Application des barrières imperméables combinées avec le facteur de candidat Perles Soaked pour étudier les signaux inductifs dans le poussin

Le protocole suivant utilise des embryons de poulet à moins de dix jours d'incubation. Toutes les expériences ont été réalisées conformément au King College de Londres, Royaume-Uni et les directives de protection des animaux au Royaume-Uni Home Office. 1. Préparation requise Avant Chick Opération Embryo Rassembler les instruments chirurgicaux suivants nécessaires aux opérations, pour la récolte et pour la fixation des embryons de poulet: Deux paires de n ° 5 horlogers pince, une paire de pinces solides, par exemple de type AA, ciseaux courbes avec des lames de 2,5 cm de long, à extrémités franches incurvée une pince à bouts d'environ 0,5 cm de longueur, ainsi que deux paires de pinces n ° 4 horlogeries à utiliser tout en faisant des barrières de feuilles (1.6.3). Faire un micro couteau à partir d'une tige d'acier (0,3 mm de diamètre) aiguisée en utilisant l'huile sur une pierre à aiguiser. L'utilisation d'un microscope binoculaire, aiguiser la pointe de la broche à une lame plate. Placez la broche dans un porte-aiguille et protéger son extrémité pointue d'être frappé et dented. NOTE: Les enveloppes du couteau avec une pointe de 1000 pi de pipette est une option simple pour cela. Préparer 70% d'éthanol dans un flacon de lavage en plastique. Utilisez une giclée de ceci sur un mouchoir en papier pour essuyer les instruments chirurgicaux et le micro couteau avant et après l'utilisation de stériliser et de les nettoyer. Acheter 5 cm de large ruban adhésif clair et un distributeur approprié. Trouver ou fabriquer un repos convenable pour tenir un œuf de poule régulière sur son côté. Marque et solutions de magasins pour perles de trempage. Préparer une solution de 0,35 mg / ml de Fibroblast Growth Factor 4 (FGF4) protéines de 1 mg / ml stock congelé en le diluant avec de l'eau et conserver à -20 ° C en 30 aliquotes. Préparer des solutions (soit 0,05 ou 0,1 mg / ml) de tout-trans-rétinoïque (RA) dilué avec du diméthylsulfoxyde (DMSO) dans des tubes à centrifuger sombres d'un 5 mg / stock ml. Stocker le stock et aliquotes de 100 pi à -20 ° C. Préparer des solutions (2,5 ou 5 mg / ml) de BMS 493 (une ag inverseonist de RARs) dilué avec du DMSO dans des tubes de microcentrifugation sombres de 10 mg / stock ml. Stocker le stock et aliquotes de 100 pi à -20 ° C. Faire des barrières de papier d'aluminium. NOTE: La feuille utilisée pour fabriquer les barrières est une feuille de restauration standard (mesurée par micromètre 0,013 mm d'épaisseur). Toute feuille d'aluminium intérieure serait probablement approprié. Coupez un morceau carré de 1 cm de papier d'aluminium et de le stériliser en l'essuyant avec 70% d'éthanol sur un tissu. Placez-le sur un plastique stérile boîte de Pétri de 6 cm. Jeter le couvercle et faire un couvercle pour le plat de papier d'aluminium. NOTE: Cela permettra d'éviter les barrières de coupe de coller plus tard sur le couvercle en plastique du plat en raison de statique. Placez la boîte de Pétri sur un réticule de scène (1 cm de long répartis en 100 sections) sous un microscope binoculaire avec un grossissement réglé sur 1.6X. En utilisant un petit scalpel de lame No.15, couper des bandes de la feuille à une largeur exacte, par exemple, 0,7 mm ou 1,3 mm. Séparer la feuillebandes en utilisant deux paires de n ° 4 horlogers forceps. Ensuite, faire un virage à angle droit dans le centre de la barrière de la feuille de telle sorte qu'il ressemble à une charnière de la largeur spécifique. NOTE: Cette forme de barrière est tirée de 9, 10. Une barrière à charnière reste en place mieux que, une barrière plate droite. N ° 4 des pinces sont relativement émoussée et sont utilisés parce qu'ils sont moins susceptibles de faire des bosses ou des scores dans les barrières de feuilles. Aligner les barrières dans le centre de la boîte de Pétri avec un côté plat contre le plat et l'autre pointant vers le haut sur le plat, le déplacement de la feuille non coupée restante d'un côté. Préparer 20 ou plusieurs obstacles avant le jour de l'opération. Placez le couvercle en aluminium sur le plat et de stocker les barrières dans un endroit où ils ne seront pas perturbés. NOTE: Même un léger cliquetis peut faire basculer les barrières plus ou dire qu'ils collent avec statique sur les côtés du plat. Incuber les œufs de poule fécondés sur leurs côtés sur des plateaux d'œufs en carton à 38 °C pour la durée appropriée avant le jour de fonctionnement tels que les embryons sera au 8 stade désiré. 2. Préparation des embryons de poulet et perles sur Jour Opération "Fenêtre" incubé des oeufs de poule. NOTE: La méthode suivante pour l'ouverture des œufs a été transmis par Dennis Summerbell (non publié). Avec l'oeuf couché sur le côté, percer l'extrémité émoussée (extrémité de sac d'air) de l'œuf avec le type AA fortes pinces en veillant à ce que la membrane interne de la coquille a été cassée. Pour ce faire, saisir la pince fermement ensemble et utiliser un mouvement d'engagement contrôlé tout en maintenant l'œuf avec la main libre. Prenez l'oeuf, toujours couché sur le côté, dans les deux mains (un de chaque côté) tourner à 180 ° sur l'axe horizontal et de le remplacer dans le plateau d'oeufs de telle sorte que le côté qui était la plus élevée est maintenant à côté du plateau. NOTE: Ce desserre l'embryon des membranes de la coquille et qui signifie que l'embryon est less susceptible d'être coupé lorsque la coque au-dessus de l'embryon est retiré. Prenez un morceau de ruban adhésif transparent d'environ 5 cm carré et coller cette étroite sur la surface supérieure de l'œuf pour arrêter la coquille de l'effritement sur l'embryon quand l'œuf est ouvert. Utilisez les ciseaux courbes pour briser doucement à travers la coque et ses membranes dans le centre de la partie supérieure de l'œuf, faire un petit trou avec une lame de ciseaux de telle sorte que l'air peut pénétrer dans l'œuf sur l'embryon (qui se trouve juste sous la partie supérieure de la coque). NOTE: En tout rompre les membranes de la coquille et de ne pas briser l'une des membranes recouvrant l'embryon, l'air entrant dans l'œuf va séparer l'embryon de la coquille et l'embryon va venir se reposer sur le dessus du jaune d'environ 0,5-1 cm de la coque . Utilisez les ciseaux courbes pour agrandir le trou dans la coquille d'un cercle avec un diamètre d'environ 1 cm. Retirez le morceau de coquille excisée et couvrir le trou dans l'œuf avec unmorceau de ruban adhésif transparent d'environ 5 cm carré. Pour retirer facilement cette bande, appuyez sur la bande pour coller seulement au bord du trou, en laissant la bande restant libre. La bande libre peut alors être saisi pour desceller l'œuf. embryons de Scène Après incubation à 38 ° C (voir étape 1.7) et fenêtrage (étape 2.1), utiliser un microscope binoculaire pour mettre en scène les embryons de poulet selon 8. Pour ce faire, juste avant que les oeufs sont scellés suivant fenêtrage. Ecrire la scène de chaque embryon sur la coquille. Remettre les oeufs dans l'incubateur. REMARQUE: Les embryons à des stades entre 8 et 15 sont appropriés pour des expériences de barrière et de perles. Embryons sont plus susceptibles de survivre si elles ne sont pas laissés pour compte de l'incubateur pendant trop longtemps avant de faire fonctionner. perles Tremper avant l'opération. FGF4 Prenez le nombre de billes de gel de chromatographie d'affinité (150-300 um) qui collent à l'extrémité d'une pointe de pipette de 1000 pi et a étéh eux dans 1 ml du tampon phosphate salin (PBS) dans un tube à centrifuger pour éliminer l'azoture ils sont stockés dans. Centrifuger pendant 5 sec, jeter le PBS et répéter deux fois le processus. Faire tremper les perles de gel dans une chute de 30 pi de 0,35 mg / ml de protéine de FGF4 sur une boîte de Petri stérile sur la glace pendant 30 min. Choisissez perles environ 150 um de diamètre au numéro 5 microforceps pour l'insertion dans l'embryon. REMARQUE: Manipulez perles de résine échangeuse d'ions utilisées dans les étapes suivantes au numéro 5 microforceps et les saisir très doucement parce que les perles sont fragiles et peuvent se briser si pressé trop serré. Cet avertissement s'applique à 2.3.2-2.3.3 et toutes les opérations de perles de résine. RA Décongeler une quantité aliquote de 0,05 ou 0,1 mg / ml all-trans-RA dilué avec du DMSO et déposer une goutte de 100 pl sur une boîte de Pétri stérile (9 cm de diamètre) qui a été préalablement recouverte d'une feuille pour protéger la PR de la lumière. Prenez une pointe de pipette 10 pi et ramasser un échange sous forme de chlorure d'ionsperles de résine sur son extrémité et tremper ceux-ci dans la chute de RA protégé de la lumière à la température ambiante pendant 20 min. Rincer les billes en trois gouttes successives de 100 pi de milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) placés sur la même boîte de Pétri d'au moins 1 cm. NOTE: Les billes prennent le phénol colorant rouge du DMEM. Cette méthode est basée sur 5. Choisissez des billes d'environ 100 um de diamètre (perles varient en taille 75-180 um lorsqu'il est mouillé) pour l'insertion dans l'embryon, en utilisant un réticule lame de platine du microscope sous la boîte de Pétri et No.5 microforceps pour tenir les perles. Lors de la cueillette jusqu'à la perle de la baisse de 100 pi de DMEM, d'abord le talon vers le bas sur la boîte de Pétri et de supprimer toute DMEM restante de celui-ci soit en poussant le cordon hors de la goutte ou en plaçant la pince fermée à côté du bourrelet (capillaire l'action tire le liquide loin de la perle). BMS 493 Quant à la RA (2.3.2), trempez éch d'ionsdes billes de résine ange dans une goutte 100 ul de 2,5 ou 5,0 mg / ml BMS 493 dans du DMSO à la température ambiante pendant 20 minutes puis rincer à 100 gouttes ul de DMEM. Choisissez des billes d'environ 100 m de diamètre pour l'insertion dans l'embryon. le contrôle DMSO En ce qui concerne la PR (2.3.2), faire tremper les perles de résine échangeuse d'ions dans une goutte de 100 pl de DMSO à la température ambiante pendant 20 minutes, puis rincer à 100 gouttes ul de DMEM. Choisissez des billes d'environ 100 m de diamètre pour l'insertion dans l'embryon. 3. Opérations barrière et perles Figure 1. Schéma de Chick Embryons de divers stades montrant où les obstacles et ou perles doivent être placés. (A) Etape 13 embryon de poulet schéma montrant la position de la barrière (ligne verte) entre somites et LPM au présompniveau de l'aile tive (somites 15-20). (B) Le même schéma que dans (A), ce qui indique où RA bourrelet (cercle rouge) doit être placé avant l'insertion de la barrière. (C) Position schématique montrant barrière (ligne verte) au niveau de la jambe présomptif (somites 26-32) dans un embryon stade 15. (D) Le même schéma que dans (C), indiquant où un bourrelet de RA (cercle rouge) doit être placé. (E) Schéma indiquant où BMS 493 perles (cercles violets) doivent être placés dans la LPM d'un embryon stade 15. (F) Schéma d'un embryon de poulet étape 9 indiquant la position de la barrière (ligne verte) entre le mésoderme présomitique et LPM au niveau de l' aile présomptif. (G) Schéma d'un embryon stade 9 montrant les positions d'une barrière (ligne verte) et RA talon (cercle rouge). (H) Schéma d'un embryon de poulet stade 10 montrant la position de la barrière (ligne verte) au niveau de la jambe présomptif. (I </strong>) Diagramme schématique montrant BMS 493 position de talon (cercle violet) dans l'étape 10 du niveau de la jambe LPM. Ce chiffre a été modifié depuis 7. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Barrière inséré à l'étape 13 pour empêcher l'aile initiation du bourgeon. Prenez un embryon de l'incubateur étape 13 et placer l'œuf sur un reste d'œuf sous un microscope binoculaire mis à 3,2X grossissement ou plus si l'on préfère. Retirer la couche supérieure du ruban adhésif transparent. À l' aide d' un micro – couteau en acier, une incision à travers la membrane vitelline et latérale mésoderme (LPM) adjacente à somites 15 et 20 (figure 1A) sur le côté droit de l'embryon (somites ne sont pas tous formés à ce stade). Couper adjacente aux quatre derniers somites formés et continuer la coupe deux longueurs de somites caudale. Ramassez la barrière (0,7-1 mm de large) avec n ° 5 microforceps à l'extrémité faisant saillie de la boîte de Petri et tordre la main pour insérer l'extrémité libre de la barrière dans l'incision. La charnière en forme de barrière repose à plat sur la membrane vitelline au-dessus de la LPM avec la moitié de celui-ci faisant saillie vers le bas à travers l'incision distale par rapport à somites. Dès que possible sceller l'œuf avec du ruban adhésif transparent et de le retourner à l'incubateur. NOTE: Le micro couteau et une pince devenir collante au contact de la membrane vitelline. Il est important de les essuyer avec 70% d'éthanol avant de tenter une opération ultérieure. Cela vaut pour toutes les descriptions des opérations ultérieures et à perler implantations. Si un cordon doit être inséré conjointement avec une barrière; d'une part, prendre le cordon dans le n ° 5 microforceps et l' insérer dans le visage de la LPM sur le côté distal de l'incision de coupe, puis insérez la barrière dans l'incision proximale à la perle (figure 1B). Sceller l'œuf et le retourner rapidement à l'incubateur. </li> Barrière inséré à l'étape 15 pour empêcher la jambe initiation des bourgeons. REMARQUE: Un exemple du résultat de cette opération sur Tbox 4 facteur de transcription (Tbx4) expression est représentée sur la figure 2D et 2E. Prenez un embryon de l'incubateur stade 15 et placer l'œuf sur un reste d'œuf sous un microscope binoculaire mis à 3,2X grossissement ou plus si l'on préfère. Retirer la couche supérieure du ruban adhésif transparent. À l' aide d' un micro – couteau en acier faire une incision à travers la membrane vitelline et LPM adjacente à somites 26-32 (figure 1c) sur le côté droit de l'embryon (somites ne sont pas tous formés à ce stade). Couper à côté des deux derniers somites formés et continuer la coupe cinq longueurs de somites caudale. Ramassez la barrière (1,2-1,3 mm de large) avec n ° 5 microforceps à une extrémité et tourner la barrière pour insérer l'extrémité libre dans l'incision. Dès que possible sceller l'œuf avec un ruban clairnd retourner à l'incubateur. REMARQUE: La charnière barrière en forme repose à plat sur la membrane vitelline au-dessus de la LPM avec la moitié de celui-ci faisant saillie vers le bas à travers l'incision distale par rapport à somites. Si un cordon doit être inséré en conjonction avec une barrière, d'une part, prendre le cordon dans le n ° 5 microforceps et l'insérer dans le visage de la LPM de coupe sur le côté distal de l'incision, puis insérez la barrière dans la partie proximale de l'incision à le bourrelet (figure 1D). Sceller l'œuf et le retourner rapidement à l'incubateur. Si une bille ou billes doivent être insérés sans barrière, par exemple, BMS 493 perles à la région jambe à l' étape 15, ne font pas la longue incision (3.2.2.1). Une petite incision à travers la membrane vitelline et dans la LPM à la position du bourrelet doit être placé. Prenez le cordon dans le n ° 5 microforceps et l'insérer dans le trou dans la LPM. Poussez – le dans un peu plus loin avec les extrémités fermées de la pince (Figure 1E). </li> Barrière inséré à l'étape 9 pour empêcher l'aile bourgeon induction et initiation. Prenez une étape 8 ou 9 embryon de l'incubateur et placer l'œuf sur un reste d'œuf sous un microscope binoculaire mis à 3,2X grossissement ou plus si l'on préfère. L' utilisation d' un micro couteau en acier faire une incision à travers la membrane vitelline et LPM latéral et rostrale à la ligne primitive, à l'extrémité caudale de l'embryon en ligne avec les somites (figure 1F) environ 5 somites longueurs de long. Ramassez la barrière (0,7-1 mm de large) avec n ° 5 microforceps à l'extrémité en saillie de la boîte de Pétri et tordre la main pour insérer l'extrémité libre de la barrière dans l'incision. Dès que possible sceller l'œuf avec du ruban adhésif transparent et de le retourner à l'incubateur. REMARQUE: La charnière barrière en forme repose à plat sur la membrane vitelline au-dessus de la LPM avec la moitié de celui-ci faisant saillie vers le bas à travers l'incision. Si un cordon doit être inserted en combinaison avec une barrière; d'une part, prendre le cordon dans le n ° 5 microforceps et l' insérer dans le visage de la LPM sur le côté distal de l'incision de coupe, puis insérez la barrière dans l'incision proximale à la perle (figure 1G). Sceller l'œuf et le retourner rapidement à l'incubateur. Barrière inséré à l'étape 10 pour empêcher la jambe induction de bourgeons et de l'initiation. REMARQUE: Un exemple du résultat de cette opération sur l' expression de Tbx4 est représenté sur la figure 2G. Prenez un embryon stade 10 de l'incubateur et placer l'œuf sur un reste d'œuf sous un microscope binoculaire mis à 3,2X grossissement ou plus si l'on préfère. L' utilisation d' un micro couteau en acier faire une incision à travers la membrane vitelline et LPM latéral à la ligne primitive, à l'extrémité caudale de l'embryon en ligne avec les somites (Figure 1 H) environ 6 somites longueurs de long. Ramassez la barrière (1.2mm de large) avec n ° 5 microforceps à l'extrémité en saillie de la boîte de Pétri et tordre la main pour insérer l'extrémité libre de la barrière dans l'incision. Dès que possible sceller l'œuf avec du ruban adhésif transparent et de le retourner à l'incubateur. REMARQUE: La charnière barrière en forme repose à plat sur la membrane vitelline au-dessus de la LPM avec la moitié de celui-ci faisant saillie vers le bas à travers l'incision. Si un cordon doit être inséré , sans barrière, par exemple, le BMS 493 bourrelet dans la région de la jambe à l' étape 10, une petite incision à travers la membrane vitelline et dans la LPM à la position du bourrelet doit être placé. Prenez le cordon dans le n ° 5 microforceps et l'insérer dans le trou dans la LPM. Poussez – le dans un peu plus loin avec les extrémités fermées de la pince (Figure 1I). 24 heures ou plus après l'exploitation vérifier la position de la barrière par rapport au membre controlatéral bourgeon naissant. Jeter les embryons dont la barrière est clairement pas Opposite le bourgeon de membre gauche. Dans ce cas, la barrière a été mal positionné. 4. récolte Embryons, Fixation et préparation pour Wholemount Hybridation In Situ (WISH) embryons de récolte affichent opération. embryons de récolte au stade 19-23 telle que bourgeon de membre morphologie est clairement visible dans les deux côtés exploités et controlatéral contrôle. Utilisation de ciseaux courbes couper un grand trou dans la coquille. Couper autour de l'embryon, tout en maintenant le gros vaisseau sanguin vers la gauche de l'embryon avec microforceps. Utilisez cette poignée de la cuve pour éliminer l'embryon et le placer dans une boîte de Pétri de tampon phosphate salin (PBS) pH 7,3. Sous un microscope binoculaire, disséquer les vaisseaux et les membranes extra-embryonnaires utilisant une combinaison de ciseaux courbes et non. 5 microforceps. Retirez la tête à l'aide des ciseaux. Fixation d'embryons afficher la récolte. Utilisation de Blun incurvéet forceps, soulever l'embryon et le placer dans 5 ml paraformaldéhyde 4% (PFA) dans du PBS à température ambiante pendant deux heures à bascule, puis à 4 ° C pendant la nuit dans une bouteille en verre de 20 ml avec un bouchon à vis. Attention: PFA est un danger grave pour la santé. Il est nocif, irritant corrosif et la poudre doit être empêché d'entrer en contact avec la peau, les yeux et les poumons. Utiliser des vêtements de protection individuelle et une hotte tout en préparant la solution. Une fois qu'il est une solution à 4%, des gants, des lunettes de protection et une blouse doit être porté. NOTE: Il est important d'obtenir les embryons en solution rapidement pour mieux préserver l'intégrité de l'ARNm. L' élimination des obstacles avant wholemount hybridation in situ. NOTE: Les obstacles sont supprimés car ils sont tranchants et peuvent endommager les embryons car ils passent par le protocole d'hybridation in situ, en particulier si plusieurs embryons sont colorées à la fois. Après la fixation, placer l'embryon dans un plat de PBS dans une mi binoculairecroscope. L'utilisation de deux paires de n ° 5 microforceps, placer la paire gauche près de chaque côté de la barrière dans le côté opéré de l'embryon. Attrapez la barrière avec la bonne paire et tirez doucement la barrière de l'embryon en utilisant la paire gauche pour garder l'embryon vers le bas et pour éviter tout tissu d'adhérer à la barrière lorsqu'elle est retirée. Effectuer WISH essentiellement comme décrit dans 11.