دراسة نظام لمراقبة الجودة من البروتين<em> D. discoideum</em> عن طريق درجة الحرارة التي تسيطر التصوير الخلية الحية
Summary
The social amoebae Dictyostelium discoideum has recently been established as a system to study protein misfolding and proteostasis. Here, we describe a new imaging-based methodology to study temperature-induced protein aggregation and the cellular stress response in D. discoideum.
Abstract
The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we showed that D. discoideum is remarkably resilient to protein aggregation and can be used to gain insights into the cellular protein quality control system. However, the use of D. discoideum as a model system poses several challenges to microscopy-based experimental approaches, such as the high motility of the cells and their susceptibility to photo-toxicity. The latter proves to be especially challenging when studying protein homeostasis, as the phototoxic effects can induce a cellular stress response and thus alter to behavior of the protein quality control system.
Temperature increase is a commonly used way to induce cellular stress. Here, we describe a temperature-controllable imaging protocol, which allows observing temperature-induced perturbations in D. discoideum. Moreover, when applied at normal growth temperature, this imaging protocol can also noticeably reduce photo-toxicity, thus allowing imaging with higher intensities. This can be particularly useful when imaging proteins with very low expression levels. Moreover, the high mobility of the cells often requires the acquisition of multiple fields of view to follow individual cells, and the number of fields needs to be balanced against the desired time interval and exposure time.
Introduction
Dictyostelium discoideum هم الانفرادي الاميبات المعيشة التربة التي تتغذى على البكتيريا والكائنات الدقيقة الأخرى، والتي يتم تناولها عن طريق البلعمة. لها دورة حياة فريدة ورائعة التي كانت مجالا رئيسيا للبحث منذ اكتشافه 1. الفائدة الأولى في التنمية متعددة الخلايا 2 و الأساس الجزيئي الكيميائي 3 استكمل قريبا من الدراسات التي تركز على الحركة الخلية القطبية خلية، مناعة فطرية. وبالإضافة إلى ذلك، D. وقدم discoideum كنظام نموذج ل4،5 البحوث الطبية الحيوية.
في الآونة الأخيرة، أنشأنا د. discoideum كنظام جديد لدراسة نظام مراقبة الجودة 6،7 بروتين (PQC). وأثرى بروتيوم في مثل بريون البروتينات المعرضة للتجميع، الأمر الذي يشكل تحديا للبروتين مراقبة الجودة 8. للتحقيق في ما إذا كان د. وقد وضعت discoideum الآليات الجزيئية خاصة للسيطرة على درجة عالية AGالمعرضة للgregation بروتيوم، درسنا سلوك البروتينات علامة المعرضة للتجميع على حد سواء في ظل ظروف النمو الطبيعي وأثناء الإجهاد. ظروف الإجهاد، مثل الإجهاد الحراري، ويمكن استخدامها لزيادة نسبة البروتين misfolding 9. ولذلك، فإننا سعى نظام حيث أننا يمكن أن تحفز التغيرات في درجات الحرارة في وقت واحد اتباع سلوك البروتينات علامة. لهذا الغرض، ونحن الجمع بين التصوير الخلية الحية مع التدفئة تسيطر بلتيير-استخدام (غرفة التبريد) مرحلة الحراري إدراج. يسمح هذا الأسلوب لنا للحفاظ على درجة حرارة ثابتة وموحدة، وكذلك للحث على التغير في درجة الحرارة السريع، وبعد دقيقة و.
يستخدم التصوير الخلية الحية لدراسة مجموعة متنوعة من العمليات البيولوجية في د. discoideum. ومع ذلك، يواجه هذا النهج اثنين من القيود الرئيسية. أولا، تعرض الخلايا لحركية عالية وتميل إلى الهجرة خارج مجال الرؤية، وبالتالي تتبع الخلايا الفردية غالبا ما يتطلب التصوير في منطقة واسعة. تنقل الخلية يمكنيمكن خفضها من خلال تراكب آجار 10، ولكن هذه الظروف ليست مناسبة للتصوير على المدى الطويل بسبب انخفاض في قدرتها على البقاء. ثانيا، D. تظهر خلايا discoideum حساسية عالية بشكل خاص للصور سمية، مما يؤدي إلى التقريب الخلية واعتقال الإنقسامية 11. وتناولت البروتوكولات السابقة هذه المشكلة عن طريق إضافة أسكوربات على القضاء على الجذور والحد من التعرض مرة 12. هذا الأخير يمكن أن يكون حاسما إذا ما أعرب عن البروتين من الفائدة عند مستويات منخفضة ويظهر إشارة مضان ضعيفة. ويشير الكتاب أيضا إلى توفير درجة حرارة ثابتة من 21 درجة مئوية إما عن طريق التصوير في غرفة مكيفة الهواء أو باستخدام صناديق حضانة التحكم في درجة حرارته، والتي تغطي الهدف والمجهر المرحلة 12.
هنا، نحن تصف طريقة مع تحسين التحكم في درجة الحرارة باستخدام غرفة التبريد وضعت في 23 درجة مئوية. أثناء التصوير لدينا مجموعة المتابعة تعزز بشكل كبير من المقاومة إلى الصورة سمية. هذايسمح استخدام التعرض مرات أعلى وأعلى كثافة الضوء الإثارة. هذا الأمر أهمية خاصة خلال الوقت الفاصل بين التصوير، كما تحتاج إلى فترات زمنية لتكون متوازنة بعناية ضد عدد من مواقع تصوير ووقت التعرض المستخدمة. إمكانية زيادة أعداد مواقف تصوير أيضا يسمح للتغطية منطقة التصوير أوسع ويسهل تتبع الخلايا الفردية على مدى فترة أطول من الزمن.
Protocol
Representative Results
Discussion
بروتوكول الموصوفة هنا يمكن أن تستخدم لدراسة سلوك بروتين معين من الفائدة استجابة للإجهاد الناجم عن الحرارة. تم الإبلاغ عن زيادة درجة الحرارة إلى 30 درجة مئوية لتحريك استجابة الإجهاد الحراري وفي ظل هذه الظروف جدوى د. يتم تقليل discoideum بشكل ملحوظ.
التعديلات
بروتوكول يمكن تعديلها لمقارنة سلوك البروتينات المختلفة تحت ظروف الإجهاد نفسها. لهذا، يتم نقل الخلايا معربا عن بروتينات مختلفة مع نفس العلامة الفلورسنت في أطباق متعددة أيضا، مثل أربعة أطباق غرفة (القسم 1.3.1). ويمكن أيضا أن تطبق البروتوكول على خلايا المشترك، معربا عن البروتينات مع علامات مختلفة، مثل GFP أو طلب تقديم العروض. هذا يمكن أن يكون على سبيل المثال تستخدم لمراقبة سلوك مختلف مكونات نظام لمراقبة الجودة من البروتين (PQC). الخلايا معربا عن GFP الموسومة علامة التجميع ومختلف مكونات PCQ الموسومة طلب تقديم العروض ويمكن ملاحظة استخدام متعددة جيدازعته للتصوير. وهذا يضمن ظروف الإجهاد نفس (سرعة ارتفاع درجة الحرارة / نقصان، مدة درجة الحرارة زيادة / نقصان) ويسمح للدراسات المقارنة.
وعلاوة على ذلك، فإن بروتوكول يمكن استخدامها لدراسة تأثير النظام PQC على استجابة الإجهاد الحراري. نشاط المكونات يمكن التضمين عن طريق تغيير مستويات التعبير باستخدام أدوات الوراثية مثل الضربة القاضية، أو overexpression أو باستخدام مثبطات معينة المتاحة تجاريا 6. وproteasome ويمكن تثبيط بإضافة MG132 (100 ميكرومتر) أو lactacystin (10 ميكرومتر) إلى وسط النمو. كوصي Hsp90 يمكن تحول دون استخدام geldanamycin (6 ميكرومتر) أو radicicol (10 ميكرومتر). كوصي HSP70 يمكن تثبيط مع VER-155088، على الرغم من أننا لا يمكن تأكيد فعالية تثبيط في إعدادات التجريبية لدينا حتى الآن. يجب إضافة مثبطات يوم واحد قبل التصوير ويتم تحضين الخلايا لمدة 14 ساعة.
Criti خطوات كال في إطار بروتوكول
في خطوة حاسمة لتقييم الاضطراب الناجم عن الحرارة وحالة الخلايا السابقة للتجربة التصوير. وأظهرت دراسات في الخميرة أن الخلايا تكتسب مقاومة لمجموعة متنوعة من الضغوط البيئية خلال مرحلة ثابتة 13. نحن أيضا لاحظ الحد الأدنى من القدرة على الاستجابة للإجهاد الحراري المطبق إذا د. قد خلايا discoideum بلغت مرحلة ثابتة قبل التصوير. لذلك، والحفاظ على عدد الخلايا المستمر <5 × 10 5 خلية / مل أمر بالغ الأهمية.
وعلاوة على ذلك، يمكن أن أعداد الخلايا عالية لحث على الانتقال من دورة الخضري من د. discoideum لدورة التنموية، مما اثار مسارات الموت جوعا، والتي قد تؤدي إلى استجابة مختلفة للإجهاد الحراري. إذا تم التوصل إلى أرقام الهواتف المحمولة عالية في مرحلة الانتعاش بعد الإجهاد الحراري، تدفق وخلايا تجميع يمكن أن تتداخل مع تحليل البيانات وتتحرك الخلايا من التركيز (انظر الشكل 4).
محتوى "> الحد من تقنيةفقدان التركيز هي عنق الزجاجة للبروتوكول. خلال التغيرات في درجات الحرارة، ويمكن للطائرة الوصل تحول جذري، الأمر الذي يتطلب إعادة تركيز اليدوي في فترة زمنية فورا بعد تغيير درجة الحرارة. القفزة في التركيز يمكن أن يكون أحيانا شديد جدا بحيث لا يمكن التغلب عليها عن طريق ضبط تلقائي للصورة البرنامج، وخاصة إذا كان الوقت بين نقاط الوقت مرتفع. ومع ذلك، إذا تم تجهيز المجهر استخدامها مع ضبط تلقائي للصورة الأجهزة، وهذا الاختناق يمكن التحايل عليها.
أهمية تقنية فيما يتعلق بأساليب الحالية
بالمقارنة مع الاجهزة الموجودة مثل استخدام غرف مكيفة الهواء، وصناديق حضانة التحكم في درجة حرارته تغطي الأهداف والمسرح المجهر أو التحكم في درجة حرارته مراحل والياقات موضوعية، واستخدام غرفة التبريد يوفر تحكم أكثر دقة من المحيط درجة الحرارة. وبلتيير عنصر في غرفة التبريد يمكن الحفاظ على تيم ثابت وموحدperature في جميع أنحاء الإعداد التجريبية. في الاجهزة الكلاسيكية، قد تؤدي الاختلافات في درجة الحرارة المحلية إلى نتائج المراقبة المختلفة. وعلاوة على ذلك، فإنه يمكن أن تستجيب بسرعة وبسرعة مع التغيرات التي يسببها في درجة الحرارة، في حين التكيف مع الاجهزة الكلاسيكية ببطء شديد لتغيرات درجة الحرارة التي يسببها، وخصوصا خفض درجة الحرارة. وبلتيير عنصر في غرفة التبريد يمكن أن تشمل أيضا مجموعة واسعة درجة حرارة (15-40 درجة مئوية) من الاجهزة الكلاسيكية، والتي تصل درجات الحرارة مثل 15 درجة مئوية أو 40 درجة مئوية أمر صعب للغاية.
Dictyostelium discoideum حساسة بشكل خاص للصور سمية. الدراسات السابقة استخدمت أسكوربات كما زبال للحد من صور سمية. ومع ذلك، وفترات التصوير الطويلة تتطلب مكملات إضافية. وعلاوة على ذلك، فإن استخدام أسكوربات يقتصر على الدراسات التي آلية الفائدة لا يتأثر الملحق المضادة للأكسدة. نقترح أن التصوير التي تسيطر عليها درجة الحرارة يمكن أن تستخدم بمثابة appr البديلoach للحد من صور سمية، ويمكن دمجه مع إضافة أسكوربات إلى مزيد من الانخفاض سمية.
التأثيرات الضوئية يمكن التقليل من خلال توفير درجة حرارة ثابتة وموحدة من 23 درجة مئوية باستخدام غرفة التبريد. خلايا تصويرها باستخدام التحكم في درجة الحرارة تظهر علامات أقل من الصور سمية، هذا التقريب الخلية، لفترة زمنية أطول. هذا كما يسمح التصوير مع كثافة أعلى، فترات زمنية أصغر أو أكثر من حقول نظر (FOVs).
التطبيق العام
وقد تبين الإجهاد الحراري في ارتفاع درجات الحرارة ان تثير رد فعل الإجهاد الحراري المختلفة (14). لذلك، وزيادة درجة الحرارة إلى 34 درجة مئوية أو 37 درجة مئوية قد تحفز استجابة مختلفة. بالإضافة إلى الإجهاد الحراري المطبق، ومدة حالة الإجهاد معين يمكن تعديلها لدراسة الاستجابة الفورية أو التكيف على المدى الطويل للإجهاد الحراري.
بشكل عام، لا يمكن للبروتوكول وصفها يكونوسعت إلى مجموعة واسعة من التطبيقات. لأن التحكم في درجة الحرارة دقيقة يقلل إلى حد كبير الآثار الصورة السامة، وبروتوكول يمكن استخدامها في الأماكن التي تتطلب الأوقات عالية التعرض و / أو ارتفاع شدة الضوء الإثارة، على سبيل المثال، لتصور البروتينات مع مستوى التعبير منخفضة، أو بالاشتراك مع فترات زمنية قصيرة بين التصوير، على سبيل المثال، خلال الوقت الفاصل بين التصوير. كما يمكن أن يكون مفيدا لتصوير الأجسام التي تغطي الخلية بأكملها، على سبيل المثال، الأنابيب الدقيقة، كما تتطلب هذه الإعدادات على عدد كبير من البصرية ض أقسام.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no Acknowledgements.
Materials
| AX Medium | ForMedium | AXM0102 | |
| LoFlo medium | ForMedium | LF1001 | |
| MG132 | Sigma | C2211 | |
| Lactacystin | Sigma | L6785 | |
| Geldanamycin | Santa Cruz | sc-200617 | |
| Radicicol | Santa Cruz | sc-200620 | |
| MatTek disch 35 mm | MatTek corporation | P35G-1.5-14-C | glass bottom imaging dish |
| CellViell cell culture dish | Greiner | 627870 | 4-compartments glass bottom imaging dish |
| Thermal Stage Heater/Cooler Insert | Warner Istruments | TB-3/CCD | |
| Bipolar temperature controller | Warner Istruments | CL-100 | |
| Liquid cooling System | Warner Instruments | LCS-1 |
Riferimenti
- Bonner, J. T. Evidence for the Formation of Cell Aggregates by Chemotaxis in the Development of the Slime Mold Dictyostelium Discoideum. Journal of Experimental Zoology. 106 (1), 1-26 (1947).
- Loomis, W. F. Cell signaling during development of Dictyostelium. Biologia dello sviluppo. 391 (1), 1-16 (2014).
- Nichols, J. M. E., Veltman, D., Kay, R. R. Chemotaxis of a model organism: progress with Dictyostelium. Current Opinion in Cell Biology. 36, 7-12 (2015).
- Williams, J. G. Dictyostelium finds new roles to model. Genetica. 185 (3), 717-726 (2010).
- Müller-Taubenberger, A., Kortholt, A., Eichinger, L. Simple system – substantial share: The use of Dictyostelium in cell biology and molecular medicine. European Journal of Cell Biology. 92 (2), 45-53 (2013).
- Malinovska, L., Palm, S., Gibson, K., Verbavatz, J. M., Alberti, S. Dictyostelium discoideum has a highly Q/N-rich proteome and shows an unusual resilience to protein aggregation. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (20), E2620-E2629 (2015).
- Malinovska, L., Alberti, S. Protein misfolding in Dictyostelium: Using a freak of nature to gain insight into a universal problem. Prion. 9 (5), 339-346 (2015).
- Schneider, K., Bertolotti, A. Surviving protein quality control catastrophes – from cells to organisms. Journal of Cell Science. 128 (21), 3861-3869 (2015).
- Dobson, C. M. Protein folding and misfolding. Nature. 426 (6968), 884-890 (2003).
- Fukui, Y., Yumura, S., Yumura, T. K. Agar-overlay immunofluorescence: high-resolution studies of cytoskeletal components and their changes during chemotaxis. Methods in cell biology. 28, 347-356 (1987).
- Graf, R., Rietdorf, J., Zimmermann, T. Live cell spinning disk microscopy. Microscopy Techniques. 95, 57-75 (2005).
- Samereier, M., Meyer, I., Koonce, M. P., Graef, R. Live Cell-Imaging Techniques for Analyses of Microtubules in Dictyostelium. Methods in cell biology. 97, 341-357 (2010).
- Herman, P. K. Stationary phase in yeast. Current opinion in microbiology. 5 (6), 602-607 (2002).
- Loomis, W. F., Wheeler, S., Wheeler, S. Heat shock response of Dictyostelium. Biologia dello sviluppo. 79 (2), 399-408 (1980).
