Stresli bitkilerden izole edilen kloroplastlarda içine Protein İthalat analizi

1. Arabidopsis Bitkilerin Büyüme ve Stres Tedavisi 1 L iyondan arındırılmış su kadar MS temel tuz karışımı içinde 4.3 g, 10 g sakroz, 0.5 g 2- (N-morfolino) etan sülfonik asit (MES) eklenerek Murashige ve Skoog (MS) ortamı 1 L hazırlanmakta ve ayarlamak potasyum hidroksit ile pH'ı 5.7'ye (KOH). 120 ° C de 20 dakika süreyle phytoagar ve otoklav 6 g ekleyin. katılaşma önce, (- plaka başına 25 ml MS ortamı 20 ile çapı 9 cm, yükseklik 1.5 cm) yuvarlak Petri kapları içine orta dökün. Plakalar kapakları kapatmadan önce bir laminer akış kaputu 1 ~ için h kurumaya bırakın. % 70 1 ml% 0.02 (h / h) Triton X-100 ihtiva eden ve sürekli, 5-10 dakika boyunca çalkalama (h / h) etanol ilave yüzey sterilizasyonu için 1.5 ml bir test tüpüne, Arabidopsis thaliana tohumları yerleştirin. 150 fidan – Her genotip / durum için, 10 Petri plakaları her taşıyan ~ 100 hazırlar. Tohumlar yerleşmek kadar yaklaşık 10 saniye bekleyinDaha sonra tüpün alt ve pipetleme süpernatant atın. % 100 etanol 1 mL ekleyin ve 10 dakika için daha tüp çalkalayın. tohumlar sterilize ederken laminer akış kaputu hazırlayın. , Örnek başına filtre kağıdı tek parça almak ekim kolaylaştırmak için ikiye katlayın ve kaputu% 100 etanol içinde ıslatın. tamamen kurur kadar bekleyin. daha hızlı bir şekilde,% 70 etanol daha buharlaştıkça yani% 100 etanol kullanılır edin. İnce ucundan 1 ml pipet kesim ~ 5 mm kullanarak pipetleme filtre kağıdı üzerine tohum aktarın. 15 dk – onları yaklaşık 10 almalı, hangi kurumaya bırakın. Her MS ortamı Petri plaka üzerine eşit 150 sterilize tohumları ve cerrahi bant ile her plaka mühür – ~ 100 Sow. teşvik ve çimlenmesini senkronize 4 d – ters 2 4 ° C'de plakaları saklayın. Eski tohumlar 4 ° C'de (bir hafta kadar) daha uzun kalmak gerekebilir. bir bitki doku kültürü odasına plakaları aktarın ve baş yukarı bırakın.Uzun gün döngüsü altında 8 gün boyunca bitkiler büyümek (16 saat 100 ľmol · m – 2 · s – 1 ışık, 8 saat karanlık) 20 ° C'de. Bitkiler akış kaputu, 8 d eski stres tedavisi için, hafifçe stres içeren sıvı MS ortamında bir sterilize balona, etanol sterilize eldiven giyen elle onları kazıma, agar ortamı aktarabilirsiniz (örneğin 200 mM mannit). agar ortamı üzerinde taşıyan kaçının. steril folyo ile şişe ağzı kapatılır ve bitkiler hafifçe çalkalanarak (-100 rpm) ile orbital bir karıştırıcı üzerinde ek 2 gün boyunca adım 1.8 ile aynı koşullar altında büyümeye olanak sağlar. 2. in vitro transkripsiyon ile öncü proteinin yapma / yaptı Not: Bu protokol, şablon / preprotein olarak D öncüsü (pPsaD) kompleksi Arabidopsis fotosistem kullanımını varsaymaktadır, ancak yöntem diğerleri ile uyumludur. <ol> PBluescript II SK vektör (veya akış yukarı T7 promoteri ile benzer başka vektör) 13 çoklu klonlama bölgesinin (MCS) içerisine pPsaD kodlama dizisi (CDS) klonlama. DNA izolasyon kiti kullanılarak plazmid (pBSK-pPsaD) saflaştınlır ve DNA dizilimi yolu ile sekansının doğrulanması. NOT: Tüm bu adımlar, standart moleküler klonlama teknikleri kullanır. 260 nm'de absorbans ölçümü için ayarlanmış bir spektrofotometre kullanılarak pBSK-pPsaD plazmit DNA konsantrasyonunun belirlenmesi. 10 ng / ml bir son konsantrasyona kadar plazmid seyreltilir. şablon olarak seyreltildi plasmidi kullanılarak (35 çevrim için) 20 uL PCR çalışması. 2 ul 10 x polimeraz tamponu, 2 uL 2mM dNTP, 1 uL 5 mM M13 ileri primeri (5'-TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3 '), 1 uL 5 mM M13 ters primeri (5: aşağıdaki reaksiyon hazırlanması '-CAG GAA ACA-3 ACC GCT ATG'), 1 uL pBSK-pPsaD plazmid, 1 U Taq polimeraz ve damıtılmış su ile seyreltilir kadar toplam reaksiyon hacmi oluşturmak için20 uL. aşağıdaki gibi standart bir PCR programı kullanarak: 95 ° C, 5 dak; [95 ° C, 30 saniye 35 döngü; 56 ° C, 30 saniye; 72 ° C, 30 saniye); ve 72 ° C, 5 dakika. TAE tamponu (Tris-HCI, pH 7.6, 20 mM asetik asit, 1 mM EDTA) içinde agaroz jeli cDNA doğru amplifikasyon kontrol ve ilgili ölçmek için (ağ / hac),% 1 üzerinde PCR ürünün 5 uL başlat standartlara bant göreli konsantrasyonunu onaylayın. diğer uygulamalar için -20 ° C 'de, ürünün geri kalan saklayın. Aşağıdaki gibi PCR DNA ile uyumlu olan bir tavşan retikülosit lizat göre hücresiz transkripsiyon / translasyon sistemi kullanılarak 50 ml'lik bir reaksiyon hazırlanması: 40 uL retikülosit lizatı transkripsiyon / translasyon sistemi, 2.5 uL radyo işaretli [35S] metionin, 11 uCi / ml (spesifik aktivite:> 1000 Ci / mmol), 2.5 uL steril damıtılmış su ve 5 uL pPsaD PCR ürünü (100-800 ng). Dikkat: eldiven, laboratuvar giysi ve emniyet glas Wearses radyoaktif madde taşırken. Monitör ve çalışma yüzeyi ve araçlarını temizlemek. onaylı bir atık konteynerine tüm radyoaktif atık bertaraf edin. 30 ° C su banyosu içinde 90 dakika boyunca reaksiyon inkübe edin. Buz üzerinde numunesinin ederek reaksiyonu durdurun. otoradyografi, florografi ya da fosfor görüntüleme ardından standart sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) üzerine doğrulaması için bir test örneği olarak reaksiyon (aynı hacmi de aşama 5.7 için bir giriş kontrol olarak hizmet görebilir) 1 uL çıkarın. İyi bir sonuç pPsaD (~ 23 kD) molekül ağırlığına karşılık gelen bir tat ve güçlü bant gözlem ile gösterilir. diğer uygulamalar için, -80 ° C'de reaksiyon kalan saklayın. 3. Kloroplast İzolasyon Aşağıdaki stok çözümler hazırlayın: 0.6 M sorbitol, 10 mM magnezyum klorür: Kloroplast izolasyon tamponunda (CIB, 2x) hazırlanması(MgCI2), 10 mM etilen glikol tetraasetik asit (EGTA), 10 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA), 20 mM sodyum bikarbonat (NaHCO3), 40 mM 4- (2-hidroksietil) piperazin-1-etansülfonik asit (HEPES) ; KOH ile pH 8.0 olacak şekilde ayarlanır. 2x CIB 2 L hazırlayın alikotları yapmak ve uzun süreli depolama için -20 ° C'de muhafaza edin, ya da kısa süreli depolama için 4 ° C'de. damıtılmış su ile 1;: 1x CIB ettirmek için, 2x CIB 1 seyreltin Bu kloroplast yalıtım deney gününde taze olarak hazırlanabilir. HEPES-MgSO 4 sorbit tamponu (HMS, 1 x) hazırlanması: 50 mM HEPES, 3 mM magnezyum sülfat (MgSO ^ 4), 0.3 M sorbitol; Sodyum hidroksit (NaOH) ile pH 8.0 olacak şekilde ayarlanır. , 400 mL kadar tamponu hazırlayın alikotları yapmak ve uzun süreli depolama için -20 ° C'de muhafaza edin, ya da kısa süreli depolama için 4 ° C'de. soğuk oda veya buz üzerinde aşağıdaki prosedürleri yürütün. st önce çözümler, gereç, ekipman ve rotor tüm ön soğutmaArting. 13 mL Percoll, 13 mL 2x CIB tamponu ve 50 ml'lik bir santrifüj tüpü içinde 5 mg glutatyon karıştırılması ve 4 ° C'de 30 dakika (fren kapalı) için 43,000 x g'de karışım santrifüj ile sürekli bir yoğunluk gradyanı hazırlayın. Santrifüj işleminden sonra, degrade rahatsız etmemek ve daha sonra kullanmak üzere buz üzerinde tutmak için dikkatle tüp kolu. 1 L'lik bir behere genotip / durum başına 1 x CIB 100 mL aktarın. bir elek içine devrilme sıvı ortamdan fidan kaldırmak ve başka CIB içeren beher içine aktarabilirsiniz; Daha sonra, taze CIB 100 mL ile değiştirmeden önce herhangi bir kalıntı sıvı ortam kaldırmak için CIB ile doku durulayın. homojenizasyon için, 50 ml beher düzenlenen taze CIB 20 mL kullanarak yuvarlak homojenizasyon beş ardışık tur, her numune başına 100 mL 1x CIB toplam kullanın. homojenizasyon ilk turu için, izin elle 50 ml beher içine bitki doku transferiBir önceki tutma tampon parmaklarının arasından boşaltmak için. ilk turda dokusunun en kullanmaya çalışın, ama tamponu ile batırılır emin olun; Bu mümkün değilse, ikinci turda kalan kullanılmamış dokuyu tanıtmak. doku içine doku homojenleştirici duyargasını ve 1 iki darbeleri ile homojenize – 2 sn her. yumuşak bir sıkarak 250 mL'lik santrifüj tüpü içine filtre bezi iki katmanı boyunca Homojenat filtre. süzüntü saklayın ve 50 ml beher geri doku aktarın. homojenizasyon ilk turunda kullanılmayan kalan doku ekleyerek, 50 ml beher içine ikinci bir 20 mL CIB kısım yerleştirin ve homojenizasyon ve filtrasyon adımları tekrarlayın. Bu nedenle, tekrar CIB 100 ml (yani, 5 20 mL alikotları), ve elde edilen süzüntüler bir araya kullanıldıktan tüm kadar 3.5 ve 3.6 adımları tekrarlayın. Santrifüj 4 ° C'de 5 dakika (fren) için 1000 x g'de toplanmış Homojenat ve kapalı dökünsüpernatant hemen pelet rahatsız etmemek için özen, santrifüj tamamlanmasını takiben. yavaşça buz tüpü çalkalayarak tüp içinde kalan kalıntı süpernatant pelletini. pipetle veya vorteks kuvvetlice tekrar süspansiyon yok. Yavaşça alıcı borunun çeperi yoluyla uygulamak için bir Pasteur pipeti kullanılarak, önceden hazırlanmış sürekli yoğunluk gradyanı üst kısmına Homojenat aktarın. degrade rahatsız etmemek. 4 ° C'de 10 dakika (fren kapalı) için 7800 x g'de bir sallanan kepçeli rotor santrifüjleyin. Alt bant sağlam kloroplast içerir ve üst bant kırık kloroplast içerir: İki yeşil bantlar santrifüj sonra degrade görülebilir: NOT. pipetleme En bant atın, sonra gradyanı başına 8 mL'lik bir hacmi koruyarak, yeni bir 50 mL santrifüj tüpüne Pasteur pipeti ile alt bant aktarın. t ~ 1x HMS 25 ml tüp içine tampon ekleyin ve iki kez tüp terso kloroplastlar gelen Percoll yıkayın. 4 ° C'de 5 dakika boyunca (fren) için 1000 x g'de sallanan kovalı rotor ve santrifüj içinde tekrar tüp yerleştirin. Süpernatantı dökün ve dikkatlice yavaşça buz tüpü çalkalayarak tüp içinde kalan artık HMS kloroplast pelletini. (Pelet boyutu ve Bölüm 4'te sayma dayanarak) gerekirse HMS 300 uL, ama çok fazla örneği sulandırmak için değil deneyin – ek bir 100 ekleyin. buz üzerinde kloroplast tutun. kloroplastlar, aşağı uygulamalar için kullanılır önce her zaman onları tekrar süspansiyon tüp sallayın. Her zaman kloroplast aktarmak için (büyütülmüş gözenek) ile bir kesim pipet kullanın. Kloroplast Verim ve Bozulmamışlık 4. Analizi 1.5 ml tüp içinde 495 uL 1x HMS tamponuna izole kloroplastların 5 mcL ekleyin ve sonra 1 elde etmek için tersini tüp hafifçe karıştırın: 100 seyreltme. Plahaemositometre sayma odasının üstüne bir kapak camı ce. Yavaşça pipet ~ 40 – kapak cam ve sayım odasına arasındaki boşluğa seyreltilmiş kloroplast süspansiyonu 60 ul. 10X veya 20X amacı ile bir faz-kontrast mikroskop kullanarak, bozulmamış kloroplastlar yuvarlak ve parlak görünmesini ve ışık halesi ile çevrilidir. NOT: Mikroskop altında, 25 büyük meydanlar, sayma odasının merkezinde her biri 16 küçük kareler ile 1 mm 2 sayma alanı yoktur. 10 büyük kareler kloroplastlar sayısını. çok az veya çok fazla kloroplast varsa, buna göre seyreltme faktörü (yukarıdaki adım 4.1) ayarlayabilir ve prosedürü tekrarlayın 10 ila 30 büyük kare başına kloroplastların sayısı ortalama gerekir. aşağıdaki gibi mL (konsantrasyon) başına kloroplastların sayısını hesaplayın: n (Adım 4.3 hesaplanan büyük kare başına kloroplastların ortalama sayısı), büyük kareler 25 (toplam sayısını ×) 100 (seyreltme faktörü) x 25 kareler üzerinde hacmi 0.1 mm3 olduğu), 1 mL başına veri ifade 10 4 (ölçekleme faktörü ×. Adım 3.12 'de elde edilen kloroplast süspansiyon hacimce konsantrasyonu çarpılarak kloroplast gerçek verimini hesaplayın. Normal olarak, birden fazla 50 x 10 6 kloroplast elde edilebilir. 5. Kloroplast Protein İthalat Aşağıdaki stok çözümler hazırlayın: 10x HMS tamponu hazırlayın: 500 mM HEPES, 30 mM MgSO 4 ve 3.0 M sorbitol; NaOH ile pH'ı 8.0'a ayarlayın. uzun süreli depolama için -20 ° C'da, bu tampon, kısım ve mağaza 50 mL hazırlanması ve kısa süreli depolama boyunca 4 ° C 'de. 1x HMS tampon içinde çözünmüş 50 mM EDTA: İthalat durdurma tamponu hazırlayın. -20 ° C'de bu tampon, kısım ve mağaza 50 mL hazırlayın. (60 w mM Tris-HCl, pH 6.8,% 10 (h / h) gliserol,% 2: 2x protein yükleme tamponu hazırlayın/ H) SDS,% 0.005 (ağ / hac) bromofenol mavisi. 4 ° C'de 50 mL, ve mağaza sağlayın. Kullanımdan hemen önce, tampon 900 uL 1 M, 1,4-ditiyotreitol (DTT), 100 uL ilave edin. 3 zaman noktaları ile bir zaman ders çalıştırmak 3 tüpleri ithal durdurma tamponu 130 mcL kısım içeren her hazırlamak ve buz üzerinde bunları bırakın. (Genotip / durum başına) 2 ml tüp içinde 450 uL ithalat reaksiyonu hazırlayın. kullanımdan hemen önce tüm malzemeyi çözülme. Bir içe reaksiyonu için tipik bir uL hacim içinde 10 x 10 6 kloroplast kullanımı; Örneğin kloroplast konsantrasyonu 2.5 x 10 8 ug / ml 40 uL kloroplast süspansiyonu kullanmak faydalı olacaktır. Üç zaman noktaları 3 × A uL gerekir (yani, bizim örneğimizde 120 uL). Aşağıdaki sırayla, buz üzerinde reaksiyonlar bileşenleri karıştırmak: damıtılmış su (toplam hacim 600 uL yapmak için), B uL 10x HMS tamponu (B = [600-3 x A] / 10, yani, 48 bizim örneğimizde), 12 uL1 M glukonik asit (potasyum tuzu), 6 uL 1 M NaHCO 3, 6 uL% 20 BSA, 30 uL 100 mM adenozin 5'-trifosfat, magnezyum tuzu (MgATP), 24 uL 250 mM metionin (a / h) (radyoaktif olmayan ) ve 30 uL protein öncüsünün. Hemen ithalat reaksiyonu başlamadan önce, 3 × kloroplast bir uL ekleyin ve tüp hafifçe dokunarak karıştırın. 2 · s – 1 – ışık 100 umol · m altında bir su banyosu içinde 25 ° C 'de, reaksiyon tüpü inkübe edin. Bazen kloroplast tekrar süspansiyon tüpler hafifçe vurun. Zamana karşı yapmak için, pPsaD için ~ 12 dakika (4, 8 ve 12 dakikalık zaman noktalarında uygun kadar olan içe doğrusal aralığı içinde gerekli zaman noktalarında reaksiyonundan 130 uL'lik geri bu durumda). Lineer aralığı süresi farklı proteinler 14 değişebilir. Nedenle, t optimize etmek için daha önce her bir de ön test etmek için önerilmektedirO zaman puan. Hemen geri çekilmesi üzerine, buz gibi soğuk ithal durdurma tamponu bir tüp her 130 uL kısım aktarmak tüp hafifçe dokunarak karıştırın ve zaman ders tamamlanana kadar buz üzerinde tüm tüpleri korumak. Santrifüj bir mikrofüj içinde 12,000 x g 'de 30 saat boyunca tüm örnekler, pipetleme süpernatantlar atmak ve pelet tekrar vorteks yoluyla 15 ul 2x protein yükleme tamponu. Tüm örnekler artı standart SDS-PAGE ve otoradyografi, florografi ya da fosfor görüntüleme 15 ile pPsaD giriş kontrolü (adım 2.7, her ithalat reaksiyonuna ilave miktarın% 10'u kadar pPsaD eşdeğer içeren) analiz. Sonuçları ölçmek ve analiz etmek için görüntü analiz yazılımı kullanın. içe verimliliği bir gösterge sağlamak için, farklı genotipler ithal protein miktarı / koşullar Her bir olgun bant ile bağlantılı radyoaktivite ölçümü ile değerlendirilebilir.