Aday Faktörü Soaked Boncuk ile birlikte Geçirimsiz Engelleri Uygulama Chick Endüktif Sinyalleri Eğitim için

Aşağıdaki protokol inkübasyon daha az on gün tavuk embriyoları kullanılır. Tüm deneyler King College London, İngiltere ve Birleşik Krallık Home Office hayvan bakımı kurallarına uygun olarak yapıldı. Embriyo Operasyonu Chick önce 1. Hazırlık Gerekli Hasat ve civciv embriyolar sabitlemek için, işlemleri için gerekli aşağıdaki cerrahi aletler toplayın: Hayır 5 saatçiler forseps İki çift, güçlü örneğin forseps, tip AA bir çift, 2.5 cm uzunluğunda bıçak ile kavisli makas, künt kavisli sona erdi folyo engelleri (1.6.3) yaparken yaklaşık 0,5 cm uzunluğunda uçları forseps, hem de 4 numaralı saatçiler forseps iki çift kullanmak için. Bir çelik pim bir mikro bıçak (karşısında 0,3 mm) yapmak bir bileme taşı yağ kullanarak keskin. binoküler mikroskop kullanarak, düz bir bıçak pimi ucunu keskinleştirmek. Bir iğne tutucu pimi yerleştirin ve çaldı ve den olmaktan keskin ucunu korumakTed. NOT: 1000 ul pipet ile bıçağı mantolama Bunun için basit bir seçenektir. plastik yıkama şişe% 70 etanol hazırlayın. öncesi ve sterilize ve onları temizlemek için kullanımdan sonra cerrahi aletler ve mikro bıçak silmek için kağıt dokusu üzerinde bu bir bücür kullanın. 5 cm genişliğinde açık yapışkan bant ve uygun bir dağıtıcı satın alın. Bul veya yan bir tavuk yumurtası sabit tutmak için uygun bir dinlenme üretmekteyiz. Yapmak ve ıslatma boncuk mağaza çözümleri. 30 ul alikotları -20 ° C'de su ve mağaza ile seyreltilerek 1 mg / ml dondurulmuş stoktan Fibroblast Büyüme faktörü 4 (FGF4) proteinin bir 0.35 mg / ml çözeltisi hazırlayın. Hazırlama çözeltiler, 5 mg / ml stok koyu mikrosantrifüj tüplerinde dimetil sülfoksit (DMSO) ile seyreltilmiş ve all-trans-retinoik asit (RA) (ya da 0.05 ya da 0.1 mg / ml). stok ve -20 ° C 'de 100 ul alikotları saklayın. Hazırlama çözeltiler BMS 493 (ya da 2.5 ya da 5 mg / ml) (ters ag10 mg / ml stok koyu mikrosantrifüj tüpleri içinde DMSO ile seyreltildi RARlar bölgesinin onist). stok ve -20 ° C 'de 100 ul alikotları saklayın. aluminyum folyodan engelleri yapın. NOT: engelleri yapmak için kullanılan folyo (0.013 mm kalınlığında olarak mikrometre ile ölçülen) standart ikram folyo olduğunu. Herhangi bir iç alüminyum folyo olasılıkla uygun olacaktır. alüminyum folyo 1 cm kare parça kesin ve bir doku üzerinde% 70 etanol ile silerek sterilize. 6 cm steril plastik Petri kabı üzerine yerleştirin. Kapağı atın ve folyodan yemek için bir kapak yapmak. NOT: Bu daha sonra nedeniyle statik çanak plastik kapakla yapışmasını kesme bariyerleri önleyecektir. 1.6x ayarlanmış büyütme ile bir binoküler mikroskop altında bir sahne mercek ağı üstünde Petri kabı (1 cm uzunluğunda 100 bölümlere ayrılmıştır) yerleştirin. Bir No.15 bıçak küçük neşter kullanılarak, örneğin, tam bir genişliğe 0.7 mm veya 1.3 mm folyo şeritler kesti. folyo ayırınNo 4 saatçiler forseps iki çift kullanarak şeritler. Daha sonra özel bir genişliğe sahip bir menteşe benzer şekilde, folyo engel merkezinde dik açılı kıvrım oluşturur. Not: bariyer Bu şekil, 10, 9 alınır. Menteşeli bariyer düz, yassı bariyer daha iyi yerde kalır. No 4 forseps görece künt ve onlar folyo engelleri ezikler veya puanlar yapmak için daha az olasıdır, çünkü kullanılır. çanak karşı bir tarafı düz ve çanak dışına yukarı bakacak bir tarafa kalan kesilmemiş folyoyu hareketli diğer Petri kabı merkezinde engelleri hizaya getirin. ameliyat gününden önce 20 ya da daha fazla engelleri hazırlayın. çanak üzerine folyo kapağı yerleştirin ve rahatsız olmayacak bir yerde engelleri saklayın. NOT: Hatta hafif bir vuruş üzerinde engelleri ipucu ya da yemeğin yanlarına statik sopa ile anlamına gelebilir. 38 ° karton yumurta tepsileri kendi yüzüne döllenmiş tavuk yumurtası inkübeAmeliyat günü zaman önce uygun uzunlukta C embriyolar istenen 8 aşamasında olacak şekilde. Civciv Embriyolar ve Operasyon gününde Boncuk 2. Hazırlık 'Pencere' tavuk yumurtası inkübe edildi. NOT: yumurta açılması için aşağıdaki yöntem Dennis Summerbell tarafından kabul edildi (yayımlanmamıştır). Yumurta yan yatarken, Tip AA güçlü forseps iç kabuk zarı bozuldu emin olan yumurtanın künt ucu (hava kesesi sonu) delmek. forseps sıkıca birlikte bu kavrayışa yapmak ve serbest el ile yumurta tutarken kontrollü bir bıçaklama hareketi kullanın. Hala yatay eksen boyunca 180 ° çevirin ve üst oldu yan yanındaki tepsiye şimdi öyle ki yumurta tepsiye yerleştirin (bir ya da yan) iki eliyle, yan yatarken, yumurta atın. NOT: Bu kabuk zarlarının embriyo gevşetir ve embriyo olduğu anlamına gelecektir leembriyo üzerinde kabuk kaldırıldığında ss olasılıkla kesilecek. yaklaşık 5 cm kare net bir parça bant alın ve yumurta açıldığında embriyo üzerine dağılan gelen yumurta kabuğu durdurmak için yumurta üst yüzeyinde yakından bu sopa. hava hemen altında yatan embriyo üzerinde yumurta (girebilirsiniz böylece nazikçe kabuk ve yumurta üst kısmının merkezinde kendi membranların kırmaya kavisli makas kullanın, makas bir bıçak ile çok küçük bir delik açın kabuğun üst kısmı). NOT: Sadece kabuğu yaklaşık 0.5-1 cm yumurta giren hava kabuğundan embriyo ayıracak ve embriyo sarısı üstüne kalanı gelecek, embriyo kapsayan kabuk zarları kırma ve membranların herhangi kırarak değil By . yaklaşık olarak 1 sm bir çapı olan bir çevreye kabuk deliği büyütmek için kavisli makas kullanın. Bir ile yumurta delik eksize kabuğun parçası kaldırmak ve kapaknet bant parçası yaklaşık 5 cm kare. kolayca bu bantı çıkarmak için, serbest kalan bandı bırakarak, sadece deliğin dudak de sopa bant basın. ücretsiz bant daha sonra yumurta açmak için kavranabilir. Sahne embriyolar 38 ° C ve pencereleme (adım 2.1) (adım 1.7 bakınız) kuluçkadan sonra 8'e göre piliç embriyoları sahneye binoküler mikroskop kullanıyoruz. yumurta pencereleme aşağıdaki mühürlü hemen önce bunu yapın. kabuğu her embriyo aşamasına yazın. inkübatör yumurta dönün. Not: 8 ile 15 arasında aşamalarında Embriyolar engelleyici ve kordon deneyler için de uygundur. Embriyolar onlar çok uzun öncesinde operasyon için inkübatör dışına bırakılmış değil eğer hayatta kalmak için daha olasıdır. Ameliyat öncesi ıslatma boncuklar. FGF4 1.000 ul pipet sonuna sopa afinite kromatografisi jel boncukları sayısını (150-300 mikron) alın ve oldumikrosantrifüj tüpü içinde, 1 ml fosfat tamponlu serum fizyolojik (PBS) içinde H bunları, bunlar 5 sn. Santrifüj depolanan azid kaldırma PBS atmak ve iki kez işlemi tekrarlamak. 30 dakika boyunca buz üzerinde, steril bir Petri tabağına 0.35 mg / ml FGF4 proteinin bir 30 ul damla jel boncukları bekletin. embriyonun içine No ile yerleştirilmesi için 5 microforceps çapında yaklaşık 150 mikron boncuk seçin. NOT: boncuk kırılgandır ve çok sıkı sıkılmış eğer paramparça çünkü No 5 microforceps ve çok yavaşça kavrama onları aşağıdaki adımlarda kullanılan iyon değişim reçinesi boncuk tutun. Bu uyarı 2.3.2-2.3.3 ve tüm reçine boncuk işlemleri için de geçerlidir. RA 0.05 ve 0.1 mg bir kısım defrost / all-trans-RA DMSO ile seyreltildi ve daha önce ışıktan RA korumak için folyo ile kaplanmış olan steril bir Petri kabı (9 cm çapında), bir 100 ul damla yer ml. 10 ul pipet alın ve bazı klorür formu iyon değişimi pick upBunu ucunda reçine boncukları ve 20 dakika boyunca oda sıcaklığında ışıktan korunur RA damla bu bekletin. en az 1 cm uzağa aynı petri tabağına yerleştirilir Dulbecco Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı (DMEM) ul 100 birbirini takip eden üç damla boncuk durulayın. NOT: boncuk DMEM fenol kırmızı boya alma. Bu yöntem 5 dayanmaktadır. boncuk tutmak için Petri kabı ve No.5 microforceps altında bir mikroskop sahne graticule slayt kullanarak embriyonun içine sokulmaya, yaklaşık 100 mikron çapındadır (ıslak boncuk 75-180 mikron boyutu aralığı) boncuk seçin. Petri kabı üzerine 100 ul DMEM damla, boncuk aşağı ilk etapta gelen boncuğu alıp damla dışarı boncuk iterek veya kılcal (sonraki boncuk kapalı forseps koyarak ya ondan kalan DMEM kaldırdığınızda eylem) boncuk uzak sıvıyı çeker. BMS 493 RA (2.3.2) gelince, iyon DEĞİŞ emmek20 dakika boyunca, oda sıcaklığında, DMSO içinde, BMS 493 ml 2.5 veya 5.0 mg, 100 ul damla / in ange reçine boncukları daha sonra DMEM 100 ul damlalar içinde durulayın. embriyonun içine sokulması için boncuk yaklaşık 100 mikron çapındadır seçin. DMSO kontrolü RA (2.3.2) için olduğu gibi, daha sonra DMEM 100 ul damlalar içinde durulayın 20 dakika boyunca oda sıcaklığında bir DMSO 100 ul damla iyon değişim reçine boncuklarını ıslatın. embriyonun içine sokulması için boncuk yaklaşık 100 mikron çapındadır seçin. 3. Bariyer ve Boncuk İşlemleri Şekil nerede Engeller ve ya Boncuk Olmalı Gösterilen Farklı Aşamaları Chick Embriyolar 1. Şemalar. Presump de Somitlerin ve LPM arasında (A) Aşama 13 civciv embriyo şematik gösteren bariyer pozisyonu (yeşil hat)tif kanat seviyesi (15-20 Somitlerin). RA boncuk (kırmızı daire) bariyer yerleştirilmeden önce konulmalıdır nereye gösteren (B), (A) aynı şematik. (C) bir sahne 15 embriyo içinde olası bacak seviyesinde (Somitlerin 26-32) de şematik gösteren bariyer pozisyonu (yeşil hat). RA boncuk (kırmızı daire) konulmalıdır nereye gösteren (D) (C) aynı şematik. (E) Şematik BMS 493 boncuk (mor daireler) bir sahne 15 embriyo LPM konulmalıdır nereye göstermektedir. (F) olası kanat düzeyinde presomitic mezoderm ve LPM arasında bariyer konumunu (yeşil hat) gösteren bir sahne 9 civciv embriyo şematik diyagramı. (G) bir bariyer (yeşil hat) ve RA boncuk (kırmızı daire) konumlarını gösteren bir sahne 9 embriyonun şeması. (H) olası bacak seviyesinde bariyer pozisyonu (yeşil hat) gösteren bir sahne 10 civciv embriyo şematik diyagramı. (I </stRong>) aşama 10 bacak seviyesi LPM BMS 493 boncuk pozisyonu (mor daire) gösteren şematik. Bu şekil 7 ile modifiye edilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. Bariyer kanat tomurcuk başlamasını önlemek için aşamada 13 eklenir. inkübatör bir sahne 13 embriyo alın ve 3.2X büyütme ya da tercih edilirse daha yüksek ayarlanmış bir binoküler mikroskop altında bir yumurta kalanı yumurta yerleştirin. net bant üst katmanı kaldırın. Bir çelik mikro bıçak kullanarak, vitellin membran ve embriyonun sağ tarafındaki Somitlerin 15 ila 20 (Şekil 1A) bitişik yan plaka mezoderm (LPM) üzerinden bir kesi yapmak (Somitlerin bu aşamada oluşmuş değil hepsi var). oluşan son dört Somitlerin bitişik kesin ve kaudal kesik iki hücre gruplarının uzunlukları devam ediyor. No: 5 microfo ile (0,7-1 mm genişliğinde) bariyer Pick upPetri kabı çıkıntılı sonunda rceps ve kesi içine bariyer serbest ucunu eklemek için elini bükün. Menteşe şeklinde engeli Somitlerin için kesi distalinde aşağı doğru çıkıntılı yarısı LPM yukarıdaki vitellin membran üzerine düz yatıyor. En kısa sürede şeffaf bir bantla yumurta kadar mühür ve inkübatör geri. NOT: Mikro bıçak ve forseps vitellin membran ile temas yapışkan hale gelir. Sonraki çalıştırmaya başlamadan önce% 70 etanol ile onları silin önemlidir. Bu sonraki tüm işlem açıklamaları için geçerlidir ve implantasyonu boncuk için. bir kordon, bir bariyer ile birlikte eklenir ise; öncelikle, No 5 microforceps içinde boncuk alıp kesi uzak tarafında LPM kesme yüzüne takın ve daha sonra boncuk (Şekil 1B) için kesi proksimal içine bariyer yerleştirin. yumurta Seal ve inkübatör derhal iade edin. </li> Bariyer bacak tomurcuk başlamasını önlemek için aşamada 15 eklenir. Not: TBox 4 transkripsiyon faktörü (Tbx4) ifadesi üzerindeki Bu işlemin sonucu bir örneği, Şekil 2 ve 2E'de gösterilmektedir. inkübatör bir sahne 15 embriyo alın ve 3.2X büyütme ya da tercih edilirse daha yüksek ayarlanmış bir binoküler mikroskop altında bir yumurta kalanı yumurta yerleştirin. net bant üst katmanı kaldırın. Bir çelik mikro bıçak kullanarak embriyonun sağ tarafındaki Somitlerin 26-32 (Şekil 1C) bitişik vitellin membran ve LPM üzerinden bir kesi yapmak (Somitlerin bu aşamada oluşmuş değil hepsi var). oluşan son iki Somitlerin bitişik kesin ve kaudal kesik beş somite uzunlukları devam ediyor. bir ucunda No 5 mikroforcepslerle bariyer (1.2-1.3 mm genişliğinde) Pick up ve kesi içine serbest ucu eklemek için bariyer bükün. En kısa sürede net bant a ile yumurta kadar mühürnd inkübatör iade. NOT: bariyer şeklindeki menteşe bunun yarısı Somitlerin için kesi distalinde aşağı doğru çıkıntılı LPM yukarıdaki vitellin membran üzerine düz yatıyor. Bir boncuk bir bariyer ile birlikte eklenecek ise, öncelikle, No 5 microforceps içinde boncuk alıp kesi uzak tarafında LPM kesme yüzüne takın ve daha sonra kesi proksimal içine bariyer yerleştirin boncuk (Şekil 1D). yumurta Seal ve inkübatör derhal iade edin. Bir boncuk veya boncuk, bir engel olmadan eklenecek ise, örneğin, sahnede 15 bacak bölgeye BMS 493 boncuk, uzun bir kesi (3.2.2.1) yapmazlar. Vitellin zarından ve boncuk yerleştirileceği konumunda LPM içine küçük bir kesi yapmak. No 5 microforceps içinde boncuk alın ve LPM deliğe takın. Forseps (Şekil 1E) kapalı uçları biraz daha itin. </li> Bariyer kanat tomurcuk indüksiyon ve başlamasını önlemek için aşamada 9 eklenir. Bir sahne 8 veya inkübatör 9 embriyo alın ve tercih Eğer 3.2X büyütme veya daha yüksek olarak ayarlanmış bir binoküler mikroskop altında bir yumurta kalanı yumurta yerleştirin. Bir çelik mikro bıçak kullanarak vitellin zarından bir kesi yapmak ve LPM Somitlerin doğrultusunda embriyonun kaudal ucunda, ilkel çizgi yanal ve rostral (Şekil 1F) yaklaşık 5 hücre gruplarının uzun uzunlukları. Petri kabı çıkıntılı sonunda No. 5 mikroforcepslerle bariyer (0,7-1 mm genişliğinde) Pick up ve kesi içine bariyer serbest ucunu eklemek için elini bükün. En kısa sürede şeffaf bir bantla yumurta kadar mühür ve inkübatör geri. NOT: bariyer şeklindeki menteşe yarısı kesiden aşağıya çıkıntılı LPM yukarıdaki vitellin membran üzerine düz yatıyor. bir kordon inserte olması isteniyorsabir engel ile bağlantılı olarak D; öncelikle, No 5 microforceps içinde boncuk alıp kesi uzak tarafında LPM kesme yüzüne takın ve daha sonra boncuk (Şekil 1G) için kesi proksimal içine bariyer yerleştirin. yumurta Seal ve inkübatör derhal iade edin. Bariyer bacak tomurcuk indüksiyon ve başlamasını önlemek için aşamada 10 eklenir. NOT: Tbx4 ifadesi üzerindeki Bu işlemin sonucu bir örneği Şekil 2G'de gösterilmektedir. inkübatör bir sahne 10 embriyo alın ve 3.2X büyütme ya da tercih edilirse daha yüksek ayarlanmış bir binoküler mikroskop altında bir yumurta kalanı yumurta yerleştirin. Somitlerin doğrultusunda embriyonun kaudal ucunda, bir çelik mikro bıçak ilkel çizgi lateral vitellin membran ve LPM üzerinden bir kesi yapmak kullanarak (Şekil 1H) yaklaşık 6 hücre gruplarının uzun uzunlukları. (1.2 bariyer Pick upmm petri çıkıntılı sonunda No. 5 mikroforcepslerle) genişliğinde ve eli bükmek kesi içine bariyer serbest ucunu eklemek için. En kısa sürede şeffaf bir bantla yumurta kadar mühür ve inkübatör geri. NOT: bariyer şeklindeki menteşe yarısı kesiden aşağıya çıkıntılı LPM yukarıdaki vitellin membran üzerine düz yatıyor. Bir boncuk, bir engel olmadan eklenir ise, örneğin, aşama 10 bacak bölgesine BMS 493 boncuk, Vitellin membrandan ve boncuk yerleştirileceği konumunda LPM küçük bir kesi yapmak. No 5 microforceps içinde boncuk alın ve LPM deliğe takın. Forseps (Şekil 1I) kapalı uçları biraz daha itin. Gelişmekte olan kontralateral kol tomurcuk ile karşılaştırıldığında bariyerin pozisyonunu kontrol çalıştıktan sonra 24 saat ya da daha fazla. Bariyer açık oppos olmayan her hangi bir embriyolar atınSol bacak tomurcuk ite. Bu durumda bariyer yanlış konumlandırılmıştır. İn Situ Hibridizasyon Wholemount 4. Hasat Embriyolar, Fiksasyon ve Hazırlama (DİLERİZ) Hasat embriyolar operasyonu sonrası. aşamada 19-23 Hasat embriyolar uzuv tomurcuk morfolojisi açıkça hem işletilen ve kontralateral kontrol tarafı görünür şekilde. Kullanarak kavisli makas kabuğu daha büyük bir delik kesti. mikroforcepslerle embriyonun soluna büyük kan damarı tutarken embriyo etrafında kesti. embriyo kaldırmak ve fosfat tamponlu tuz (PBS), pH 7.3 bir Petri tabağına yerleştirin, bu tekne kavrama kullanın. binoküler mikroskop altında, hayır ve kavisli makas bir arada kullanarak ekstra embriyonik damarları ve membranlar uzak teşrih. 5 microforceps. makas kullanılarak kafasını çıkarın. Embriyoların Fiksasyon hasat sonrası. Kavisli blun kullanarakt forseps, embriyo asansör ve iki saatte bir, bir vidalı kapak ile daha sonra 4 ° C'de bir gece boyunca 20 ml'lik bir cam şişeye, sallanma ve oda sıcaklığında PBS içinde 5 ml% 4 paraformaldehit (PFA) yerleştirin. Dikkat: PFA sağlığı için ciddi bir tehlike olduğunu. Bu zararlı, aşındırıcı tahriş edicidir ve toz Cilt, göz ve akciğerlere ile temas önlenmelidir. çözüm hazırlarken kişisel koruyucu giysiler ve davlumbaz kullanın. Bir 4% çözüm, eldiven, koruyucu gözlük ve bir laboratuvar önlüğü sonra giyilmelidir. NOT: Bu hızlı bir şekilde en iyi düzeltme içine embriyolar elde mRNA bütünlüğünü korumak için çok önemlidir. In situ hibridizasyon Wholemount önce engellerin kaldırılması. NOT: keskindir ve in situ hibridizasyon protokolünde geçmesi gibi embriyolar zarar verebilir, çünkü Engeller birkaç embriyolar tek seferde lekeli, özellikle kaldırılır. fiksasyon ardından, binoküler mi altında PBS bir tabak embriyo yerleştirincroscope. No: 5 microforceps iki çift kullanarak, embriyonun ameliyat tarafında yakından bariyerin iki tarafında sol çifti yerleştirin. Sağ çifti ile bariyer tutun ve yavaşça embriyo tutmak için ve kaldırılır olarak bariyer yapışmasını herhangi bir doku önlemek için sol çiftini kullanarak embriyodan bariyer çekin. 11 de tarif edildiği gibi esas itibarıyla dileği ediniz.