменение температуры.
Живых клеток используется для изучения различных биологических процессов в D. discoideum. Тем не менее, этот подход сталкивается с двумя основными ограничениями. Во-первых, клетки демонстрируют высокую подвижность и имеют тенденцию мигрировать из поля зрения, таким образом, отслеживание отдельных клеток часто требует получения изображения на большой площади. Подвижность клеток можетбыть уменьшена агара 10, однако, эти условия не подходят для длительного обработки изображений из – за снижения жизнеспособности. Во- вторых, D. discoideum клетки показывают особенно высокую чувствительность к фото-токсичность, что приводит к клеточной закруглением и митоза 11. Предыдущие протоколы рассмотрел этот вопрос путем добавления аскорбата в качестве поглотителя радикалов и сокращение времени воздействия 12. Последнее может иметь решающее значение, если интересующий белок экспрессируется на низких уровнях, и показывает слабый сигнал флуоресценции. Кроме того, авторы предполагают , чтобы обеспечить постоянную температуру 21 ° С либо визуализации в кондиционируемом помещении или с помощью контролируемой температурой инкубации коробки, которые покрывают объективный и микроскопа этап 12.
Здесь мы опишем метод с улучшенным контролем температуры с помощью охлаждающей камеры, установленный при температуре 23 ° C. Во время визуализации нашего настройку значительно повышает устойчивость к фото-токсичности. Этопозволяет использовать более высокие времени экспозиции и высокой интенсивности света возбуждения. Это имеет особое значение при покадровой обработки изображений, так как временные интервалы должны быть тщательно сбалансированы с числом позиций и отображенных Время экспозиции. Возможность увеличения числа отображенных позиций также позволяет охвата более широкой области обработки изображений и облегчает отслеживание отдельных клеток в течение более длительного периода времени.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол, описанный здесь, может быть использован для изучения поведения конкретного интересующего белка в ответ на тепло индуцированной стрессом. Повышение температуры до 30 ° C, как сообщается , чтобы вызвать реакцию теплового стресса и в этих условиях жизнеспособность D. discoideum заметно снижается.
изменения
Протокол может быть изменен, чтобы сравнить поведение различных белков при тех же самых условиях стресса. Для этого, клетки, экспрессирующие различные белки с той же флуоресцентной метки передаются в многолуночных блюда, такие как четыре камерных блюда (раздел 1.3.1). Протокол также может быть применен на клетках коэкспрессирующей белки с различными маркерами, такими как GFP или RFP. Это может быть, например, использоваться для наблюдения за поведением различных компонентов системы контроля качества белка (PQC). Клетки, экспрессирующие GFP-меченый агрегации маркер и различные RFP меченных компоненты PCQ можно наблюдать с помощью многоскважинныхвогнутое для работы с изображениями. Это обеспечивает те же стрессовые условия (скорость повышения температуры / снижения, длительности температурного увеличения / уменьшения) и позволяет для сравнительных исследований.
Кроме того, протокол может быть использован для изучения влияния системы PQC на реакцию теплового стресса. Активность компонентов можно модулировать путем изменения уровней экспрессии с использованием генетических инструментов , таких как нокаута или избыточной экспрессии или с использованием коммерчески доступных специфических ингибиторов 6. Протеасома может быть подавлено добавлением MG132 (100 мкМ) или lactacystin (10 мкМ) в ростовую среду. Шаперона Hsp90, может быть подавлено с помощью гельданамицина (6 мкМ) или Радикикол (10 мкМ). Шаперонная Hsp70 может быть подавлена с Ver-155088, хотя мы не смогли подтвердить эффективность торможения в наших экспериментальных условиях до сих пор. Ингибиторы должны быть добавлены за один день до обработки изображений, и клетки инкубируют в течение 14 ч.
Criti ческие шаги в рамках Протокола
Важным шагом для оценки теплового индуцированного возмущения состояние клеток перед экспериментом визуализации. Исследования в дрожжах показали , что клетки приобретают устойчивость к различным экологическим стрессам во время стационарной фазы 13. Мы также наблюдали минимальную чувствительность к применяемой тепловой стресс , если D. discoideum клетки достигли стационарной фазы до визуализации. Таким образом, поддержание постоянного числа клеток <5 × 10 5 клеток / мл имеет решающее значение.
Кроме того, большое число клеток может вызвать переход от вегетативного цикла D. discoideum в цикле развития, тем самым вызывая голодание пути, которые могут привести к различным ответ на тепловой стресс. Если высокие количества клеток достигаются в фазе восстановления после теплового стресса, потоковой передачи и агрегирование клетки могут помешать анализу данных , как клетки перемещаются в фокусе (смотри рисунок 4).
Содержание "> Ограничение техникиПотеря фокуса является узким местом протокола. Во время изменения температуры, фокальная плоскость может смещаться резко, что требует ручного переориентацию в период времени сразу после изменения температуры. Скачок в фокусе иногда может быть слишком экстремальным, чтобы быть преодолены с помощью программного обеспечения автоматической фокусировки, особенно, если время между моментами времени высока. Тем не менее, если используется микроскоп оснащен аппаратной автоматической фокусировки, это узкое место может быть обойдена.
Значимость техники в отношении существующих методов
По сравнению с существующими установками, такими как использование номеров с кондиционерами, с регулируемой температурой инкубации коробки, охватывающих цели и столик микроскопа или с регулируемой температурой этапы и объективных воротники, использование охлаждающей камеры обеспечивает более точный контроль температуры окружающей среды температура. Пельтье-элемент в холодильной камере может поддерживать постоянную и равномерную ПЭМпературе на протяжении экспериментальной установки. В классических установках, местные перепады температур могут привести к различным результатам наблюдений. Кроме того, он может быстро и оперативно реагировать на индуцированные изменения температуры, в то время как классические расстановок адаптируются очень медленно к наведенных изменениям температуры, особенно понижение температуры. Пельтье элементом в холодильной камере также может охватывать более широкий диапазон рабочих температур (15-40 ° C), чем классических установок, с помощью которого достигают температуры, такие как 15 ° C или 40 ° C очень трудно.
Dictyostelium discoideum особенно чувствителен к фото-токсичности. Предыдущие исследования использовали аскорбат в качестве поглотителя для снижения фото-токсичности. Тем не менее, длительные периоды обработки изображений требуют дополнительной добавки. Кроме того, использование аскорбата ограничивается исследованиями, где механизм интерес не зависит от антиоксидантной добавки. Мы полагаем, что с регулируемой температурой формирования изображения может быть использован в качестве альтернативного провертренере, чтобы свести к минимуму фото-токсичность и могут быть объединены с добавлением аскорбиновой кислоты для дальнейшего снижения токсичности.
Фототоксический эффекты могут быть сведены к минимуму путем обеспечения постоянной и равномерной температуре 23 ° С с использованием охлаждающей камеры. Клетки визуализируют с помощью контроля температуры показывают меньше признаков фотостарения токсичности, такой клетки закругления, в течение более длительного периода времени. Это также дает возможность получить изображение с более высокой интенсивности, меньших временных интервалов или более полей зрения (ПЗ).
Общее применение
Тепловое воздействие при более высоких температурах , как было показано , чтобы вызвать разные тепловой стресс реакции 14. Таким образом, повышение температуры до 34 ° С или 37 ° С может побудить другой ответ. В дополнение к приложенному температурного стресса, длительность конкретной ситуации стресса, может быть изменен, чтобы изучить немедленного ответа или долгосрочной адаптации к тепловому стрессу.
В общем, описанный протокол может бытьрасширен до широкого набора приложений. Поскольку точный контроль температуры значительно уменьшает фотографического токсический эффект, протокол может быть использован в установках, требующих высокого уровней экспозиции и / или более высокую интенсивность света возбуждения, например, для визуализации белков с низким уровнем экспрессии, или в сочетании с короткими интервалами времени между изображениями, например, во время съемки в заданный промежуток времени. Он также может быть полезным для получения изображений объектов , охватывающих всю ячейку, например, микротрубочки, так как эти параметры требуют большого количества оптических Z-секции.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no Acknowledgements.
Materials
| AX Medium | ForMedium | AXM0102 | |
| LoFlo medium | ForMedium | LF1001 | |
| MG132 | Sigma | C2211 | |
| Lactacystin | Sigma | L6785 | |
| Geldanamycin | Santa Cruz | sc-200617 | |
| Radicicol | Santa Cruz | sc-200620 | |
| MatTek disch 35 mm | MatTek corporation | P35G-1.5-14-C | glass bottom imaging dish |
| CellViell cell culture dish | Greiner | 627870 | 4-compartments glass bottom imaging dish |
| Thermal Stage Heater/Cooler Insert | Warner Istruments | TB-3/CCD | |
| Bipolar temperature controller | Warner Istruments | CL-100 | |
| Liquid cooling System | Warner Instruments | LCS-1 |
Riferimenti
- Bonner, J. T. Evidence for the Formation of Cell Aggregates by Chemotaxis in the Development of the Slime Mold Dictyostelium Discoideum. Journal of Experimental Zoology. 106 (1), 1-26 (1947).
- Loomis, W. F. Cell signaling during development of Dictyostelium. Biologia dello sviluppo. 391 (1), 1-16 (2014).
- Nichols, J. M. E., Veltman, D., Kay, R. R. Chemotaxis of a model organism: progress with Dictyostelium. Current Opinion in Cell Biology. 36, 7-12 (2015).
- Williams, J. G. Dictyostelium finds new roles to model. Genetica. 185 (3), 717-726 (2010).
- Müller-Taubenberger, A., Kortholt, A., Eichinger, L. Simple system – substantial share: The use of Dictyostelium in cell biology and molecular medicine. European Journal of Cell Biology. 92 (2), 45-53 (2013).
- Malinovska, L., Palm, S., Gibson, K., Verbavatz, J. M., Alberti, S. Dictyostelium discoideum has a highly Q/N-rich proteome and shows an unusual resilience to protein aggregation. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (20), E2620-E2629 (2015).
- Malinovska, L., Alberti, S. Protein misfolding in Dictyostelium: Using a freak of nature to gain insight into a universal problem. Prion. 9 (5), 339-346 (2015).
- Schneider, K., Bertolotti, A. Surviving protein quality control catastrophes – from cells to organisms. Journal of Cell Science. 128 (21), 3861-3869 (2015).
- Dobson, C. M. Protein folding and misfolding. Nature. 426 (6968), 884-890 (2003).
- Fukui, Y., Yumura, S., Yumura, T. K. Agar-overlay immunofluorescence: high-resolution studies of cytoskeletal components and their changes during chemotaxis. Methods in cell biology. 28, 347-356 (1987).
- Graf, R., Rietdorf, J., Zimmermann, T. Live cell spinning disk microscopy. Microscopy Techniques. 95, 57-75 (2005).
- Samereier, M., Meyer, I., Koonce, M. P., Graef, R. Live Cell-Imaging Techniques for Analyses of Microtubules in Dictyostelium. Methods in cell biology. 97, 341-357 (2010).
- Herman, P. K. Stationary phase in yeast. Current opinion in microbiology. 5 (6), 602-607 (2002).
- Loomis, W. F., Wheeler, S., Wheeler, S. Heat shock response of Dictyostelium. Biologia dello sviluppo. 79 (2), 399-408 (1980).
