후보 인자 젖 구슬과 결합하여 불 침투성 장벽의 응용 프로그램은 병아리에서 유도 신호를 공부하기

다음 프로토콜은 배양 미만 십일에 닭 배아를 사용합니다. 모든 실험은 킹스 칼리지 런던, 영국, 영국 홈 오피스 동물 관리 지침에 따라 수행되었다. 배아 조작을 병아리에 앞서 1. 준비 필수 수확과 병아리 배아 고정, 작업에 필요한 다음과 같은 수술 도구를 수집 : 5 호 워치 포셉 두 쌍의 강력한 예를 들어, 집게, 형 AA의 한 쌍, 2.5 cm 긴 블레이드 곡선 가위, 무딘 곡선 종료 박 장벽 (1.6.3)를 만드는 동안 약 0.5 cm 길이 끝이 집게, 또한 제 4 워치 포셉의 두 쌍 사용할 수 있습니다. 강철 핀에서 마이크로 칼 (에서 0.3 mm)를 만드 선명 돌에 기름을 사용하여 날카롭게. 쌍안 현미경을 사용하여, 플랫 블레이드 핀의 끝을 선명. 바늘 홀더에 핀을 삽입하고 노크와 덴되는 날카로운 끝을 보호테드. 참고 : 1,000 μL 피펫 팁과 칼을 피복이에 대한 간단한 옵션입니다. 플라스틱 세척 병에 70 % 에탄올을 준비합니다. 전에 소독하고 청소 사용 후 수술 도구와 마이크로 칼을 닦아 용지 조직에이의 물총을 사용합니다. 5cm 폭 명확한 접착 테이프와 적절한 디스펜서를 주문. 찾기 또는 측면에 닭고기 달걀를 고정하기에 적합한 휴식을 생산하고 있습니다. 확인하고 몸을 담글 구슬 저장 솔루션을 제공합니다. 30 μL 씩에 -20 ° C에서 물과 상점으로 희석하여 1 ㎎ / ㎖ 냉동 재고 섬유 아세포 성장 인자 4 (FGF4) 단백질의 0.35 ㎎ / ㎖ 용액을 준비합니다. 준비 용액 5 ㎎ / ㎖의 스톡 어두운 마이크로 원심 튜브에 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)로 희석 올 – 트랜스 – 레티노 산 (RA)의 (하나 또는 0.05, 0.1 ㎎ / ㎖). 주식 및 -20 ° C에서 100 ㎕를 분취를 저장합니다. 준비 솔루션 BMS 493 (5 중 2.5 ㎎ / ㎖) (역 AG10 ㎎ / ㎖ 재고에서 어둠의 microcentrifuge 튜브에서 DMSO로 희석의 RAR의 onist). 주식 및 -20 ° C에서 100 ㎕를 분취를 저장합니다. 알루미늄 호일에서 장벽을합니다. 참고 : 장벽을 만드는 데 사용되는 호일 (0.013 mm의 두께로 마이크로 미터로 측정) 표준 취사 호일입니다. 모든 국내 알루미늄 호일 가능성이 적합 할 것입니다. 알루미늄 호일의 1cm 사각형 조각을 잘라 조직에 70 % 에탄올로 닦아하여 소독. 6cm 멸균 플라스틱 페트리 접시에 놓습니다. 뚜껑을 취소하고 박에서 접시의 뚜껑을합니다. 참고 :이 나중에 인해 정적으로 접시의 플라스틱 뚜껑에 달라 붙는 절단 장애를 방지 할 수 있습니다. 1.6 배로 설정 배율 쌍안 현미경 스테이지 계수 선 상단의 페트리 접시를 (1 센티미터 길이 100 섹션으로 분할) 놓습니다. 15 번 블레이드 작은 메스를 사용하여, 예를 들어, 정확한 폭 0.7 mm 또는 1.3 mm를 호일의 스트립을 잘라. 호일을 분리제 4 워치 포셉 두 쌍을 사용하여 제거합니다. 그럼 특정 폭 힌지 유사한되도록 호일 장벽의 중앙에 직각 굽힘 부를 만든다. 참고 : 장벽이 모양 (10), (9)에서 가져온 것입니다. 힌지 장벽은 직선, 평면 장벽보다 더 좋은 곳으로 유지됩니다. 4 번 집게은 상대적으로 무딘 그리고 그들은 호일 장벽에 함몰 또는 성적을 덜하기 때문에 사용된다. 접시에 대 한면이 평평하고, 접시에서 가리키는 한쪽에 남아있는 포경 박을 이동 서로 페트리 접시의 중앙에 장벽까지 선. 동작 전날 20 이상의 장벽을 준비합니다. 접시 위에 호일 뚜껑을 놓고 그들이 방해되지 않습니다 장소에서 장벽을 저장합니다. 주 : 심지어 약간의 노크를 통해 장벽을 팁을하거나 접시의 측면에 고정 스틱 것을 의미 할 수있다. 38 °에서 판지 계란 트레이에 자신의 측에 수정 된 닭고기 달걀을 품어작업 하루 전에 시간의 적절한 길이 C는 배아 원하는 8 단계에있을 것 같은 것이다. 병아리 배아 및 운영의 날 구슬 2. 준비 '창'닭의 알을 배양 하였다. 참고 : 계란을 여는 다음과 같은 방법 데니스 Summerbell에 의해 통과되었다 (게시되지 않습니다). 계란이 옆에 누워 입력 AA 강한 집게는 내부 쉘 막 끊어진 것을 확인한와 계란의 뭉툭한 끝 (공기 주머니 끝을) 피어스. 포셉 단단히 함께이 파악을하고 무료 손으로 계란을 잡고 제어 찌르는 모션을 사용합니다. 여전히 수평 축을 따라 180 °를 통해 전원을 켜고 맨이었다 측이 다음 트레이에 지금이되도록 계란 트레이에 교체 (한 쪽) 두 손에 옆에 누워 계란을 가져 가라. 참고 :이 쉘 막으로부터 배아를 풀어과 배아가 있음을 의미합니다 제작배아 상기 쉘을 제거 할 때, SS는 가능성이 절단된다. 약 5cm 광장 분명 테이프의 조각을 가지고 계란을 열 때 배아에 무너져에서 달걀 껍질을 중지 계란의 최상부 표면에 밀접하게이 막대기. 공기가 바로 아래에 놓여 배아 위에 계란 (입력 할 수 있도록 부드럽게 껍질과 계란의 최상부의 중심에서의 막 돌파하기 위해 곡선 가위를 사용하여, 가위 중 하나 블레이드와 매우 작은 구멍을 셸의 최상부). 참고 : 그냥 쉘에서 약 0.5 cm를 계란 들어가는 공기가 쉘에서 배아를 분리하고 배아는 노른자 위에 나머지 올 것이다, 배아를 덮고있는 쉘 세포막을 파괴하고 세포막의 파괴하지 않음으로써 . 약 1cm의 직경 원에 껍질에 구멍을 확대하기 위해 곡선 가위를 사용합니다. A의 계란에 구멍을 적출 쉘의 조각을 제거하고 커버분명 테이프의 조각 약 5cm 광장. 쉽게 테이프를 제거하려면, 무료 남은 테이프를 떠나, 단지 구멍의 입술에 그것을 스틱 테이프를 누릅니다. 무료 테이프는 다음 달걀 봉인을 해제 파악할 수있다. 단계의 배아 38 ° C 및 윈도우 (2.1 단계) (단계 1.7 참조)에서 배양 한 후, 8 항에 병아리 배아를 준비하는 쌍안 현미경을 사용합니다. 계란은 윈도우 다음 밀봉하기 직전에이 작업을 수행합니다. 달걀 껍질의 각 배아의 단계를 작성합니다. 인큐베이터에 달걀을 돌려줍니다. 주 : 8과 15 사이의 단계에서 배아가 장벽 비드 실험에 적합하다. 배아는 너무 오래 전에 작동을위한 인큐베이터에서 제외되지 않은 경우 생존 가능성이 더 높습니다. 이전 작업에 잠기기 구슬. FGF4 1000 μL 피펫 팁의 단부에 부착 친화도 크로마토 그래피, 겔 비드의 개수 (150-300 μm의)를 가지고 있었다미세 원심 분리 튜브에 1 ㎖의 인산 완충 식염수 (PBS)에서 H들을 그들이 5 초. 원심 분리기에 저장된 지드를 제거하고 PBS를 버리고 두 번 처리를 반복한다. 30 분 동안 얼음에 멸균 페트리 접시에 0.35 ㎎ / ㎖ FGF4 단백질의 30 μl의 드롭에 겔 비드를 만끽 해보세요. 배아에 번호로 삽입 5 microforceps을 직경 약 150 μm의 구슬을 선택합니다. 참고 : 구슬이 과민하고 너무 꽉 압착 깨질 수 있기 때문에 5 번 microforceps 매우 부드럽게 그립을 사용하여 다음 단계에 사용되는 이온 교환 수지 구슬을 처리합니다. 이 경고는 2.3.2-2.3.3 모든 수지 비드 작업에 적용됩니다. RA 0.05 또는 0.1 mg을 나누어지는을 해동 / 모든 트랜스-RA는 DMSO로 희석하고, 이전에 빛에서 RA를 보호하기 위해 호일에 덮여있다 멸균 페트리 접시 (9cm 직경)에 100 ㎕를 드롭 배치 ml로. 10 μL 피펫 팁을 가지고 어떤 염화 형태의 이온 교환을 데리러그 단부에 수지 비즈 및 20 분 동안 실온에서 빛으로부터 보호 RA 강하 이러한 소크. 적어도 1cm 간격 같은 페트리 접시에 배치 둘 베코의 수정 독수리 중간 (DMEM) μL (100)의 3 개의 연속 방울 구슬을 씻어. 참고 : 구슬이 DMEM에서 페놀 빨간색 염료를 차지합니다. 이 방법은도 5에 기초한다. 구슬을 유지하기 위해 페트리 접시와 5 호 microforceps에서 현미경 스테이지 계수 슬라이드를 사용하여 배아에 삽입, 약 100 μm의 직경 (젖어 비즈 75-180 μm의에서 크기가 다양합니다) 구슬을 선택합니다. 페트리 접시 위에 100 μL의 DMEM 방울, 비드 아래 첫 번째 장소에서 비드를 따기와 드롭 아웃 비드를 눌러 또는 모세관 (다음 비드에 폐쇄 집게를 배치하여 하나 그것에서 남아있는 DMEM를 제거 할 때 조치는) 비드에서 멀리 액체를 그립니다. BMS 493 적경 (2.3.2)에 관해서는, 이온 EXCH을 흡수20 분 동안 실온에서 DMSO의 BMS 493 ㎖의 2.5 또는 5.0 mg을 100 μL 드롭 / 앤지에서 수지 비드는 DMEM 100 ㎕ 방울로 헹군다. 배아에 삽입 구슬 약 100 μm의 직경을 선택합니다. DMSO 제어 적경 (2.3.2)에 관해서는, 다음 DMEM 100 ㎕ 방울로 헹구고 20 분 동안 실온에서 DMSO의 100 μL 강하 이온 교환 수지 비드 소크. 배아에 삽입 구슬 약 100 μm의 직경을 선택합니다. 3. 장벽과 구슬 운영 그림 어디 장벽 및 또는 구슬을 배치해야 표시 여러 단계의 병아리 태아의 1. 회로도. presump에서 somites와 LPM 사이 (A) 스테이지 13 병아리 배아 개략적으로 보여주는 장벽 위치 (녹색 선)적인 날개 수준 (15 ~ 20을 somites). RA 비드 (적색 원)이 배리어 삽입에 앞서 배치 될 위치를 나타내는 (B) (A)와 동일한 개략도. (C) 단계 15 배아의 추정 다리 레벨 (somites 26-32)에서 도식 보여주는 장벽 위치 (녹색 선). RA 비드 (적색 원)이 배치 될 위치를 나타내는 (D) (C)에서와 동일한 개략도. (E) 도식 BMS 493 비즈 (보라색 원)가 단계 15 배아의 LPM에 배치 할 위치를 나타냅니다. (F)을 추정 날개 수준에서 presomitic 중배엽과 LPM 사이의 장벽 위치 (녹색 선)를 나타내는 단계 9 병아리 배아의 개략도. (G) 장벽 (녹색 선) 및 RA 비드 (빨간색 원)의 위치를 나타내는 단계 9 배아의 개략도. (H)를 추정 다리 수준에서 차단 위치 (녹색 선)을 보여주는 스테이지 (10) 병아리 배아의 개략도. (I </st룽>) 스테이지 (10) 다리 레벨 LPM에서 BMS 493 비드 위치 (보라색 원)를 보여주는 개략도. 이 그림은 7에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 배리어는 날개 꽃 봉오리 개시를 방지하기 위해 단계 (13)에 삽입. 인큐베이터에서 단계 13 배아를 가지고 3.2X 배율 또는 원하는 경우 이상으로 설정 쌍안 현미경 달걀 받침대의 계란을 배치합니다. 분명 테이프의 상위 계층을 제거합니다. 강철 마이크로 칼을 이용하여, 난황 막 및 배아 우측 somites 15 ~ 20 (도 1a)에 인접하는 측판의 중배엽 (LPM)를 통해 절개를 (somites이 단계에서 형성된 모든있다). 형성 마지막 네 somites에 인접 잘라 꼬리 쪽 절단이 체절 길이를 계속합니다. 제 5 호 microfo과 (0.7-1 mm 폭) 장벽을 선택페트리 접시로부터 돌출 끝에 rceps 절개에 배리어의 자유 단부를 삽입하기 위해 핸드 트위스트. 경첩 모양의 장벽는 somites에 절개 말단을 통해 아래쪽으로 돌출의 절반으로 LPM 위의 난황 막에 평평하게 놓여있다. 가능한 한 빨리 명확한 테이프로 계란을 밀봉 인큐베이터로 돌아갑니다. 주 : 마이크로 나이프와 집게는 난황 막과 접촉에 스티커된다. 후속 작업을 시도하기 전에 70 % 에탄올으로 깨끗이 닦아하는 것이 중요하다. 이 이후의 모든 작업 설명에 적용 주입 비드 할 수 있습니다. 비드는 배리어와 함께 삽입 할 수있는 경우; 첫째, 제 5 호 microforceps의 구슬을 가지고 절개의 말단 측의 LPM의 절단 얼굴에 삽입 한 후 비드 (그림 1B)에 절개 근위부에 장벽을 삽입합니다. 계란을 밀봉하고 인큐베이터에 즉시 반환. </li> 배리어 다리 꽃 봉오리 개시를 방지하기 위해 스테이지 (15)에 삽입. 주 : TBOX 4 전사 인자 (Tbx4) 식에이 연산의 결과의 일례는도 2D 및 2E에 도시되어있다. 인큐베이터에서 단계 15 배아를 가지고 3.2X 배율 또는 원하는 경우 이상으로 설정 쌍안 현미경 달걀 받침대의 계란을 배치합니다. 분명 테이프의 상위 계층을 제거합니다. 강철 마이크로 나이프를 사용하여 배아 우측 somites 26-32 (도 1C)에 인접한 난황 막 및 LPM 통해 절개를 (somites이 단계에서 형성된 모든있다). 형성 마지막 두 somites에 인접 잘라 꼬리 쪽 절단 오 체절 길이를 계속합니다. 일단 5 호 microforceps와 장벽 (1.2-1.3 mm 폭)를 선택하고 절개로 끝을 삽입 할 장벽을 트위스트. 가능한 한 빨리 명확한 테이프 A의 계란을 밀봉차 인큐베이터로 돌아갑니다. 참고 : 장벽 모양의 힌지는 그것의 절반은 somites에 절개 말단을 통해 아래쪽으로 돌출와 LPM 위의 난황 막에 평평하게 놓여있다. 비드는 배리어와 함께 삽입 할 경우, 우선, 제 5 microforceps에 비드를 가지고 절개의 선단 측에 LPM의 절단면에 삽입 한 다음에 절개 근위로 배리어를 삽입 비드 (그림 1D). 계란을 밀봉하고 인큐베이터에 즉시 반환. 구슬이나 비즈, 장벽없이 삽입 할 경우 예를 들어, 스테이지 (15)의 다리 지역 BMS 493 비즈, 긴 절개 (3.2.2.1)를하지 않습니다. 난황 막을 통해 비드가 ​​배치되는 위치에서의 LPM에 작은 절개 부위를 만든다. 제 5 호 microforceps의 비드를 타고 LPM의 구멍에 삽입합니다. 포셉 (그림 1E)의 폐쇄 끝으로 조금 더에 밀어 넣습니다. </리> 배리어는 날개 꽃 봉오리 유도 및 개시를 방지하기 위해 스테이지 (9)에 삽입. 단계 8 인큐베이터에서 9 배를 타고 선호하는 경우 3.2X 배율 이상으로 설정 쌍안 현미경 달걀 받침대의 계란을 배치합니다. 강철 마이크로 칼을 사용하여 난황 막 통해 절개를하고 LPM somites에 맞춰 배아의 꼬리 끝에, 원시 행진에 측면과 주동이 (그림 1 층) 약 5 체절 긴 길이. 페트리 접시에서 튀어 나온 말에 5 번 microforceps와 장벽 (0.7-1 mm 폭)를 선택하고 절개로 장벽의 끝을 삽입하기 위해 손을 비틀어. 가능한 한 빨리 명확한 테이프로 계란을 밀봉 인큐베이터로 돌아갑니다. 참고 : 장벽 모양의 힌지는 그것의 절반은 절개를 통해 아래쪽으로 돌출와 LPM 위의 난황 막에 평평하게 놓여있다. 비드는 inserte 될 경우장벽과 함께 D; 첫째, 제 5 호 microforceps의 구슬을 가지고 절개의 말단 측의 LPM의 절단 얼굴에 삽입 한 후 비드 (그림 1G)에 절개 근위부에 장벽을 삽입합니다. 계란을 밀봉하고 인큐베이터에 즉시 반환. 배리어 다리 봉오리 유도 및 개시를 방지하기 위해 스테이지 (10)에 삽입. 주 : Tbx4 발현이 작업의 결과의 일례는도 2G에 도시된다. 인큐베이터에서 단계 10 배아를 가지고 3.2X 배율 또는 원하는 경우 이상으로 설정 쌍안 현미경 달걀 받침대의 계란을 배치합니다. somites에 맞춰 배아의 꼬리 끝에, 강철 마이크로 칼은 원시적 인 행진에 측면 난황 막과 LPM을 통해 절개를 사용하여 (그림 1H) 약 6 체절 긴 길이. (1.2 장벽 픽업mm 페트리 접시에서 돌출 단부 제 5 microforceps)와 폭 손 트위스트 절개에 배리어의 자유 단부를 삽입한다. 가능한 한 빨리 명확한 테이프로 계란을 밀봉 인큐베이터로 돌아갑니다. 참고 : 장벽 모양의 힌지는 그것의 절반은 절개를 통해 아래쪽으로 돌출와 LPM 위의 난황 막에 평평하게 놓여있다. 비드가 장벽없이 삽입되는 경우 예를 들어, 스테이지 (10)의 다리 영역 BMS 493 비드, 난황 막을 통해 비드가 배치되는 위치에서의 LPM에 작은 절개 부위를 만든다. 제 5 호 microforceps의 비드를 타고 LPM의 구멍에 삽입합니다. 포셉 (그림 1I)의 폐쇄 끝으로 조금 더에 밀어 넣습니다. 신흥 반대측 사지 싹 비하여 배리어의 위치를 ​​확인 조작 후 24 시간 이상이다. 배리어 명확 oppos되지 않은 모든 배아 폐기왼쪽 사지 버드 ITE. 이 경우, 배리어 잘못 배치되었다. 제자리 교잡에서 Wholemount 4. 수확 배아, 고정 및 준비 (WISH) 수확 배아는 작업을 게시 할 수 있습니다. 단계 19-23에서 수확 배아 사지 꽃 봉오리의 형태가 명확하게 모두 운영과 반대측 제어 측면에서 볼 수 있도록. 사용 곡선 가위는 달걀 껍질에 큰 구멍을 잘라. microforceps와 배아의 왼쪽에있는 큰 혈관을 유지하면서 배아 주위를 잘라. 배아를 제거하고 인산염 완충 식염수 (PBS)의 pH 7.3의 페트리 접시에 배치하는 선박의이 그립을 사용합니다. 쌍안 현미경, 아니 및 곡선 위의 조합을 사용하여 여분의 배아 혈관 세포막을 멀리 해부하다. 5 microforceps. 가위를 사용하여 헤드를 제거합니다. 배아의 고정 수확을 게시 할 수 있습니다. 곡선 blun 사용t 집게는 배아를 들어서 두 개의 시간이 스크류 캡 후 4 ℃에서 하룻밤 동안 20 ml의 유리 병에서 요동하고, 실온에서 PBS 5 ml의 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)에 배치. 주의 : PFA 건강에 심각한 위험이 있습니다. 이는 유해한 부식성 자극이고, 분말, 피부, 눈, 폐와 접촉하는 것을 방지해야한다. 솔루션을 준비하는 동안 개인 보호 복 및 흄 후드를 사용합니다. 이 4 % 용액, 장갑, 눈 보호 및 실험실 코트를 일단 착용해야합니다. 참고 : 빨리에 가장 수정으로 배아를 얻을 mRNA의 무결성을 유지하는 것이 중요하다. 현장 하이브리드에 wholemount하기 전에 장벽의 제거. 주 :이 날카로운 그들이 현장 하이브리드 프로토콜의 통과로 배아를 손상시킬 수 있기 때문에 장애는 여러 배아가 한 번에 염색 특히, 제거됩니다. 고정에 이어, 양안 마일에서 PBS의 접시에 배아를 배치croscope. 제 5 호 microforceps 두 쌍을 사용하여 배아의 운영 측면에서 밀접한 장벽의 양쪽을 왼쪽 쌍을 배치합니다. 우측 쌍의 배리어를 잡고 부드럽게 배아를 유지하고이 제거 될 때 배리어에 부착되는 임의의 조직을 방지하기 위해, 왼쪽 쌍을 사용하여 배아로부터 장벽을 당긴다. (11)에 설명 된대로 본질적 위시을 수행하십시오.