İnsan Primer Hücre Kültürleri içinde Sirkadyen Saat Gen İfade ve Hormon salgısını Paralel Ölçümü
Summary
Here, we describe settings to monitor in parallel circadian bioluminescence and the secretory activity of human islet cells and primary myotubes. For this, we employed lentiviral gene delivery of a luciferase core clock reporter, followed by in vitro synchronization and collection of outflow medium by continuous cell perifusion.
Abstract
Sirkadiyen saatler günlük çevresel değişimleri öngörerek dış dünyaya bir uyum sağlayarak, tüm ışığa duyarlı organizmalarda işlevseldir. sirkadiyen saat ve fizyoloji çoğu yönleri arasında sıkı bir bağlantı anlayışımızda önemli ilerleme son on yılda bu alanda yapılmıştır. Ancak, insanlarda sirkadiyen osilatör işlevini temelini moleküler temelini çözülüyor yüksek teknik meydan kalır. Burada, kültürlü insan primer hücrelerinde uzun süreli (2-5 gün) biyolüminesans kayıt ve çıkış ortamı koleksiyonu için deneysel bir yaklaşım ayrıntılı bir açıklama sağlar. Bu amaçla, hormon sekresyonu ve sirkadiyen biyolüminesans paralel değerlendirmeye olanak sağlayan bir çekirdek saat gen promotörünün kontrolü altında bir lentiviral lusiferaz raportör ile birincil hücreler transdüksiyona var. Ayrıca, pr sirkadiyen saat bozan koşullarını tarifsiRNA hedef SAAT transfekte edilmesiyle imary insan hücreleri. insan pankreatik adacıkların insülin salgılanmasının sirkadiyen düzenleme ile ilgili sonuçlar, insan iskelet kası hücreleri tarafından myokine salgılanması, bu yöntemin uygulanmasını göstermek için sunulmaktadır. Bu ayarlar, insan periferal saatler moleküler makyaj çalışma ve fizyolojik veya patofizyolojik koşullarda primer hücrelerde fonksiyonel etkisini analiz etmek için kullanılabilir.
Introduction
(Latince "Circa diem" dan) sirkadiyen zamanlama sistemi Dünya'nın dönüşüne adaptif mekanizma olarak, tüm ışığa duyarlı organizmalarda ortaya çıkmıştır. Memelilerde, bu ventral hipotalamusun suprakiazmatik çekirdeğinde yer alan merkezi saat, kapsayan, hiyerarşik bir şekilde organize edilir ve periferik (veya köle) farklı organlarda ameliyat olan osilatörler. Ayrıca, bu hücre bağımsız kendini sürdüren osilatörler gövdesinin 1 neredeyse her hücrede işlevseldir. SCN kaynaklanan sinirsel ve humoral sinyaller periferik saatler reset ise photic sinyaller, SCN nöronlar için baskın bir senkronizasyon ipucu (Zeitgeber) temsil eder. Dönüş besleme-açlık döngüleri sürücü ekleme dinlenme-faaliyet ritimleri, içinde, çevresel saatler 2 hakkında daha fazla synchronizers vardır. Mevcut anlayışa göre, çekirdek saati moleküler makyaj transkripsiyon ve abancı dayanmaktadırorganizmalar arasında muhafaza edilir tional geri besleme döngüleri. Bu arada negatif çekirdek saat PER ve CRY genlerin transkripsiyonunu aktive transkripsiyonel aktivatörleri BMAL1 ve SAAT içerir. PER ve Cry proteinlerinin yüksek seviyede BMAL1 / SAAT kompleksinin inhibisyonu yoluyla kendi transkripsiyonunu inhibe edecektir. Yardımcı bir halka da BMAL1 ve saat transkripsiyonu düzenleyen nükleer reseptörler REV-Erbs ve Oto- oluşur. Ayrıca, fosforilasyon, sumoylation, asetilasyon, O-GlcNAcylation, bozulması ve çekirdek saat proteinlerinin nükleer girişi de dahil olmak üzere posttranslasyonel olaylar 24 saat salınım döngüsü 3 kurulmasında bir ek önemli düzenleyici katmanı temsil etmektedir.
Biriken deliller kemirgen modellerinde çalışmalardan kaynaklanmaktadır ve metabolik ve endokrin fonksiyonların 4-5 koordinasyonunda sirkadiyen sistemin kritik rolünü vurgulamaktadır. larg bir sayıaçlık döngüleri periferik osilatörler 6-8 senkronizasyonu merkezi bir rol oynar – e-ölçekli transcriptome analizi besleme öneririz. Bu çalışmaların bir uyumlu olarak, kemirgenlerde ve insanlarda metabolomic ve lipidomic analizi metabolitlerin çok sayıda sirkadiyen şekilde 9-11 doku, plazma ve tükürük salınım olduğunu ortaya koymuştur. Önemlisi, çoğu hormonlar kan 5,12-13 sirkadiyen ritimleri gösterirler. Ayrıca, periferik doku üreten karşılık gelen hormonun sirkadiyen saatler yerel hormon salgılanmasını düzenleyen olabilir. Hücre özerk sirkadiyen osilatörler kemirgen ve insan pankreas adacık hücresi 14-16 de tarif edilmiştir. Bu osilatörler pankreas adacık transcriptome düzenlenmesinde önemli bir rol oynayabilir ve 15,17-18 çalışır. Bundan başka, insan iskelet miyotüplerinin göre myokine salınımı en son hücre özerk oscillato düzenlenmiş olan bir sirkadyen desen sergilediği gösterilmiştirBu hücrelerde 19 ameliyat rs.
In vivo olarak, insanlarda sirkadiyen ritimler incelemek için çeşitli yaklaşımlar yaygın olarak kullanılmaktadır. Örneğin, (referanslar 3,20 gözden) plazma melatonin veya kortizol seviyeleri yanı sıra göğüs deri yüzeyi sıcaklığı endojen sirkadiyen saatler değerlendirmek için çalışılmıştır. Bu yöntemler, in vivo sistemik sirkadiyen salınımlar okuyan izin rağmen, çok farklı organ ve dokularda serbest çalışan özerk sirkadiyen ritim güvenilir bir değerlendirme sağlayarak vardır. Bununla birlikte, sistemik yönetmelik böyle diseksiyon bu hücrelerin fonksiyonu hücre içi moleküler saatlerin belirli etkisini anlamak için vazgeçilmez bir araç olacaktır. Bu nedenle, önemli bir çaba in vitro senkronize immortal veya primer kültür hücrelerinde insan saatler çalışmak için güvenilir yaklaşımlar geliştirmeye taahhüt edilmiştir. Daha da önemlisi, bu gösterilmiştirkültürlü birincil deri fibroblast hücreleri ölçülen saat özellikleri yakından tüm organizmanın 21 bireysel saat özelliklerini yansıtmaktadır. Floresan ve bioluminescent sirkadiyen gazetecilere gelişimi büyük ölçüde bu yaklaşımı 22-27 ilerlemiştir. Ayrıca, farklı çevresel organlar türetilir okuyan birincil hücre saatler insan dokusuna-özgü saatler 3,5,16,19-20,28 moleküler özelliklerinin araştırılması için izin verir. Bu nedenle, in vitro olarak senkronize primer eksplantlar ya da hücrelerde gündelik saatler değerlendirilmesi biyolüminesens muhabir kullanılarak, molekül insan periferik saatlerin makyaj ve organ fonksiyonu üzerindeki etkilerini incelemek için oldukça yararlı bir yöntemi temsil eder.
Bu yazıda, özerk hücresel saatin etkisi yanı sıra in vitro senkronize insan primer adacık ve iskelet kası hücrelerinde sirkadiyen gen ifadesini değerlendirmek için ayrıntılı protokoller sunacakBu hücrelerin salgı fonksiyonu bozulması.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada tarif edilen deney ayarlar daha sonra in vitro olarak senkronizasyonu ve birkaç gün biyolüminesans sürekli kayıt ve aynı hücreler tarafından hormon Paralel analizi takiben, kültürlenmiş insan primer hücrelere sirkadiyen biyoışıldama muhabir lentiviral teslimat oluşmaktadır. Bunlar moleküler mekanizmaları ve insan primer hücrelerinde sirkadiyen saatler fonksiyonel yönlerini keşfetmek için verimli bir yaklaşımı temsil etmektedir.
Donör malzeme kalites…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz Cenevre Üniversitesinden meslektaşlarımıza teşekkür ederiz: Jacques Philippe bu işin üzerinde yapıcı yorumlarda bulunan, Ueli Schibler perifüzyon sisteminin gelişmesiyle birlikte bilimsel ilham paha biçilmez yardım için, tasarım, imalat ve devreye tasavvur ettikleri için André Liani perfüzyon sistemi, perifüzyon sistemi ve Damla biolumicorder yazılım geliştirme konusunda yardım almak için Lesa-Teknoloji LTD şirketi, George Severi perifüzyon deneyler ile yardım için, Ursula LOİZİDES-Mangold için kritik lentivirüs hazırlıkları için el yazması okuma ve Anne-Marie Makhlouf ; Etienne Lefai, Stéphanie Chanon ve Hubert Vidal (İNSERM, Lyon) insan primer miyoblastları hazırlamak için için; ve insan adacıklar sağlamak için Domenico Bosco ve Thierry Berney (İnsan Adacık Nakli Merkezi, Cenevre Üniversitesi Hastanesi) için. Bu çalışma, İsviçre Ulusal Bilim Vakfı Hibe sayılı tarafından finanse edildi 31003A_146475 / 1, Sinergia İsviçre Ulusal Bilim Vakfı Hibe No CRSII3-154405, Fondation Romande la Recherche sur diabete, Bo Hjelt Vakfı, Fondation Ernst ve Lucie Schmidheiny ve Société académique de Genève (CD) dökün.
Materials
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300-054 | For muscle biopsy digestion |
| DPBS no calcium no magnesium | Invitrogen | 14190-094 | |
| HAM F-10 | Invitrogen | 41550-021 | For myoblasts culture |
| FBS | Invitrogen | 10270 | Supplement to culture medium |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P0781-100 | Supplement to culture medium |
| Gentamycin | Axon | A1492.0001 | Supplement to culture medium |
| Fungizone | Invitrogen | 15290-026 | Amphotericin B, supplement to culture medium |
| DMEM 1g/L glucose + Na pyruvate + glutamax | Invitrogen | 21885-025 | For myotubes culture |
| DMEM 1g/L glucose -Na Pyruvate – glutamax | Invitrogen | 11880-028 | Recording medium for LumiCycle |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-028 | L-alanyl-L-glutamine dipeptide, supplement to recording medium |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT-104 | Cell detachment solution, for islet cell dissociation |
| CMRL | Gibco | 21530-027 | Culture medium for islet cells |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-039 | Supplement to culture medium |
| 15 ml High-Clarity Polipropylene Conical Tube | Falcon | 352096 | |
| F75 flask | BD Falcon | 353136 | |
| 3.5 cm Petri dish | BD Falcon | 353001 | |
| Foskolin | Sigma | F6886 | Adenylyl cyclase activator, used for synchronization |
| Luciferin | Prolume LTD | 260150 | Supplement to recording medium |
| OptiMEM | Invitrogen | 51985-026 | Serum-free Minimal Essential Medium (MEM) used for human islet cells transfection |
| Lipofectamine RNAiMAX reagent | Invitrogen | 13778-150 | Transfection reagent |
| HiPerFect reagent | Qiagen | 301705 | Transfection reagent |
| ON-TARGET plus siCLOCK smartpool | Dharmacon | L-008212-00 | |
| ON-TARGET plus non targeting siRNA #1 (siControl) | Dharmacon | D-001810-01 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 | For myotubes DNA extraction |
| RNeasy Plus Mini kit | Qiagen | 74104 | For myotubes RNA extraction |
| QIAshredder | Qiagen | 79654 | For myotubes RNA extraction |
| 2 ml collecting tubes | Axygen | 311-10-051 | To collect the medium with the perifusion |
| Tissue culture Plate, 6 Well | BD Falcon | 353046 | To collect the medium with the perifusion |
| RNeasy Plus Micro kit | Qiagen | 74034 | For islet RNA extraction |
| Human IL-6 Instant ELISA kit | eBioscience | 88-7066-22 | |
| Human Insulin Kit Mercodia | Mercodia | 10-1113-01 | |
| Hydrochloric acid, min,37%,p.a. | Acros organics | 124630010 | Used for preparation of lysis buffer (375ml Ethanol+7.5%HCl+117.5%H2O) |
| Ethanol (>99.8%) | Fluka Analytical | 02860-1L | Used for preparation of lysis buffer (375ml Ethanol+7.5%HCl+117.5%H2O) |
| Human Islets for Research | Prodo Laboratories | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment: | |||
| Centrifuge | Heraeus | Megafuge 1.0R | |
| Water bath | VWR | 1112A | at 37 °C |
| Tissu culture hood | Faster | SafeFastElite | |
| Tissu culture incubator | Heraeus | HeraCell 150 | 5% CO2 at 37 °C, no water due to the LumiCycle installation |
| Tissu culture incubator | Heraeus | HeraCell 150 | 5% CO2 at 37 °C, no water due to the LumiCycle installation |
| Tissu culture incubator | Thermo Scientific | Hera Cell 150i | 5% CO2 at 37 °C |
| Shaker | Heidolph Instruments | Unimax 1010 | For agitation of the siRNA mix |
| LumiCycle | Actimetrics | ||
| LumiCycle software | Actimetrics | ||
| CosinorJ software | EPFL | Freely available at: http://bigwww.epfl.ch/algorithms/cosinorj/ | |
| Rheodyne titan MX | ERC GmbH | Control software that controls the timing of the automated switch | |
Riferimenti
- Albrecht, U. Timing to perfection: the biology of central and peripheral circadian clocks. Neuron. 74 (2), 246-260 (2012).
- Dibner, C., Schibler, U., Albrecht, U. The mammalian circadian timing system: organization and coordination of central and peripheral clocks. Annu Rev Physiol. 72, 517-549 (2010).
- Dibner, C., Schibler, U. Circadian timing of metabolism in animal models and humans. J Intern Med. , (2015).
- Marcheva, B., et al. Circadian clocks and metabolism. Handb Exp Pharmacol. (217), 127-155 (2013).
- Philippe, J., Dibner, C. Thyroid circadian timing: roles in physiology and thyroid malignancies. J Biol Rhythms. 30 (2), 76-83 (2015).
- Andrews, J. L., et al. CLOCK and BMAL1 regulate MyoD and are necessary for maintenance of skeletal muscle phenotype and function. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (44), 19090-19095 (2010).
- McCarthy, J. J., et al. Identification of the circadian transcriptome in adult mouse skeletal muscle. Physiol Genomics. 31 (1), 86-95 (2007).
- Shostak, A., Husse, J., Oster, H. Circadian regulation of adipose function. Adipocyte. 2 (4), 201-206 (2013).
- Dallmann, R., Viola, A. U., Tarokh, L., Cajochen, C., Brown, S. A. The human circadian metabolome. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (7), 2625-2629 (2012).
- Adamovich, Y., et al. Circadian clocks and feeding time regulate the oscillations and levels of hepatic triglycerides. Cell Metab. 19 (2), 319-330 (2014).
- Chua, E. C., et al. Extensive diversity in circadian regulation of plasma lipids and evidence for different circadian metabolic phenotypes in humans. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (35), 14468-14473 (2013).
- Kalsbeek, A., Fliers, E. Daily regulation of hormone profiles. Handb Exp Pharmacol. (217), 185-226 (2013).
- Hastings, M., O’Neill, J. S., Maywood, E. S. Circadian clocks: regulators of endocrine and metabolic rhythms. J Endocrinol. 195 (2), 187-198 (2007).
- Muhlbauer, E., Wolgast, S., Finckh, U., Peschke, D., Peschke, E. Indication of circadian oscillations in the rat pancreas. FEBS Lett. 564 (1-2), 91-96 (2004).
- Marcheva, B., et al. Disruption of the clock components CLOCK and BMAL1 leads to hypoinsulinaemia and diabetes. Nature. 466 (7306), 627-631 (2010).
- Pulimeno, P., et al. Autonomous and self-sustained circadian oscillators displayed in human islet cells. Diabetologia. 56 (3), 497-507 (2013).
- Perelis, M., et al. Pancreatic beta cell enhancers regulate rhythmic transcription of genes controlling insulin secretion. Science. 350 (6261), (2015).
- Saini, C., et al. A functional circadian clock is required for proper insulin secretion by human pancreatic islet cells. Diabetes Obes Metab. , (2015).
- Perrin, L., et al. Human skeletal myotubes display a cell-autonomous circadian clock implicated in basal myokine secretion. Mol Metab. 4 (11), 834-845 (2015).
- Saini, C., Brown, S. A., Dibner, C. Human peripheral clocks: applications for studying circadian phenotypes in physiology and pathophysiology. Front Neurol. 6, 95 (2015).
- Brown, S. A., et al. Molecular insights into human daily behavior. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (5), 1602-1607 (2008).
- Asher, G., et al. SIRT1 regulates circadian clock gene expression through PER2 deacetylation. Cell. 134 (2), 317-328 (2008).
- Dibner, C. On the robustness of mammalian circadian oscillators. Cell Cycle. 8 (5), 681-682 (2009).
- Dibner, C., et al. Circadian gene expression is resilient to large fluctuations in overall transcription rates. EMBO J. 28 (2), 123-134 (2009).
- Nagoshi, E., et al. Circadian gene expression in individual fibroblasts: cell-autonomous and self-sustained oscillators pass time to daughter cells. Cell. 119 (5), 693-705 (2004).
- Sage, D., Unser, M., Salmon, P., Dibner, C. A software solution for recording circadian oscillator features in time-lapse live cell microscopy. Cell Div. 5, (2010).
- Kowalska, E., Moriggi, E., Bauer, C., Dibner, C., Brown, S. A. The circadian clock starts ticking at a developmentally early stage. J Biol Rhythms. 25 (6), 442-449 (2010).
- Mannic, T., et al. Circadian clock characteristics are altered in human thyroid malignant nodules. J Clin Endocrinol Metab. 98 (11), 4446-4456 (2013).
- Parnaud, G., et al. Proliferation of sorted human and rat beta cells. Diabetologia. 51 (1), 91-100 (2008).
- Agley, C. C., Rowlerson, A. M., Velloso, C. P., Lazarus, N. L., Harridge, S. D. Isolation and quantitative immunocytochemical characterization of primary myogenic cells and fibroblasts from human skeletal muscle. J Vis Exp. (95), e52049 (2015).
- Liu, A. C., et al. Redundant function of REV-ERBalpha and beta and non-essential role for Bmal1 cycling in transcriptional regulation of intracellular circadian rhythms. PLoS Genet. 4 (2), e1000023 (2008).
- Hughes, M. E., Hogenesch, J. B., Kornacker, K. JTK_CYCLE: an efficient nonparametric algorithm for detecting rhythmic components in genome-scale data sets. J Biol Rhythms. 25 (5), 372-380 (2010).
- Dyar, K. A., et al. Muscle insulin sensitivity and glucose metabolism are controlled by the intrinsic muscle clock. Mol Metab. 3 (1), 29-41 (2014).
- Innominato, P. F., et al. The circadian timing system in clinical oncology. Ann Med. 46 (4), 191-207 (2014).
- Chitikova, Z., et al. Identification of new biomarkers for human papillary thyroid carcinoma employing NanoString analysis. Oncotarget. 6 (13), 10978-10993 (2015).
- Pagani, L., et al. The physiological period length of the human circadian clock in vivo is directly proportional to period in human fibroblasts. PLoS One. 5 (10), e13376 (2010).
