bir Genotiplendirme<em> Staphylococcus aureus</em> Tarafından Ribozomal Spacer PCR (RS-PCR)
Summary
Here, ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is used together with a miniaturized electrophoresis system as a fast and high resolution method for genotyping S. aureus at moderate costs allowing a high throughput.
Abstract
The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, therefore, suitable to be used for routine purposes. For best resolution, data evaluation and data management, a miniaturized electrophoresis system is required. Together with such an electrophoresis system and the in-house developed software (freely available here) assignment of the pattern of bands to a genotype is standardized and straight forward. DNA extraction is simple (boiling prep), setting-up of the reactions is easy and they can be run on any standard PCR machine. PCR cycling is common except prolonged ramping and elongation times. Compared to spa typing and Multi Locus Sequence Typing (MLST), RS-PCR does not require DNA sequencing what simplifies the analysis considerably and allows a high throughput. Furthermore, the resolution for bovine strains of S. aureus is at least as good as spa typing and better than MLST or pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). The RS-PCR data base includes presently a total of 141 genotypes and variants. The method is highly associated with the virulence gene pattern, contagiosity and pathogenicity of S. aureus strains involved in bovine mastitis. S. aureus genotype B (GTB) is contagious and causes herds problems causing large costs in the Switzerland and other European countries. All the other genotypes observed in Switzerland infect individual cows and quarters. Genotyping by RS-PCR allows the reliable prediction of the epidemiological and the pathogenic potential of S. aureus involved in bovine intramammary infection (IMI), two key factors for clinical veterinary medicine. Because of these beneficial properties together with moderate costs and a high sample throughput the goal of this publication is to give a detailed, step-by-step protocol for easily establishing and running RS-PCR for genotyping S. aureus in other laboratories.
Introduction
Staphylococcus (S. aureus) sığır 1 meme içi enfeksiyon (IMI) dünya çapında sorumlu en önemli patojen olarak bilinir. 12 Avrupa ülkesinde bunun ineklerde Cosandey ve ark., 3 ve Boss ve diğ. 4 tarafından Fournier ve ark. 2 İsviçre ineklerde gösterdi ve çalışmalarla çalışma S. aureus IMI genetik olarak heterojen bir grup büyükbaş izole. 16S-23S rRNA intergenik aralayıcı bölge (RS-PCR), PCR amplifikasyonu ile, 17 genotip toplam başlangıçta 101 epidemiyolojik bağımsız izolatların 2 tespit edilmiştir. Diğer 15 genotipleri (GTs) her 1 tüm izolatların% 4, yapım nadiren meydana oysa Genotip B ve genotip C (GTC), (% 80) en sık görülen idi. Avrupa 3. seviyede, GTB, GTC, GTF, GTI ve GTR tüm analiz suşları (n = 456)% 76 içeren en önemli genotipleri vardı. GTB w Orta Avrupa'da yer alıyorduhereas diğer genotip yaygın dağıtılmıştır. Suşların kalan% 24 birçoğu, ancak, sadece bir kez gözlendi 41 genotipleri dahil.
Genotipleri çok Avrupa düzeyinde olduğu Swiss'te yanı sıra, onların virülans gen modeli ile ilişkili olduğunu Fournier ve ark. 2, Cosandey vd. 3 ve Graber vd. 5 ile çalışmalar daha gösterdi. Çalışmalar daha S. arasında IMI prevalansının büyük farklılıklar ortaya aureus GTB, GTC ve diğer genotipleri 2,5: GTB dikkate alınarak, bir sürüdeki ineklerin% 87'ye kadar bu genotip ile enfekte edildi. GTC ve diğer genotiplerinin durumda, ancak, IMI sadece sürünün 1 ila 2 ineklerde tespit edildi.
IMI S. neden aureus, normal gelen meme bezlerinin iltihaplanması süt iltihaplı hücrelerin bir artış ile sonuçlanır. Bunun bir sonucu olarak, somatik hücre koSütteki unts (SCC), çoğu ülkede süt kalitesinin önemli bir göstergedir, azalan süt fiyatı ya da teslim durağına giden artar.
Fournier ve ark., 2 RS-PCR yanı sıra, diğer yazma yöntemleri S. sığır suşları alt tiplerinin için tarif edilmiştir aureus 8-11. İki ortak olanları spa yazarak 12 ve Multi Odağı Sırası Yazma (MLST) 13 içerir. Ikinci bir 7 hazırlık geninin sıralama gerektirir, oysa önceki bir protein A stafilokok Spa kodlayan genin değişken aralayıcı bölgesini DNA dizilimi dayanır. Bu, bir 12 ve yedi PCR 13, sırasıyla özel ekipman kullanılarak amplikon saflaştırma, sıralama reaksiyonunun ve analiz, ardından yapılması gerektiği anlamına gelir. RS-PCR ile karşılaştırıldığında, bu yöntem, düşük seviyede örnek ve yüksek maliyetleri ile sonuçlanan laboratuarda önemli bir ek bir çaba gerektirir.verim PFGE için özellikle düşüktür. S. sığır suşları için bu yöntemlerin çözünürlüğü göz önüne alındığında aureus, RS-PCR, en azından MLST 4 veya PFGE 15 den 4 ve daha iyi yazarak spa kadar iyidir.
İkili yazma 13 dahil olmak üzere tüm bu yöntemler S. neden sığır IMI patogenezinde içine daha fazla bilgi elde etkinliğini gösterdi aureus, ancak çünkü söz konusu kısıtlamalar onlar büyük klinik araştırmalar için daha az uygundur. Buna ek olarak, RS-PCR yöntemi ile genotipleme Fournier ve arkadaşları tarafından tarif edildiği gibi. 2 epidemiyolojik ve S patojenik potansiyeli güvenilir bir tahmin sağlar aureus, sığır IMI klinik veteriner hekimlikte iki anahtar değerleri çıkıyor.
Protocol
Representative Results
Discussion
RS-PCR (> 30 saf DNA / tahlil ng) 'de DNA' sının aşırı olduğunda bütün prosedürün en kritik adımdır 2. Bunu tüm tepe başlangıçta başlangıç ve bitiş Genel olarak, bir profilin çözünürlüğü en uygunudur. iki tepe birbirine çok yakın ise, çözünürlük eksik. kılavuzu tanımlama gerekli olduğu şekilde, bu koşullar altında, Bioanalyzer yazılımı olmayan pik tanımlanmasına yol açabilir.
bp veya FU olarak ifade edilen tüm gözle …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The author thanks R. Boss, A. Cosandey, C. Fournier, I. Ivanovic, and J. Naskova for their excellent work.
Materials
| Tris(hydroxymethyl)-aminomethan | Merck | 1.08382.0500 | Mw =121.14g/mol |
| Titriplex III | Merck | 1.08418.0250 | Mw = 372.24g/mol; Substance is equivalent to Na2EDTA·2H2O |
| Hydrochloric acid 5mol/l | Merck | 1.09911.0001 | |
| Columbia agar+5% sheep blood | bioMérieux | 43049 | |
| Agilent DNA7500 Kit | Agilent Technologies | 5067-1504 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2940CA | |
| Agilent 2100 expert sofware | Agilent Technologies | ||
| HotStarTaq master mix | Qiagen | 203445 | |
| Primer L1 | Mycrosinth | 5'CAA GGC ATC CAC CGT3' | |
| Primer G1 | Mycrosinth | 5'GAA GTC GTA ACA AGG3' |
Riferimenti
- Sears, P. M., McCarthy, K. K. Management and treatment of staphylococcal mastitis. Vet.Clin.North Am.Food Anim.Pract. 19 (1), 171-185 (2003).
- Fournier, C., et al. Bovine Staphylococcus aureus: association of virulence genes, genotypes and clinical outcome. Res.Vet.Sci. 85 (3), 439-448 (2008).
- Cosandey, A., et al. Staphylococcus aureus genotype B and other genotypes isolated from cow milk in European countries. J.Dairy Sci. 99 (1), 529-540 (2016).
- Boss, R., et al. Bovine Staphylococcus aureus: Subtyping, evolution, and zoonotic transfer. J.Dairy Sci. 99 (1), 515-528 (2016).
- Graber, H. U., et al. Mastitis-related subtypes of bovine Staphylococcus aureus are characterized by different clinical properties. J.Dairy Sci. 92 (4), 1442-1451 (2009).
- Heiniger, D., et al. Kosten-Nutzen-Analyse einer Intervention zur Verbesserung der Eutergesundheit in Schweizer Milchviehbetrieben. Schweiz.Arch.Tierheilkd. 156 (10), 473-481 (2014).
- Hamann, J. Definition of the physiological cell count threshold based on changes in milk composition. IDF Mastitis Newsletter. 25, 9-12 (2003).
- Hwang, S. Y., Park, Y. K., Koo, H. C., Park, Y. H. spa typing and enterotoxin gene profile of Staphylococcus aureus isolated from bovine raw milk in Korea. J.Vet.Sci. 11 (2), 125-131 (2010).
- Sakwinska, O., et al. Link between genotype and antimicrobial resistance in bovine mastitis-related Staphylococcus aureus strains, determined by comparing Swiss and French isolates from the Rhone Valley. Appl.Environ.Microbiol. 77 (10), 3428-3432 (2011).
- Rabello, R. F., et al. Multilocus sequence typing of Staphylococcus aureus isolates recovered from cows with mastitis in Brazilian dairy herds. J.Med.Microbiol. 56, 1505-1511 (2007).
- Tavakol, M., et al. Bovine-associated MRSA ST398 in the Netherlands. Acta Vet.Scand. 54, 28 (2012).
- Harmsen, D., et al. Typing of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in a university hospital setting by using novel software for spa repeat determination and database management. J.Clin.Microbiol. 41 (12), 5442-5448 (2003).
- Zadoks, R., et al. Application of pulsed-field gel electrophoresis and binary typing as tools in veterinary clinical microbiology and molecular epidemiologic analysis of bovine and human Staphylococcus aureus isolates. J.Clin.Microbiol. 38 (5), 1931-1939 (2000).
- Cremonesi, P., et al. Genomic characteristics of Staphylococcus aureus strains associated with high within-herd prevalence of intramammary infections in dairy cows. J.Dairy Sci. 98 (10), 6828-6838 (2015).
- Enright, M. C., Day, N. P., Davies, C. E., Peacock, S. J., Spratt, B. G. Multilocus sequence typing for characterization of methicillin-resistant and methicillin-susceptible clones of Staphylococcus aureus. J.Clin.Microbiol. 38 (3), 1008-1015 (2000).
