La production de cellules souches pluripotentes de souris amniotique Cellules Fluid Utilisation d'un système de transposon

Le diagnostic prénatal est un outil clinique important d'évaluer les maladies génétiques (ie des aberrations chromosomiques, des maladies monogéniques ou polygéniques / multifactorielle) et des malformations congénitales (hernie diaphragmatique congénitale ie, lésions pulmonaires kystiques, omphalocèle, gastroschisis). Cellules de liquide amniotique (AF) sont simples à obtenir des procédures régulièrement programmées au cours du deuxième trimestre de la grossesse (c. -à- amniocentèse et amnioreduction) ou césariennes ^{1, 2.} La disponibilité des cellules AF de patients prénatales ou néonatales offre la possibilité d'utiliser cette source pour la médecine régénérative, et plusieurs chercheurs ont étudié la possibilité de traiter les dommages ou les maladies des tissus différents en utilisant une population de cellules souches isolées à partir AF ^{3, 4, 5, 6}, ^{7, 8, 9, 10, 11, 12.} La possibilité d'obtenir facilement les cellules AF chez des patients malades, dans une fenêtre de temps dans lequel la maladie est souvent fixe, ouvre la voie à l'idée d'utiliser cette source de cellules à des fins de reprogrammation. En effet, souches pluripotentes induites (iPS) des cellules dérivées de cellules AF pourraient être différenciés dans les cellules d'intérêt pour les tests in vitro de médicaments ou pour les approches d'ingénierie tissulaire, afin de préparer une thérapie adéquate spécifique au patient avant l' accouchement. De nombreuses études ont déjà démontré la capacité des cellules AF à être reprogrammé et différenciées dans un large éventail de types de cellules ^{13, 14, 15, 16, 17 <}/ ^{sup>, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27.}

Depuis la découverte par Takahashi et Yamanaka ²⁸ des cellules somatiques reprogrammées par l'expression forcée de quatre facteurs de transcription (Oct4, Sox2, cmyc et Klf4), des progrès ont été accomplis dans le domaine de la reprogrammation. Compte tenu des différentes méthodes, on peut distinguer entre les approches virales et non virales. Le premier attend l'utilisation de vecteurs viraux (rétrovirus et lentivirus), qui ont un rendement élevé, mais silencieux généralement incomplète du transgène rétroviral, à la fois la conséquence d'une lignée de cellules partiellement reprogrammée et le risque deinsertionnelle mutagenèse ^{29, 30, 31.} La méthode non virale utilise des stratégies différentes: à savoir les plasmides, les vecteurs, les ARNm, les protéines, les transposons. La dérivation de cellules iPS libres de séquences transgéniques vise à contourner les effets potentiellement nocifs de l'expression du transgène qui fuit et la mutagenèse insertionnelle. Parmi toutes les stratégies non viraux mentionnés ci – dessus, le PiggyBac (PB) du système de transposon / transposase ne nécessite que les répétitions terminales inversées qui flanquent un transgène et de l' expression transitoire de l'enzyme transposase pour catalyser l' insertion ou l' excision d' événements de ^32. L'avantage d'utiliser transposons sur les autres méthodes pour iPS génération de cellules est la possibilité d'obtenir des cellules sans vecteur-iPS avec une approche de vecteur non viral qui montre la même efficacité des vecteurs rétroviraux. Ceci est possible en trace-moins excision du codage de transposon intégré pour la reprogrammation facteurs suite à une nouvelle expression transitoire de la transposase dans les cellules iPS ^33. Étant donné que le PB est efficace dans différents types de cellules ^{34, 35, 36, 37,} est plus approprié pour une approche clinique en ce qui concerne les vecteurs viraux, et permet la production de cellules iPS libre xéno-contrairement aux protocoles de production viraux actuels qui utilisent des xénobiotiques conditions, ce système est utilisé pour obtenir des cellules iPS à partir AF murin.

Ici , nous proposons un protocole détaillé qui suit les travaux déjà publiés pour montrer la production de iPS pluripotentes clones à partir de cellules de souris AF (cellules iPS-AF) ^38.