Produzione semplici ed efficaci e Purificazione di topo mielina Oligodendrocyte glicoproteina di encefalomielite autoimmune sperimentale Studi
Summary
We describe a simple protocol using only basic lab equipment to generate and purify large quantities of a fusion protein that contains mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein. This protein can be used to induce experimental autoimmune encephalomyelitis driven by both T and B cells.
Abstract
Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses targeting myelin. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is the most common animal model of CNS autoimmune disease, and is typically induced via immunization with short peptides representing immunodominant CD4+ T cell epitopes of myelin proteins. However, B cells recognize unprocessed protein directly, and immunization with short peptide does not activate B cells that recognize the native protein. As recent clinical trials of B cell-depleting therapies in MS have suggested a role for B cells in driving disease in humans, there is an urgent need for animal models that incorporate B cell-recognition of autoantigen. To this end, we have generated a new fusion protein containing the extracellular domain of the mouse version of myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) as well as N-terminal fusions of a His-tag for purification purposes and the thioredoxin protein to improve solubility (MOGtag). A tobacco etch virus (TEV) protease cleavage site was incorporated to allow the removal of all tag sequences, leaving only the pure MOG1-125 extracellular domain. Here, we describe a simple protocol using only standard laboratory equipment to produce large quantities of pure MOGtag or MOG1-125. This protocol consistently generates over 200 mg of MOGtag protein. Immunization with either MOGtag or MOG1-125 generates an autoimmune response that includes pathogenic B cells that recognize the native mouse MOG.
Introduction
La sclerosi multipla è una malattia umana caratterizzata da infiammazione cronica e neurodegenerazione del sistema nervoso centrale che è pensato per essere guidato da una risposta autoimmune diretta verso la mielina. La perdita di mielina e gli assoni nel tempo comporta il graduale declino cognitivo e motorio funzione 1. "Encefalomielite autoimmune sperimentale" è un termine generico per i modelli animali di malattia autoimmune rivolta mielina del SNC. Come MS umani, EAE è tipicamente caratterizzato da infiltrazione di cellule immunitarie del sistema nervoso centrale e, in alcuni casi, demielinizzazione 2. Tuttavia, il grado in cui un dato modello di EAE assomiglia MS umana in parte dipende dalle specie o ceppo utilizzati e della complessità della risposta autoimmune anti-mielina sottostante.
autoimmunità anti-mielina può essere indotta sperimentalmente in vari modi, ma il metodo più comune utilizzato oggi è quello di immunizzare i topi con una breve peptide di aminoacidi imitando il CD4 immunodominante <sup> + T epitopo cellule di una proteina mielina. Questo rappresenta il requisito minimo per indurre una risposta patogena. Forse il più comune di questi è un peptide di 21 aminoacidi derivato da myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG 35-55), che viene utilizzato per indurre EAE in topi C57BL / 6 3. Tuttavia, per alcuni scopi sperimentali è desiderabile o addirittura necessario per immunizzare con antigeni proteici più grandi e in effetti ci sono molti vantaggi a questo oltre l'immunizzazione con breve peptide. Innanzitutto, a causa della restrizione MHC, piccoli peptidi sono generalmente efficaci solo in una gamma molto limitata di ceppi, mentre antigeni proteici grandi corrispondenti sia l'intera proteina o un dominio specifico possono essere elaborati normalmente per presentarli in diversi ceppi di topi inbred o anche in diverse specie 4. In secondo luogo, un antigene proteico più grande è in grado di indurre una risposta immunitaria più complesso incorporando più tipi di linfociti nel riconoscimento dell'antigene, piuttosto che limiting riconoscimento dell'antigene alle cellule T CD4 +. Ad esempio, le cellule B tramite il loro recettore delle cellule B (BCR) interagiscono direttamente con tutto piuttosto che elaborati proteine. Noi e altri hanno dimostrato che le cellule B attivate da MOG 35-55 immunizzazione non riconoscono la proteina MOG 5. Dato che le cellule B sono stati recentemente dimostrato di giocare un ruolo patogenetico nella SM umano 6, modelli EAE che incorporano le cellule B in patologia autoimmune sono sempre più importanti.
Nonostante i vantaggi dell'utilizzo di antigeni proteici grandi per indurre EAE, rimangono poche fonti disponibili in commercio per tali proteine. Infatti, mentre i peptidi corti come MOG 35-55 possono essere sintetizzati molto rapidamente e ad un costo relativamente basso, le opzioni commerciali per proteina MOG sono limitati e costo sostanzialmente più acquistare. Tuttavia, ci sono diversi vettori di espressione disponibili per i gruppi di ricerca per generare MOG dominio extracellulare (MOG) 1-125 stessi. However, tutti i sistemi di espressione che abbiamo identificato in letteratura sono basati su vecchie tecnologie che sono state sostituite con sistemi di espressione più efficienti 7. Inoltre, la maggior parte sono basati su ratto o umano MOG 8. Per alcune ricerche di autoimmunità in topi, un antigene basato sulla autoantigene del mouse MOG è preferibile. Infine, tutte le proteine MOG-based che abbiamo individuato, sia commerciale o come vettori di espressione, sono proteine di fusione contenenti amminoacidi supplementari alla base MOG 1-125. Questi includono un tag per la purificazione e di solito altre sequenze così, molte delle quali con una funzione siamo stati in grado di identificare.
Per far fronte a queste limitazioni, abbiamo generato una proteina di fusione romanzo basato sul mouse MOG dominio extracellulare fuso a un tag contenente tioredossina per combattere l'insolubilità noto di MOG proteine 5. La sequenza di tag contiene anche una sequenza 6xHis di purificazione e di una proteasi TEV CLEsito Avage che permette la rimozione completa di tutte le sequenze di tag, se desiderato. Questo è l'unico metodo che siamo consapevoli di generare puro proteina MOG 1-125. Per facilitare la produzione di grandi quantità di proteine, la sequenza MOG 1-125 era codone ottimizzato per l'espressione batterica e la proteina di fusione tag MOG è stato inserito nel sistema di espressione pET-32. Qui, descriviamo in dettaglio il protocollo per produrre e purificare MOG proteine tag, e puro MOG 1-125, utilizzando attrezzature non specializzati a disposizione maggior parte dei laboratori di immunologia.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui, abbiamo descritto un protocollo per la produzione di MOG etichetta proteica e come generare puro MOG 1-125 dalla proteina tag MOG. Questo protocollo si basa sia sulla base metodi di purificazione delle proteine standard di His-tag, così come un protocollo precedentemente descritto per la generazione di una proteina MOG-based anziani 15. Anche se non è qui descritta, l'utilizzo primaria della proteina tag MOG è indurre EAE attraverso l'immunizzazione …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a grant from the Multiple Sclerosis Society of Canada. RWJ is the recipient of the Waugh Family MS Society of Canada Doctoral Studentship Award.
Materials
| BL21 E.coli– pet32-MOGtag | Kerfoot lab | These bacteria are required to make the MOGtag protein. Glycerol stocks of these bacteria are available upon request. | |
| LB broth miller | Bioshop | LBL407.1 | |
| Ampicillin | bio basic | AB0028 | Reconsititute the powder into 50% ethanol/ 50% H2O at 100 mg/ml. Store at -20 °C. |
| IPTG | Bioshop | IPT002.5 | Reconsititute the powder into H2O at 1M and store at -20 °C. |
| Chicken-egg lysozyme | Bioshop | LYS702.10 | Reconstitute in H2O at 50 mg/ml and store at -80 °C. |
| Triton-X100 | Sigma | T-8532 | |
| Phosphate buffered saline | life technologies | 20012-027 | Commercial phosphate buffered saline is not required, any standard lab made phosphate buffered saline is sufficient. |
| Sodium chloride | Bioshop | SOD004.1 | |
| Tris-HCl | Bioshop | TRS002.1 | |
| Imidazole | Bioshop | IMD508.100 | |
| Guanidine-HCl | Sigma | G3272 | The quality must be greater than 98% purity. |
| 0.5M EDTA | bioshop | EDT111.500 | |
| Nickel (II) sulfate | Bioshop | NIC700.500 | |
| His bind resin | EMD Millipore | 69670-3 | Store in 20% ethanol 80% H2O at 4 °C |
| Anhydrous ethanol | Commercial Alcohols | P016EAAN | Dilute with water as needed. |
| Glacial acetic acid | Bioshop | ACE222.1 | |
| Sodium acetate trihydrate | Bioshop | SAA305.500 | |
| bovine serum albumin standard | bio-rad | 500-0206 | |
| Bio-rad protein assay dye reagent concentrate | bio-rad | 500-0006 | |
| Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dihydrate | Fisher scientific | BP120-500 | |
| Tris-base | Bioshop | TRS001.1 | |
| 7000 MW Snakeskin dialysis tubing | Thermoscientific | 68700 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M3148-25ml | This reagent should not be handled outside of a fume hood. |
| AcTEV protease | lifetechnologies | 12575-015 | Producing your own TEV protease can be accomplished using (https://www.addgene.org/8827/) and purified as in reference 17 |
| Polyethyleneglycol 3350 | Bioshop | PEG335.1 | |
| polyethyleneglycol 8000 | Bioshop | PEG800.1 | |
| Nunc MaxiSorp flat-bottom 96 well plate | ebioscience | 44-2404-21 | |
| Sonicator | Fisher scientific | FB-120-110 | |
| Eon microplate spectrometer | Biotek | 11-120-611 | This equipment uses the Gen5 data analysis software. |
| Gen5 data analysis software | BioTek | ||
| sodium dodecyl sulphate | Bioshop | SDS001 | |
| bromophenol blue | Bioshop | BRO777 | |
| Glycerol | Bioshop | GLY001 | |
| Protein desalting columns | Thermoscientific | 89849 | |
| Glycine | Bioshop | GLN001 | |
| precast 12% polyacrylamide gel | bio-rad | 456-1045 | |
| Rapid stain reagent | EMD Millipore | 553215 | |
| Gel dock EZ imager | bio-rad | 1708270 | |
| White Light Sample Tray | bio-rad | 1708272 | Used along with gel dock EZ imager for coomassie blue stains |
| Protein ladder | bio-rad | 1610375 |
Riferimenti
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