Die Untersuchung der Proteinqualitätskontrolle System der<em> D. discoideum</em> Verwendung von Temperaturgesteuerte Live Cell Imaging
Summary
The social amoebae Dictyostelium discoideum has recently been established as a system to study protein misfolding and proteostasis. Here, we describe a new imaging-based methodology to study temperature-induced protein aggregation and the cellular stress response in D. discoideum.
Abstract
The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we showed that D. discoideum is remarkably resilient to protein aggregation and can be used to gain insights into the cellular protein quality control system. However, the use of D. discoideum as a model system poses several challenges to microscopy-based experimental approaches, such as the high motility of the cells and their susceptibility to photo-toxicity. The latter proves to be especially challenging when studying protein homeostasis, as the phototoxic effects can induce a cellular stress response and thus alter to behavior of the protein quality control system.
Temperature increase is a commonly used way to induce cellular stress. Here, we describe a temperature-controllable imaging protocol, which allows observing temperature-induced perturbations in D. discoideum. Moreover, when applied at normal growth temperature, this imaging protocol can also noticeably reduce photo-toxicity, thus allowing imaging with higher intensities. This can be particularly useful when imaging proteins with very low expression levels. Moreover, the high mobility of the cells often requires the acquisition of multiple fields of view to follow individual cells, and the number of fields needs to be balanced against the desired time interval and exposure time.
Introduction
Dictyostelium discoideum sind Einzelgänger Boden lebenden Amöben , die auf Bakterien und anderen Mikroorganismen ernähren, die durch Phagozytose aufgenommen werden. Es hat eine einzigartige und bemerkenswerte Lebenszyklus , die einen großen Bereich der Forschung seit seiner Entdeckung 1 gewesen ist. Das frühe Interesse an der vielzelligen Entwicklung 2 und die molekularen Grundlagen der Chemotaxis 3 wurde bald durch Studien ergänzt mit Schwerpunkt auf der Zellbeweglichkeit, Zellpolarität, angeborene Immunität. Zusätzlich D. discoideum wurde als Modellsystem für die biomedizinische Forschung 4,5 eingeführt.
Vor kurzem haben wir D. discoideum als ein neues System , das Protein Qualitätskontrolle (PQC) System 6,7 zu studieren. Seine Proteom ist in aggregationsanfälligen Prion-ähnliche Proteine angereichert, die 8 eine Herausforderung für die Proteinqualitätskontrolle darstellt. Um zu untersuchen , ob D. discoideum hat spezielle molekulare Mechanismen entwickelt , seine zur Steuerung hoch aggregation anfällige Proteom, untersuchten wir das Verhalten der Aggregation neigende Proteine Marker sowohl unter normalen Wachstumsbedingungen und bei Stress. Stressbedingungen, wie Wärmebeanspruchung kann die Rate der Protein misfolding 9 zu erhöhen verwendet werden. Deshalb haben wir versucht, ein System, wo wir Temperaturänderungen auslösen können und gleichzeitig das Verhalten von Markerproteinen folgen. Zu diesem Zweck kombiniert, wir Abbildung lebender Zellen mit Peltier-gesteuerte Erwärmung eine thermische Stufe Einsatz (Kühlkammer) verwendet wird. Diese Methode erlaubt uns eine konstante und gleichmäßige Temperatur sowie zur Aufrechterhaltung einer schnellen, aber dennoch präzise Temperaturänderung zu induzieren.
Bildgebung lebender Zellen verwendet , um eine Vielzahl von biologischen Prozessen in D. zu studieren discoideum. Allerdings steht dieser Ansatz zwei wichtige Einschränkungen. Zunächst werden die Zellen, die eine hohe Beweglichkeit anzuzeigen und neigen aus dem Sichtfeld zu wandern, wodurch einzelne Zellen verfolgen, erfordert oft Bildgebung einer großen Fläche. Die Mobilitätszelle kannvon Agar – Overlay 10 jedoch verringert werden, sind diese Bedingungen für langfristige Bildgebung aufgrund einer Abnahme der Lebensfähigkeit nicht geeignet. Zweitens D. discoideum Zellen zeigen eine besonders hohe Empfindlichkeit gegenüber Phototoxizität, die 11 in Zellabrundung und mitotischen Arrest führt. Vorherige Protokolle adressiert dieses Problem durch Zugabe von Ascorbat als Radikalfänger und Reduzierung der Belichtungszeiten 12. Letzteres kann kritisch sein, wenn das Protein von Interesse auf einem niedrigen Niveau exprimiert wird, und zeigt ein schwaches Fluoreszenzsignal. Die Autoren schlagen auch vor, entweder durch Abbilden in einem klimatisierten Raum oder durch Verwendung von temperaturgesteuerte Inkubation Kästen, um eine konstante Temperatur von 21 ° C zu schaffen , die das Ziel und den Mikroskoptisch 12 abzudecken.
Hier beschreiben wir ein Verfahren mit verbesserter Temperatursteuerung durch eine Kühlkammer unter Verwendung von auf 23 ° C eingestellt. Während der Abbildung unserer Set-up eine deutliche Steigerung der Beständigkeit gegen Phototoxizität. Eserlaubt die Verwendung von höheren Belichtungszeiten und höhere Anregungslichtintensitäten. Dies ist von besonderer Bedeutung während des Zeitraffer-Bildgebung, da die Zeitintervalle sorgfältig ausgewogen gegen die Anzahl der Positionen abgebildet werden müssen und der Belichtungszeit verwendet. Die Möglichkeit, die Anzahl der abgebildeten Positionen zu erhöhen, ermöglicht auch die Abdeckung eines breiten Abbildungsbereich und erleichtert die Verfolgung einzelner Zellen über einen längeren Zeitraum.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das hier beschriebene Protokoll kann das Verhalten eines bestimmten Proteins von Interesse in Reaktion auf die wärmeinduzierten Belastungen Studie verwendet werden. Temperaturerhöhung auf 30 ° C wurde berichtet Wärmebelastungsantwort auszulösen , und unter diesen Bedingungen die Lebensfähigkeit von D. discoideum ist deutlich reduziert.
Änderungen
Das Protokoll kann modifiziert werden, um das Verhalten verschiedener Proteine unter den gleichen Belastungsbedingungen zu vergleichen. Dazu verschiedene Proteine mit dem gleichen Fluoreszenzmarker exprimierenden Zellen werden in Multi-Well-Platten transferiert, wie vier Kammerschalen (Abschnitt 1.3.1). Das Protokoll kann auch auf Zellen co-exprimierenden Proteine mit verschiedenen Markern, wie GFP oder RFP angewendet werden. Dies kann beispielsweise verwendet, um das Verhalten verschiedener Komponenten der Proteinqualitätskontrolle (PQC) System überwachen. Zellen, die GFP-markierten Aggregation Marker und andere RFP-markierte PCQ Komponenten exprimieren, können unter Verwendung von Multi-Well beobachtet werdenKlöpper für die Bildgebung. Dies gewährleistet den gleichen Belastungsbedingungen (Geschwindigkeit der Temperaturzunahme / abnahme, der Dauer der Temperaturerhöhung / Verringerung) und ermöglicht eine vergleichende Studien.
Darüber hinaus kann das Protokoll verwendet werden, um den Einfluss des PQC System auf der Wärmebelastungsantwort zu untersuchen. Die Aktivität der Komponenten kann durch Ändern Expressionsniveaus unter Verwendung von genetischen Werkzeugen wie knock-out oder Überexpression oder durch Verwendung von handelsüblichen spezifische Inhibitoren 6 moduliert werden. Das Proteasom kann durch Zugabe von MG132 (100 uM) oder Lactacystin (10 uM) zu dem Wachstumsmedium inhibiert werden. Das Chaperon Hsp90 kann verhindert werden, indem Geldanamycin (6 uM) oder Radicicol (10 & mgr; M). Das Chaperon Hsp70 kann mit VER-155088 gehemmt werden, obwohl wir nicht die Wirksamkeit der Hemmung in unserer experimentellen Einstellungen bestätigen konnten bisher. Inhibitoren sollten 14 Stunden einen Tag vor der Bildgebung und die Zellen werden inkubiert werden.
Criti cal Schritte im Rahmen des Protokolls
Der entscheidende Schritt für die Beurteilung der wärmeinduzierte Störung ist der Zustand der Zellen vor dem Bildgebungsexperiment. Studien in Hefe zeigten , dass Zellen Resistenz gegen eine Vielzahl von Umwelteinflüssen während der stationären Phase 13 erwerben. Wir beobachteten auch minimale Reaktion auf angelegte Wärme Stress , wenn D. discoideum Zellen hatten stationäre Phase erreicht vor der Bildgebung. Um daher eine konstante Zellzahl aufrechterhalten <5 x 10 5 Zellen / ml ist kritisch.
Darüber hinaus können hohe Zellzahlen Übergang vom vegetativen Zyklus von D. induzieren discoideum auf den Entwicklungszyklus, so auslösenden Verhungern Wege, die zu einer anderen Antwort führen könnte Stress zu erwärmen. Bei hohen Zellzahlen in der Erholungsphase nach der Hitzebelastung erreicht werden, Streaming und Aggregation – Zellen können mit der Datenanalyse stören , da die Zellen aus dem Fokus zu bewegen (siehe Abbildung 4).
Inhalt "> Einschränkung der TechnikDer Verlust des Fokus ist der Engpass des Protokolls. Bei Temperaturänderungen kann die Brennebene drastisch Verschiebung, die in einer Zeitperiode manuelle Refokussierung erfordert unmittelbar nach der Änderung der Temperatur. Der Sprung in der Fokus kann manchmal zu extrem sein durch Software Autofokus zu überwinden, insbesondere, wenn die Zeit zwischen den Zeitpunkten hoch ist. Wenn jedoch das verwendete Mikroskop mit einem Hardware-Autofokus ausgestattet ist, kann dieser Engpass umgangen werden.
Bedeutung der Technik in Bezug auf bestehende Methoden
Im Vergleich zu bestehenden Aufbauten wie beispielsweise die Verwendung von klimatisierten Räumen, temperaturgesteuerte Inkubation Kästen in denen die Ziele und die Mikroskoptisch oder temperaturgesteuerten Bühnen und objektive Krägen stellt die Verwendung einer Kühlkammer, die eine genauere Steuerung der Umgebungs Temperatur. Das Peltier-Element in der Kühlkammer kann eine konstante und gleichmäßige tem aufrechtzuerhaltenperatur während des gesamten Versuchsaufbau. In der klassischen Setups können lokale Temperaturunterschiede zu unterschiedlichen Beobachtungs Ergebnissen führen. Darüber hinaus kann es schnell und rasch auf induzierte Änderungen in der Temperatur reagieren, während klassische Setups sehr langsam induzierte Temperaturänderungen anzupassen, insbesondere um die Temperatur zu senken. Das Peltier-Element in der Kühlkammer kann auch einen breiteren Temperaturbereich (15-40 ° C) als die klassischen Konfigurationen umfassen, mit dem Erreichen Temperaturen, wie 15 ° C oder 40 ° C ist sehr schwierig.
Dictyostelium discoideum ist besonders empfindlich gegenüber Phototoxizität. Frühere Studien Ascorbat als Fänger verwendet Phototoxizität zu reduzieren. Jedoch erfordern lange Bildgebungszeiten zusätzliche Ergänzung. Außerdem wird die Verwendung von Ascorbat auf Studien beschränkt, in dem der Mechanismus von Interesse nicht durch die Antioxidansergänzung beeinflusst wird. Wir schlagen vor, dass temperaturgesteuerte Bildgebung kann alternativ ca. verwendet werdenoach Phototoxizität zu minimieren und könnte unter Zugabe von Ascorbat kombiniert werden, um die Toxizität zu verringern.
Phototoxische Effekte können durch die Bereitstellung einer konstanten und gleichförmigen Temperatur von 23 ° C unter Verwendung einer Kühlkammer minimiert werden. Die Zellen mit Temperaturkontrolle abgebildet zeigen weniger Anzeichen von Phototoxizität, wie Zellabrundung, für einen längeren Zeitraum. Dies ermöglicht auch Bildgebung mit höheren Intensitäten, kleinere Zeitintervalle oder mehr Sichtfelder (FOVs).
Allgemeine Anwendung
Hitzestress bei höheren Temperaturen wurde eine unterschiedliche Wärmestressantwort 14 auszulösen gezeigt. Daher könnte eine andere Antwort induzieren, die Temperatur auf 34 ° C oder 37 ° C erhöht. Neben der Temperaturbelastung angelegt wird, kann die Dauer eines bestimmten Belastungssituation modifiziert werden, um die unmittelbare Reaktion oder langfristige Anpassung an Stress studieren zu beheizen.
In der Regel kann das beschriebene Protokoll seinauf ein breites Spektrum von Anwendungen erweitert. Da die präzise Temperaturregelung erheblich phototoxische Effekte reduziert, kann das Protokoll in den Einstellungen verwendet werden , die eine hohe Belichtungszeiten erfordern und / oder höhere Anregungslichtintensitäten, beispielsweise für Proteine mit einem niedrigen Expressionsniveau zu visualisieren, oder in Kombination mit kurzen Zeitintervallen zwischen Bildgebung, zum Beispiel während Zeitraffer-Bildgebung. Es kann auch für die Abbildung der gesamten Zelle, zB Mikrotubuli, da diese Einstellungen erfordern eine hohe Anzahl von optischen z-Abschnitte Spanning Objekte vorteilhaft sein.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no Acknowledgements.
Materials
| AX Medium | ForMedium | AXM0102 | |
| LoFlo medium | ForMedium | LF1001 | |
| MG132 | Sigma | C2211 | |
| Lactacystin | Sigma | L6785 | |
| Geldanamycin | Santa Cruz | sc-200617 | |
| Radicicol | Santa Cruz | sc-200620 | |
| MatTek disch 35 mm | MatTek corporation | P35G-1.5-14-C | glass bottom imaging dish |
| CellViell cell culture dish | Greiner | 627870 | 4-compartments glass bottom imaging dish |
| Thermal Stage Heater/Cooler Insert | Warner Istruments | TB-3/CCD | |
| Bipolar temperature controller | Warner Istruments | CL-100 | |
| Liquid cooling System | Warner Instruments | LCS-1 |
Riferimenti
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