Применение непроницаемых барьеров в сочетании с Factor кандидат замачивают шариков для изучения индуктивные сигналы в Chick

Следующий протокол использует куриные эмбрионы в менее чем за десять дней инкубации. Все эксперименты проводились в соответствии с Королевского колледжа в Лондоне, Великобритании и руководящих принципов по уходу за животными в Великобритании Home Office. 1. Подготовка требуется до курином эмбрионе операции Соберите следующие хирургические инструменты , необходимые для операций, для уборки и для фиксации куриных эмбрионов: Две пары № 5 часовщиков щипцов, одна пара сильных щипцов, например, типа AA, изогнутые ножницы с лезвиями длиной 2,5 см, тупыми изогнутая щипцы с концами примерно длиной 0,5 см, а также две пары № 4 часовщиков щипцов для использования, делая барьеров из фольги (1.6.3). Сделать микро нож из стального штифта (0,3 мм в диаметре) заточены с использованием масла на точило. Используя бинокулярный микроскоп, заострить кончик пальца к плоской лопасти. Поместите штырь в держателе иглы и защитить его острый конец от постучал и денТед. Примечание: Обшивка нож с 1000 мкл кончика пипетки является простым вариантом. Готовят 70% этанола в пластиковой бутылке для стирки. Используйте шприц этого на бумажной салфеткой, чтобы вытереть хирургические инструменты и микро нож до и после использования, чтобы простерилизовать и очистить их. Купить 5 см в ширину четкую липкую ленту и подходящий дозатор. Найти или изготовить остальное подходящее для хранения куриного яйца твердо стоит на своей стороне. Сделайте и хранить решения для замачивания бисера. Приготовьте 0,35 мг / мл раствора фактор роста фибробластов 4 (FGF4) белка от 1 мг / мл замороженной разбавлением его водой и хранят при -20 ° C в 30 мкл аликвоты. Готовят растворы (или 0,05, или 0,1 мг / мл) полностью транс-ретиноевой кислоты (RA), разбавленного диметилсульфоксиде (ДМСО) в темных микропробирок от 5 мг / мл маточного а. Хранить запас и 100 мкл аликвоты при -20 ° С. Готовят растворы (2,5 или 5 мг / мл) BMS 493 (обратная AGonist из RARs) разбавляли ДМСО в темноте микропробирок от 10 мг / мл маточного а. Хранить запас и 100 мкл аликвоты при -20 ° С. Сделайте барьеры из алюминиевой фольги. Примечание: Пленка используется для изготовления барьеров является стандартным питанием фольги (измеряется микрометром в 0,013 мм толщиной). Любой внутренний алюминиевая фольга, вероятно, будет подходящим. Вырезать 1 см квадратный кусок алюминиевой фольги и стерилизовать его, протерев его 70% -ным этанолом на ткани. Поместите его на 6 см стерильной пластиковой чашке Петри. Отбросить крышку и сделать крышку для блюда из фольги. Примечание: Это позволит предотвратить разрезанные барьеры из позже прилипать к пластиковой крышке блюдо из-за статического. Поместите чашку Петри на вершине стадии (1 сетки см длиной разделен на 100 участков) под бинокулярным микроскопом с увеличением, установленным в фактор 1.6. Использование No.15 лезвия небольшой скальпель, нарезать полосками фольги к точной шириной, например, 0,7 мм или 1,3 мм. Отделите фольгуполосы с использованием двух пар № 4 часовщиков щипцов. Затем делают прямоугольный изгиб в центре фольги барьер таким образом, что она напоминает шарнир определенной ширины. Примечание: Эта форма барьера берется из 9, 10. Шарнирное барьер остается на месте лучше, чем прямой, плоский барьер. № 4 пинцетом относительно тупыми и используются, потому что они имеют меньше шансов сделать вмятин или порезов барьеров из фольги. Выстроить барьеров в центре чашки Петри с одной плоской против блюдо, а другой направлен вверх из блюда, перемещая оставшуюся режиссерский фольгу к одной стороне. Подготовьте 20 или более барьеров перед операцией дня. Поместите крышку из фольги над блюдом и хранить барьеры в месте, где они не будут беспокоить. Примечание: Даже небольшое стук может склонить чашу барьеры более или означают, что они торчат со статическим по бокам тарелки. Выдержите оплодотворенные куриные яйца на боку на картонных яичных лотков на 38 °С в течение соответствующего периода времени до операционного дня таким образом, что эмбрионы будут находиться на нужной стадии 8. 2. Приготовление куриных эмбрионах и бусами на день операции 'Окно' инкубированы куриные яйца. Примечание: Следующий метод для открытия яиц был принят на Дениса Summerbell (не опубликовано). С яйцо, лежа на боку, проколоть тупым концом (воздух концевой НКК) яйца типа АА сильные пинцетом, убедившись, что внутренняя оболочка оболочка была нарушена. Для этого нужно понять пинцет прочно скрепленных между собой и использовать управляемое движение проникающий, держа яйцо с свободной рукой. Возьмите яйцо, все еще лежа на боку, в обеих руках (один по обе стороны) повернуть его на 180 ° по горизонтальной оси и заменить ее в лоток яиц таким образом, чтобы сторона, которая была самой верхней теперь рядом с подносом. ПРИМЕЧАНИЕ: Это ослабляет эмбрион из мембран оболочки и будет означать, что эмбрион леSS, вероятно, быть разрезаны, когда оболочка выше эмбриона удаляется. Возьмите кусок ленты ясной приблизительно 5 квадратных см и придерживаться этого близко над самой верхней поверхности яйца, чтобы остановить скорлупу от распада на эмбрион, когда яйцо открывается. Используйте изогнутые ножницы, чтобы аккуратно прорвать оболочку и ее мембран в центре верхней части яйца, сделать очень маленькое отверстие с одним лезвием ножниц, так что воздух может попасть в яйцо над эмбрионом (который лежит прямо под верхняя часть оболочки). Примечание: По просто разорвать оболочки мембраны и не нарушая любой из мембран охватывающих эмбрион, воздух, поступающий в яйцо отделит эмбриона из оболочки и эмбрион уткнуться в верхней части желтка около 0,5-1 см от оболочки , Используйте изогнутые ножницы, чтобы увеличить отверстие в оболочке в круг диаметром примерно 1 см. Удалите часть вырезанной оболочки и закройте отверстие в яйцо скусок прозрачного ленты примерно 5 см кв. Чтобы легко удалить эту ленту, нажмите на ленту, чтобы вставить его только на губе отверстия, оставляя оставшуюся ленту бесплатно. Свободной ленты, то можно понять, чтобы запечатывать яйцо. эмбрионы Сценическое После инкубации при 38 ° С (см шаг 1.7) и (этап оконной 2.1), использовать бинокулярный микроскоп , чтобы поставить на куриных эмбрионах по 8. Делайте это как раз перед яйца запечатаны следующие оконного. Написать стадии каждого эмбриона на яичной скорлупы. Возвращение яйца в инкубатор. Примечание: Эмбрионы на этапах от 8 до 15 пригодны для барьерных и бортов экспериментов. Эмбрионы, более вероятно, чтобы выжить, если они не были исключены из инкубатора слишком долго до операции. Замачивания бисер перед началом работы. FGF4 Возьмем число аффинной хроматографии гранул геля (150-300 мкм), которые прилипают к концу 1000 мкл кончика пипетки и былоч их в 1 мл фосфатным буферным раствором (PBS) в микроцентрифужных трубки для удаления азид они хранятся в. Центрифуга в течение 5 секунд, удалите PBS и повторить процесс дважды. Замачивание гелевые шарики в капле 30 мкл 0,35 мг / мл белка FGF4 на стерильную чашку Петри на льду в течение 30 мин. Pick бусинки примерно 150 мкм в диаметре с N 5 microforceps для вставки в эмбрионе. Примечание: Ручка ионными шарики ионообменной смолы, используемые в следующих шагах с № 5 microforceps и сцепление их очень мягко, потому что шарики являются хрупкими и могут разрушаться, если слишком сильно сжал. Это предупреждение относится к 2.3.2-2.3.3 и все операции по смоляной шарик. Р.А. Размораживание аликвоты 0,05 или 0,1 мг / мл все-транс-RA разбавляют ДМСО и поместить каплю 100 мкл на стерильную чашку Петри (диаметром 9 см), которая ранее была покрыта фольгой для защиты от света RA. Возьмите 10 мкл кончиком пипетки и подобрать какой-либо форме хлорида ионного обменаГранулы смолы на его конце и замочить их в капле РА защищенном от света месте при комнатной температуре в течение 20 мин. Промыть бусин в трех последовательных капель 100 мкл Дульбекко в модификации Дульбекко (DMEM), расположенных на той же чашки Петри, по меньшей мере 1 см друг от друга. Примечание: Шарики занимают фенол красный краситель из DMEM. Этот метод основан на 5. Pick шарики приблизительно 100 мкм в диаметре (шарики в диапазоне размеров от 75-180 мкм во влажном состоянии) для вставки в эмбрионе, используя столик микроскопа координатной сетки слайд под чашку Петри и No.5 microforceps держать бусинки. Поднимая шарик из капли 100 мкл DMEM, прежде всего шарик вниз на чашку Петри и удалите оставшуюся DMEM из него либо толкая шарик из капли или путем размещения закрытых щипцов рядом с буртиком (капилляр действие рисует жидкость от борта). BMS 493 Что касается RA (2.3.2), замочить ионов СПЕЦAnge гранулы смолы в капле 100 мкл 2,5 или 5,0 мг / мл BMS 493 в ДМСО при комнатной температуре в течение 20 мин, затем прополоскать в 100 мкл капель DMEM. Pick бусинки примерно 100 мкм в диаметре для вставки в эмбрионе. контроль ДМСО Что касается RA (2.3.2), замачивание ионообменная смола бусин в капле 100 мкл ДМСО при комнатной температуре в течение 20 мин, затем прополоскать в 100 мкл капель DMEM. Pick бусинки примерно 100 мкм в диаметре для вставки в эмбрионе. 3. Операции Барьерные и бисера Рисунок 1. Схематическое куриных эмбрионов различных стадий , показывающие , где барьеры и или бусы должны быть размещены. (A) Уровень 13 куриного эмбриона положение схематически показывает барьер (зеленая линия) между сомитов и LPM на presumpный уровень крыла (сомитов 15-20). (Б) То же, что и в схематической (а), что указывает , где шарик RA (красный круг) должен быть помещен перед введением барьера. (C) положение Схематическое изображение барьера (зеленая линия) на вмененный уровне ног (сомитов 26-32) в стадии 15 эмбриона. (D) , ту же схему, что и в (С), что указывает , где должны быть размещены шарик RA (красный круг). (Е) Схема с указанием , где BMS 493 бусин (фиолетовые кружки) должны быть помещены в LPM этапа 15 эмбрионов. (F) Принципиальная схема куриного эмбриона стадии 9 , указывающей положение барьера (зеленая линия) между пресомитной мезодермы и LPM на вмененный уровне крыла. (G) Принципиальная схема стадии 9 эмбриона , показывая позиции барьера (зеленая линия) и шарик RA (красный круг). (H) Принципиальная схема стадии 10 куриного эмбриона , показывающий положение барьера (зеленая линия) на вмененный уровне ног. (I </stRong>) Принципиальная электрическая схема, показывающая BMS 493 позиций шарик (фиолетовый круг) в стадии 10 уровня ноги LPM. Эта цифра была изменена с 7. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Барьер вставляется на стадии 13, чтобы предотвратить бутон инициацию крыла. Возьмите стадия 13 эмбрионов из инкубатора и поместить яйцо на яйцо остальное под бинокулярным микроскопом, установленным в 3.2x увеличением или выше, если предпочтительнее. Снимите верхний слой прозрачного ленты. Использование стальной микро нож, сделать разрез через желточной оболочки и боковая пластина мезодермы (LPM) , примыкающей к сомитов 15 до 20 (Фигура 1А) на правой стороне эмбриона (сомитов не все сформированы на данном этапе). Вырезать рядом с последних четырех сомитов, образованных и продолжить вырезать две длины сомитных каудально. Возьмите барьер (широкий 0.7-1 мм) с 5 microfo No.rceps в конце выступающую из чашки Петри и скрутить руки, чтобы вставить свободный конец барьера в разрез. Образный шарнир барьера лежит плоско на желточной оболочки над LPM с половиной его выступающими вниз через разрез дистально по отношению к сомитов. Как можно скорее запечатать яйцо с лентой и ясном вернуть его в инкубатор. Примечание: Микро нож и пинцет становятся липкими при контакте с желточной оболочки. Важно, чтобы начисто вытрите их 70% этанолом перед попыткой последующей операции. Это относится и ко всем последующим описанием работы и шарик имплантаций. Если шарик должен быть вставлен в сочетании с барьером; во – первых, возьмите шарик в № 5 microforceps и вставить его в вырез поверхности LPM на дистальной стороне разреза , а затем вставьте барьер в разрез проксимальнее борта (рис 1В). Печать яйцо и вернуть его немедленно в инкубатор. </li> Барьер вставляется на стадии 15, чтобы предотвратить ноги инициации бутонов. Примечание: Пример результата этой операции на экспрессию Tbox 4 фактора транскрипции (Tbx4) показана на рис 2D и 2Е. Возьмите стадия 15 эмбрионов из инкубатора и поместить яйцо на яйцо остальное под бинокулярным микроскопом, установленным в 3.2x увеличением или выше, если предпочтительнее. Снимите верхний слой прозрачного ленты. Использование стальной микро нож надрезают через желточной оболочки и LPM , примыкающей к сомитов 26 до 32 (фиг.1С) с правой стороне эмбриона (сомитов не все сформированы на данном этапе). Вырезать рядом с последних двух сомитов, образованных и продолжают длины сомитных вырезать пять каудально. Возьмите барьер (широкий 1,2-1,3 мм) с № 5 microforceps на одном конце и скрутить барьер, чтобы вставить свободный конец в разрез. Как можно скорее запечатать яйцо с прозрачной лентойй вернуть его в инкубатор. Примечание: Петля образный барьер лежит плоско на желточной оболочки над LPM с половины его выступающими вниз через разрез дистально по отношению к сомитов. Если шарик должен быть вставлен в сочетании с барьером, во-первых, возьмите шарик в № 5 microforceps и вставить его в вырез поверхности LPM на дистальной стороне разреза, а затем вставьте барьер в разрез проксимальнее шарик (рис 1D). Печать яйцо и вернуть его немедленно в инкубатор. Если шарик или шарики должны быть вставлены без барьера, например, BMS 493 бусин к ноге области на этапе 15, не делают длинный разрез (3.2.2.1). Сделайте небольшой надрез через желточной оболочки и в LPM в положении шарик должен быть помещен. Возьмите шарик в № 5 microforceps и вставить его в отверстие в LPM. Нажмите ее немного дальше с закрытыми концами пинцета (рис 1E). </li> Барьер вставляется на стадии 9, чтобы предотвратить крыла индукции бутон и инициации. Возьмем этап 8 или 9 эмбриона из инкубатора и поместить яйцо на яйцо остальное под бинокулярным микроскопом, установленным в 3.2x увеличением или выше, если предпочтительнее. Используя стальной нож микро надрезают через желточной оболочки и LPM боковой и ростральной к первичной полоски, на каудальном конце эмбриона в соответствии с сомитов (рис 1F) около 5 сомитов длины долго. Возьмите барьер (широкий 0,7-1 мм) с № 5 microforceps в конце выступающую из чашки Петри и скрутить руки, чтобы вставить свободный конец барьера в разрез. Как можно скорее запечатать яйцо с лентой и ясном вернуть его в инкубатор. Примечание: Петля образный барьер лежит плоско на желточной оболочки над LPM с половины его выступающими вниз через разрез. Если шарик должен быть inserted в сочетании с барьером; во – первых, возьмите шарик в № 5 microforceps и вставить его в вырез поверхности LPM на дистальной стороне разреза , а затем вставьте барьер в разрез проксимальнее борта (рис 1G). Печать яйцо и вернуть его немедленно в инкубатор. Барьер вставляется на стадии 10, чтобы предотвратить ногу индукцию бутон и инициацию. Примечание: Пример результата этой операции на экспрессию Tbx4 показана на рисунке 2G. Возьмите стадия 10 эмбрионов из инкубатора и поместить яйцо на яйцо остальное под бинокулярным микроскопом, установленным в 3.2x увеличением или выше, если предпочтительнее. Используя стальной микро нож сделать надрез через желточной оболочки и LPM сбоку от первичной полоски, на каудальном конце эмбриона в соответствии с сомитов (рис 1H) приблизительно 6 сомитов большой длины. Возьмите барьер (1.2мм шириной) с N 5 microforceps в конце выступающую из чашки Петри и скрутить руки, чтобы вставить свободный конец барьера в разрез. Как можно скорее запечатать яйцо с лентой и ясном вернуть его в инкубатор. Примечание: Петля образный барьер лежит плоско на желточной оболочки над LPM с половины его выступающими вниз через разрез. Если шарик должен быть вставлен без барьера, например, BMS 493 шарик в области ног на этапе 10, делают небольшой надрез через желточной оболочки и в LPM в положении шарик должен быть помещен. Возьмите шарик в № 5 microforceps и вставить его в отверстие в LPM. Нажмите ее немного дальше с закрытыми концами пинцета (рис 1и). 24 ч или более после работы проверьте положение барьера по сравнению с формирующейся контралатеральной почки конечности. Откажитесь от любых эмбрионов, в которых барьер явно не opposIte левой почки конечности. В этом случае барьер был ошибочно установлен. 4. Заготовка Эмбрионы, Фиксирование и подготовка к Wholemount В гибридизация (WISH) Сбор эмбрионов послеоперационный. Урожай эмбрионов на стадии 19-23 таким образом, что зачатка конечности морфология отчетливо видна в обоих оперированных и контралатеральной стороны управления. Используя изогнутые ножницы вырезать большое отверстие в скорлупе. Сокращение вокруг зародыша, держа большой кровеносный сосуд слева от зародыша с microforceps. Используйте этот захват судна, чтобы удалить эмбрион и поместить его в чашку Петри фосфатно-солевого буфера (PBS), рН 7,3. Под бинокулярным микроскопом, отсечь лишние эмбриональных сосудов и мембран с использованием комбинации изогнутыми ножницами и нет. 5 microforceps. Снимите головку с помощью ножниц. Фиксирование эмбрионов отправлять заготовки. Используя изогнутый blunт щипцов, поднимите эмбрион и поместить его в 5 мл 4% параформальдегида (PFA) в PBS при комнатной температуре в течение двух ч качалки, а затем при температуре 4 ° С в течение ночи в стеклянной бутылке 20 мл с завинчивающейся крышкой. Внимание: PFA представляет собой серьезную опасность для здоровья. Это вредно, коррозионные раздражителем и порошок должен быть предотвращен в контакт с кожей, глазами и легкие. Использовать индивидуальную защитную одежду и вытяжку во время приготовления раствора. После того, как это 4% раствор, перчатки, защитные очки и пальто лаборатории должны носить. Примечание: Важно, чтобы получить эмбрионы в быстро исправить, чтобы наилучшим образом сохранить целостность мРНК. Устранение барьеров предшествующих Wholemount in – situ гибридизации. ПРИМЕЧАНИЕ: Барьеры удалены , поскольку они очень острые и могут повредить эмбрионов , как они идут через протокол гибридизация, особенно если несколько эмбрионов окрашивают сразу. После фиксации, поместить эмбрион в чашке ФБР под бинокулярным миcroscope. Используя две пары № 5 microforceps, поместите левую пару близко обе стороны барьера в прооперированной стороне эмбриона. Возьмитесь барьер с правой парой и осторожно потяните барьер из эмбриона, используя левую пару, чтобы сохранить эмбрион вниз и предотвратить любую ткань от присоединения к барьеру, как он удаляется. Проводят WISH по существу , как описано в 11.