تطبيق الحواجز غير نفاذ جنبا إلى جنب مع المرشح عامل الخرز غارقة لدراسة إشارات الاستقرائي في الفرخ
Summary
Protocols using impermeable barriers to block induction events between tissues of the main body axis and flank in the chick embryo required for limb formation are described. Beads soaked in candidate inductive signals are used to overcome the effect of barrier placement and analysis of gene expression confirms this.
Abstract
يوفر الجنين الفرخ نموذجا الفقاريات رائعة التي يمكن استخدامها لتشريح الأسئلة التنموية بطريقة مباشرة. إمكانية الحصول عليها ومتانة بعد التدخل الجراحي هي نقاط القوة التجريبية الرئيسية. وكانت لوحات الميكا الحواجز الأولى تستخدم لمنع الفرخ برعم الطرف بدء 1. يتم وصف البروتوكولات التي تستخدم رقائق الألومنيوم بمثابة حاجز كتيم إلى برعم الجناح أو تحريض الساق برعم وأو البدء. نحن الجمع بين هذه التقنية مع الجانبية حبة التنسيب للعائقا أمام خارجيا العوامل الداخلية مرشح العرض التي تم حظرها من قبل حاجز. ويتم تحليل النتائج باستخدام التهجين الموضعي التعبير الجيني لاحق. هدفنا الرئيسي هو التركيز على دور الإشارات حمض الريتينويك في تحريض والشروع في وقت لاحق من الصدارة كتكوت الجنين وhindlimb. نحن نستخدم BMS 493 (ناهض معكوس مستقبلات حمض الريتينويك (RAR)) حبات غارقة مزروع في لوحة جانبية الأديم المتوسط (LPM) لتقليد أثر باررير وضعت بين و somites (مصدر لحمض الريتينويك (RA)) وLPM التي تنمو براعم الأطراف. ويمكن أيضا أن نسخ معدلة من هذه البروتوكولات يتم استخدامها لمعالجة مسائل أخرى على الأصل وتوقيت الاشارات الاستقرائي. تقدم منطقة جنين الفرخ يمكن الوصول إليها في هذه المرحلة التنموية ذات الصلة، ويمكن وضع حاجز بين الأنسجة والتغيرات اللاحقة في التنمية المدروسة. يمكن العثور على أمثلة في الدماغ، والإرشاد محور تطوير وفي تطوير الجهاز، مثل الكبد أو الكلى الاستقراء.
Introduction
عالم أجنة الكلاسيكية تستخدم عادة تقنيات المادية لاستجواب الآليات المتحكمة في التطور الجنيني. في 1960s و 1970s طور الباحثون التقنيات التي تستخدم حواجز منيعة تدرج بين أنسجة الجنين النامي للتدليل على أهمية إشارات الاستقرائي خلال مرحلة التطور الجنيني. مصلحتنا هي في وضع الطرف الفقاريات وعلى وجه الخصوص ما أحداث تسبق برعم الطرف ثمرة. على سبيل المثال، يمكن ادراج حاجزا يمنع برعم الطرف ثمرة من الحدوث على جانب واحد من أجنة الدجاج في حين يسمح لها المضي قدما عادة على الجانب، unoperated المقابل. المواد المستخدمة لجعل هذه الحواجز متنوعة. على سبيل المثال، لوحات الميكا 1 والتنتالوم احباط 2. هذه الحواجز تفصل بشكل فعال لوحة الأديم المتوسط الجانبي (LPM)، والتي من أشكال برعم الطرف، من و somites تتشكل من الأديم المتوسط المجاور للمحور. تقنيات تطعيم الجراحية تثبت أن وثيقة الارتباط خفة دمح و somites ضروري إذا برعم الطرف بدء هو أن يحدث في LPM 3 4. في 80s و 90s اكتشف علماء البيولوجيا التطورية قابل للانتشار الجزيئات مما يشير التي لا غنى عنها في السيطرة على العمليات التنموية. حبات غارقة مع هذه الجزيئات يشير يمكن زرعها في مناطق معينة من الجنين وينتج تعديلات على التطور الجنيني. على سبيل المثال، يتم تحرير حمض الريتينويك (RA) التي اتخذت من قبل الخرز التبادل الأيوني على مدى فترة 24 ساعة عند زرعها في أجنة الدجاج ويمكن ان تنتج ازدواجية مرآة صورة من الأرقام 5. يمكن الهيبارين الخرز الاكريليك تحتوي على البروتين صندوق الأجيال القادمة بدء برعم الطرف ثمرة من interlimb LPM 6.
وفي الآونة الأخيرة أخذت الماوس والأسماك الوراثة دراسة بدء الفقاريات الأطراف إلى عهد جديد (إعادة النظر في 7). وهناك أدلة قوية على ان RA موجودة في و somites قبل بدء برعم الطرف هو إشارة إنتشاري الأساسية المطلوبة من قبل ليرة لبنانيةM للشروع الطرف مهدها. أردنا استغلال الوصول ومتانة التجريبية للجنين فرخ لتشريح تأثير زرع حاجز على التعبير الجيني في LPM في وقت قريب من بدء برعم الطرف. والتكيف الرواية من أسلوبنا هو الجمع بين حاجز يمنع إشارات من الأنسجة المحورية مع الجانبية حبة التنسيب إلى حاجز لعوامل داخلية المنشأ مرشح العرض خارجيا التي تم حظرها من قبل حاجز. البروتوكولات التالية هي تلك التي وضعت لاستخلاص آليات الطرف تحريض برعم وبدء.
دراسة برعم الطرف بدء يعني استخدام الأجنة مرحلة مبكرة. الكثير من البيض الباحثين نافذة الدجاج عن طريق إزالة أولا بعض الزلال من خلال كيس الهواء مع إبرة تحت الجلد. الجنين، والتي تقع على رأس صفار البيض، وبعد ذلك تكمن أقل في البيض. هذه هي ميزة لبعض التقنيات، مثل Electroporation لل، ولكن يمكن أن يكون العيب إذا كان المطلوب معالجة جراحية للجنين.نجد وجود الجنين أقرب إلى فتحة في البيض ممكن هو ميزة.
ما زالت هناك تساؤلات بشأن الإشارات التي تتحكم في أطرافهم الفقاريات برعم تحريض وبدء والبروتوكولات التالية هي مناسبة لمعالجتها. نحن أول من وضع بروتوكول لإدخال الحواجز لمنع الفرخ برعم الطرف ثمرة في مرحلة مبكرة من المرحلة 12 8. ويمكن أيضا أن نسخ معدلة من هذه البروتوكولات يتم استخدامها لمعالجة مسائل أخرى على الأصل وتوقيت الاشارات الاستقرائي حيث تقع على الأنسجة على حث الوصول المتاخمة للمنشم التي يسببها. تقدم منطقة جنين يمكن الوصول إليها في هذه المرحلة التنموية ذات الصلة، ثم حاجز يمكن أن توضع بين الأنسجة والتغيرات اللاحقة في التنمية المدروسة. يمكن العثور على أمثلة في نمو الدماغ، والإرشاد محور والتنمية ربما الأعضاء مثل الكبد أو الكلى الاستقراء.
Protocol
Representative Results
Discussion
وصفنا استخدام الحواجز غير منفذة لمنع تشكيل براعم الأطراف في أجنة الدجاج. هذه التقنية لديها عدد من الخطوات الحاسمة. وبعد التجارب الأولية، وجدنا أن الحواجز يتوقف على شكل المستخدمة في 9 و 10 تبقى في مكانها في الجنين أفضل بكثير من الحواجز على التوالي. الجانب المسطح البعيدة من الجدار العصي على الغشاء المحي ويحافظ على حاجز في مكان (الشكل 2C). التحضير المتأني للالمفصلي على شكل حواجز من رقائق الألومنيوم كما هو موضح في البروتوكول خطوة 1.6 ضروري لنجاح العملية. والخطوة الثانية المهمة هي ضمان أن البيض لا استبعد من الحاضنة لفترة طويلة جدا بعد النوافذ وتنظيم قبل التشغيل على الجنين. في تجربتنا، والأجنة البقاء على قيد الحياة لعملية جراحية أفضل إذا كانوا في أو بالقرب من درجة حرارة الحضانة عند تنفيذ العملية. ولذلك، ينبغي تنفيذ العمليات في أسرع وقت ممكن والبيض أعادت موجهلاي لضمان بقاء معدلات جيدة. العديد من الباحثين إضافة قطرة من المضادات الحيوية إلى الجنين بعد جراحة قبل أن تعود البيض إلى الحاضنة. وجود السائل منعت الحواجز من الالتصاق جيدا في الموقف. يمكن إضافة المضادات الحيوية أيضا طرد حبات بعد التنسيب. لذلك لا تستخدم المضادات الحيوية، وعمليات سريعة ونظافة جيدة مع الصكوك ينصح لتجنب العدوى. محو الأدوات مع 70٪ من الإيثانول بعد كل مرحلة من مراحل العملية أمر ضروري لمنع الأدوات من أن تصبح لزجة من الاتصال مع الغشاء المحي الذي يمكن أن يسبب كل من الحواجز أو الخرز التمسك ملقط (انظر بروتوكول خطوة 3.1.2.2). كلا أصناف من الخرز المستخدمة يمكن تسقط من مكان بعد العملية. عندما تم فحص موقف حاجز في اليوم التالي لم يكن من الممكن أن نرى من خلال حاجز للتأكد ما إذا كانت حبة بقيت في مكانها أم لا. في الحالات التي يكون فيها حبة قد انخفض من لم انقاذ الجناح برعم ثمرة ( <stرونغ> الجدول 1). تجنب نقل السائل مع حبة عند زرعها يعني أن حبات عصا بسهولة أكبر إلى قطع وجه LPM (انظر بروتوكول 2.3.2.3). وأخيرا ضمان أن الأجنة ثابتة مباشرة بعد الحصاد أمر بالغ الأهمية لتحليل التعبير الجيني لاحق جيدة (انظر بروتوكول خطوة 4.2).
هذا البروتوكول يعدل التجارب التي نشرت في وقت سابق ان تستخدم الحواجز لمنع برعم الطرف بدء، ويعرف بعرض المثلى محددة الحواجز ويقدم الجمع بين الجدار ووضع حبة تليها تحليل التعبير الجيني. لقد وجدنا باستخدام رقائق الألومنيوم التقليدية، وهي رخيصة ومتاحة بسهولة في جميع المختبرات، وتنتج نتائج مساوية لتلك التي كانت تستخدم في السابق احباط التنتالوم. احباط يمكن أن تترك في الجنين عند تنفيذ في الموقع التهجين (الشكل 2C ') لكننا عادة إزالته إذا كان يتم تجهيزها أكثر من جنين واحد لمنع الحواف الحادة من احباط إتلاف الأجنة. Pأثبتت الدراسات في Ilot أن عرض الحواجز منطقة الساق أهمية خاصة. في البداية كانت الحواجز محاكمتهم قصيرة جدا ولم تمنع نمو الساق مهدها. 1،2-1،3 مم هو العرض الأمثل لحاجز لمنع الساق ثمرة برعم تماما. أضيق الحواجز الجناح يمكن للمرء أن وضع بدقة لمنع نمو برعم تعطي أفضل معدلات البقاء على قيد الحياة. وهذا يمكن أن تكون ضيقة مثل 0،5-0،7 مم. ومع ذلك، الحواجز التي هي أوسع قليلا من المرجح أن يؤدي إلى إتمام حظر الجناح برعم ثمرة لأنها تسمح لعدم دقة صغيرة من وضع (كنا 0،7-1 ملم). تجنب الأوعية الدموية عندما جعل شق أمر بالغ الأهمية للحواجز مستوى الجناح مهدها. وقد سبق استخدام حواجز شبه منفذة للشطر برعم كتكوت أطرافهم. MacCabe وباركر، 1976 وSummerbell، 1979 مرشحات كلاهما يستخدم 0.45 ميكرون و 0،8 ميكرون حجم المسام، على التوالي 16، 17. وذكرت ان اشارات إنتشاري يمكن أن تمر من خلال المسام في الفلاتر والتياكتسبت النتائج باستخدام حواجز شبه منفذة منتصف الطريق بين براعم الأطراف مع عدم وجود حاجز الحالي واحد مع حاجز احباط التنتالوم بردة. ويمكن تكييف هذا البروتوكول لاستخدام الحواجز شبه منفذ متفاوتة حجم المسام للتمييز إشارات مرشح على أساس الحجم أو تعديل ديناميكية انتشار إشارة.
هذا البروتوكول لديه العديد من القيود المرتبطة أساسا مع كائن النموذج نفسه. ويمكن استخدام هذه التقنيات لتحقيق المزيد من الأسئلة في تطوير أطرافه وأيضا أسئلة أخرى من التطور الجنيني الفقاريات. والشرط هو أن الجهاز / المنطقة المعنية يجب أن تتطور عند الجنين الفرخ هو الوصول إلى التدخل. وجود الأوعية الدموية الكبيرة في المنطقة حيث يحتاج إلى حاجز لتوضع يجعل في وقت لاحق حاجز تنسيب من المرحلة 13 أو 14 تحديا تقنيا. إذا يتم قطع الأوعية الدموية الكبيرة خلال وضع حاجز هذا يمكن أن يسبب وفيات الأجنة. تحقيقنا متى عوامل النسخ Tوبفعل bx5 وTbx4 لأول مرة في LPM كان محدودا من قبل أقرب المرحلة التي نحن يمكن أن تضع حاجزا من شأنه أن ينهي في وقت لاحق العكس إما الجناح أو برعم الساق على التوالي. كان من الممكن إلقاء الضوء على محاولة لمنع TBX تحريض الجينات في مراحل سابقة، أقرب إلى تكون المعيدة. يمكن وضعها في أقرب حاجز في منطقة الجناح الظني كان بنجاح مرحلة 8 و في مرحلة منطقة الساق 10. هذا البروتوكول هو ربما غير مناسبة لدراسة التعبير الجيني وراء مراحل برعم الطرف بسبب النمو السريع لاحق من شأنه أن يزيح الحاجز والنتائج أن تتصل فقط على الموقف المبدئي من الجدار.
بعد أن تتصل القيود المفروضة على أجنة الدجاج في هذا السياق، مزاياه أكثر الكائنات نموذج الفقاريات الأخرى كثيرة. الجنين الفرخ هو نموذج حيواني مناسبة جدا لهذا النوع من التدخل المادي في جنين الفقاريات. الأجنة كبيرة نسبيا، ويمكن الوصول إليها بسهولة throuGH قشر البيض. يمكن للمرء أن العودة إلى جنين لمزيد من التجارب (على سبيل المثال، وإزالة حبة 18 أو حتى حاجز) أو للاطمئنان على التقدم ببساطة عن طريق إزالة نافذة الشريط. وهناك مجال الممكن إدراج التصوير الحي أو الوقت الفاصل بين التصوير. نحن تصف طريقة وضع النوافذ بيض الدجاج التي تناسب بشكل خاص لتعمل على الأجنة مرحلة مبكرة. في حالة الدراسات أطرافهم من المهم والمفيد جدا أن هناك أحد أطرافه السيطرة المقابل لكل التجربة التي تعد بمثابة الرقابة الداخلية مثالية لكل تكرار البيولوجي.
لم يتم الابلاغ عن مزيج من استخدام الحواجز غير منفذة لمنع نمو الأطراف والخرز غارقة في الجزيئات يشير من قبل. لدينا تحليل مرنا التعبير التالي مثل هذه التدخلات هو أيضا رواية. هذه التقنيات مكنتنا من تشريح المشكلة الصعبة المتمثلة في حين عوامل أطرافهم النسخ محددة هي التي يسببها Tbx5 وTbx4 في LPM وأيضالتظهر في وقت لاحق، وذلك قبل بدء أطرافهم برعم، فإن وجود هذه الجينات TBX في LPM لا يكفي لتفعيل Fgf10 النسخ وبداية نمو برعم الطرف. أرقام 2G، 2D و 2E توضح هذه النتائج أيضا. غياب التعبير Tbx4 بعد الإدراج حاجز في المرحلة 10 في الشكل 2G هو في تناقض صارخ مع وجودها في 2D و 2E التالية الإدراج حاجز في المرحلة 15، بعد تحريض Tbx4. غرس حبات RA غارقة تسهيل إنقاذ برعم الطرف بدء التالية الإدراج الحاجز وحتى نقطة لالتهاب المفاصل الروماتويدي من و somites أساسية في عملية LPM قبل برعم الطرف ثمرة يمكن أن تبدأ. ويمكن استخدام هذه التقنيات على حل المزيد من الأسئلة في تطوير أطرافه ولكن أيضا أسئلة أخرى من التطور الجنيني من الفقاريات. ومن المرجح أن تكون مناسبة مناطق الدماغ والعين والجذع.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by MRC grant MC.PC_13052.
Materials
| Dumont No.5 watchmakers forceps, x2 | Fine Science Tools www.finescience.de | 11251-20 | |
| Dumont No.4 watchmakers forceps, x2 | Fine Science Tools www.finescience.de | 11241-30 | |
| Dumont strong forceps, type AA | Fine Science Tools www.finescience.de | 11210-10 | |
| Curved scissors with blades 2.5 cm long | Fine Science Tools www.finescience.de | 14061-11 | |
| Blunt ended curved forceps, | Fine Science Tools www.finescience.de | 11065-07 | |
| ends approx 0.5 cm long | |||
| Steel pin, 0.2 mm wide | Fine Science Tools www.finescience.de | 26002-20 | |
| Sharpening stone, square | Fine Science Tools www.finescience.de | 29008-01 | |
| Mineral oil | |||
| Needle holder | Fine Science Tools www.finescience.de | 26016-12 | |
| Clear tape, 50 mm x 66 m | www.5staroffice.com | 295985 | |
| FGF4 protein | A gift from Cliff Tabin. | ||
| all-trans-retinoic acid | Sigma www.sigmaaldrich.com | R2625-50MG | Remember to protect from light. |
| BMS 493 | Sigma www.sigmaaldrich.com | B6688-5MG | |
| Scalpel blade No. 15 | www.swann-morton.com | cat no. 0105 | |
| Affi-Gel Blue, affinity chromatography gel | Bio-Rad www.bio-rad.com | 153-7301 | Beads for delivering protein. |
| AG1-X2 Ion exchange resin | Bio-Rad www.bio-rad.com | 140-1251 | Beads for delivering RA or BMS 493. |
| Incubator for eggs | Memmert www.hce-uk.com | LAB128 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma www.sigmaaldrich.com | P6148-1KG | Harmful, irritant, corrosive. Handle powder in fumehood with full protective clothing. |
| Ethanol | Sigma www.sigmaaldrich.com | 32221-2.5L | |
| DMEM, high glucose | Gibco www.thermofisher.com | 41965-039 | 500ml |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific webshop.fishersci.com | D/4121/PB08 | 500ml |
| Binocular Microscope | Leica www.leica-microsystems.com | MZ6 | Replaced by M60 |
| Chicken eggs | Henry Stewart & Co Ltd sales@medeggs.com | Brown Eggs |
Riferimenti
- Murillo-Ferrol, N. L. Causal study of the earliest differentiation of the morphological rudiments of the extremities. Experimental analysis on bird embryos. Acta Anat (Basel). 62 (1), 80-103 (1965).
- Sweeney, R. M., Watterson, R. L. Rib development in chick embryos analyzed by means of tantalum foil blocks). Am J Anat. 126 (2), 127-149 (1969).
- Kieny, M. On the relations between somatic and somatopleural mesoderm before and during primary induction of chick embryo limbs. C R Acad Sci Hebd Seances Acad Sci D. 268 (26), 3183-3186 (1969).
- Pinot, M. The role of the somitic mesoderm in the early morphogenesis of the limbs in the fowl embryo. J Embryol Exp Morphol. 23 (1), 109-151 (1970).
- Eichele, G., Tickle, C., Alberts, B. M. Microcontrolled release of biologically active compounds in chick embryos: beads of 200-microns diameter for the local release of retinoids. Anal Biochem. 142 (2), 542-555 (1984).
- Cohn, M. J., et al. Fibroblast growth factors induce additional limb development from the flank of chick embryos. Cell. 80 (5), 739-746 (1995).
- Nishimoto, S., et al. RA Acts in a Coherent Feed-Forward Mechanism with Tbx5 to Control Limb Bud Induction and Initiation. Cell Rep. 12 (5), 879-891 (2015).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J Morphol. 88 (1), 49-92 (1951).
- Stephens, T. D., McNulty, T. R. Evidence for a metameric pattern in the development of the chick humerus. J Embryol Exp Morphol. 61, 191-205 (1981).
- Strecker, T. R., Stephens, T. D. Peripheral nerves do not play a trophic role in limb skeletal morphogenesis. Teratology. 27 (2), 159-167 (1983).
- Riddle, R. D., et al. Sonic hedgehog mediates the polarizing activity of the ZPA. Cell. 75 (7), 1401-1416 (1993).
- Ng, J. K., et al. The limb identity gene Tbx5 promotes limb initiation by interacting with Wnt2b and Fgf10. Devel. 129 (22), 5161-5170 (2002).
- Takeuchi, J. K., et al. Tbx5 and Tbx4 trigger limb initiation through activation of the Wnt/Fgf signaling cascade. Devel. 130 (12), 2729-2739 (2003).
- Lee, J., Tickle, C. Retinoic acid and pattern formation in the developing chick wing: SEM and quantitative studies of early effects on the apical ectodermal ridge and bud outgrowth. J Embryol Exp Morphol. 90, 139-169 (1985).
- Tickle, C., Crawley, A., Farrar, J. Retinoic acid application to chick wing buds leads to a dose-dependent reorganization of the apical ectodermal ridge that is mediated by the mesenchyme. Devel. 106 (4), 691-705 (1989).
- MacCabe, J. A., Parker, B. W. Evidence for a gradient of a morphogenetic substance in the developing limb. Dev Biol. 54 (2), 297-303 (1976).
- Summerbell, D. The zone of polarizing activity: evidence for a role in normal chick limb morphogenesis. J Embryol Exp Morphol. 50, 217-233 (1979).
- Wilde, S. M., Wedden, S. E., Tickle, C. Retinoids reprogramme pre-bud mesenchyme to give changes in limb pattern. Devel. 100 (4), 723-733 (1987).
