İzolasyon, Farklılaşma ve Niceleme İnsan Kanı B Hücreleri Antikor salgılayan: ELISPOT Hümoral Bağışıklık bir Fonksiyonel Göstergesi'nin olarak
Summary
Human peripheral blood is commonly used for the assessment of the humoral immune response. Here, the methods for isolating human B cells from peripheral blood, differentiating human B cells into antibody (Ab)-secreting B cells (ASCs) in culture, and enumerating the total IgM- and IgG-ASCs via an ELISpot assay are described.
Abstract
humoral bağışıklık damgasını sentez ve bir patojen olarak bir antijen (Ag), özel Abs salgılar ve ana savunma için kullanılan fonksiyonel TSK, üretmektir. Bir bireyin hümoral bağışıklık tepkisinin fonksiyonel kantitatif tayini, serum Abs ve dolaşan TSK hem yaygın fonksiyonel çıktılan olarak ölçülür. İnsanlarda, çevresel kan ana B hücreleri tarafından ortaya hümoral bağışıklık tepkisinin saptanması için kullanılabilecek en uygun ve kolayca erişilebilir bir örneğidir. TSK kapsamda, farklı B hücresi alt-gruplar, akış sitometrisi ile sıralama seri spesifik Ab-konjuge mikro-veya hücre aracılığıyla seçim yoluyla periferal kandan doğrudan izole edilebilir. Ayrıca, arıtılmış naif ve bellek B hücreleri, aktive edilmiş ve kültür TSK olarak ayırt edilebilir. Ab salgılama katkıda TSK fonksiyonel aktivitesi, Enzim yakınsar bir deney olan, elispot testi ile tayin edilebilirB-bağlı immunoabsorbance deneyi (ELISA) ve Western lekeleme teknolojileri tek hücre düzeyinde tek tek TSK numaralandırılmasına sağlamaktır. Uygulamada, ELISPOT testi artan için kan örnekleri, çok sayıda kullanım kolaylığı aşı etkinliğini değerlendirmek için kullanılmıştır. Periferik kandan insan B hücrelerini izole edilmesi yöntemleri, in vitro TSK olarak B hücrelerinin farklılaşmasını ve toplam IgM- IgG-TSK miktarının ELISPOT istihdam burada tarif edilecektir.
Introduction
B hücreleri, humoral bağışıklığın gelişiminde önemli bir rol oynar. Onlar başlangıçta kemik iliğinde gelişir ve daha da geliştirilmesi için naif gibi dalak gibi lenfoid dokularda geçebilecek B hücreleri, lenf düğümleri ve bademcikler, kan akışı girin. Ag karşılaşma üzerine, bazı naif B hücreleri germinal merkez B hücreleri bellek B hücreleri ve plazmablastlar (PB) / plazma hücrelerinin (PC) içine ayırt edebilirsiniz lenfoid follikül içine göç ederler. En PB / PC'ler kan akışına çıkış yaparken, birkaç sonunda uzun ömürlü PC'ler 1 içine terminal farklılaşma geçmesi kemik iliğinde bulunur. Dolaşımdaki B hücreleri heterojen ve kararlı durumda, PB / PC'ler, periferik kanda 2 nadirdir. seri spesifik yüzey markerlerinin durumunu bir sonucu olarak, akış sitometrisi periferik kanda B-hücresi alt kümelerinin tanımlanması ve karakterizasyonu için uygun bir yöntem haline gelmiştir. Akış cytometr bir genişletilmiş uygulamaY, yüksek saflıkta ayrılmasını ve B hücrelerinin tek tek alt kümelerinin izole edilmesine izin veren, bir hücre sıralayıcı fonksiyonu eklenmesidir. İnsan dolaşımdaki B hücreleri, genel olarak üç temel alt popülasyonları sınıflandırılır farklı gelişim aşamalarında spesifik yüzey reseptörlerinin ekspresyonu göre: bellek B hücreleri (CD19 + CD27 + CD38 -) saf B hücreleri – (- CD38 CD19 + CD27) ve PB / PC (CD19 + CD27 + CD38 +) 3-4 (Şekil 1). doğası gereği Naif B hücreleri Ag'lerini karşılaşmadım. Bununla birlikte, IgM + CD27 + bellek B hücrelerine ayırt edilebilir. Naif B hücreleri B-hücresi antijen reseptörü (BCR) -associated molekülleri (örneğin, CD19, CD20 ve CD22) onların immünoglobulin repertuarı 5 heterojen ifade homojen olmasına rağmen. CD27 + bellek B hücrelerinin büyük bir çoğunluğu CD27 olarak ayırt edilebilir+ / hi CD38 + PB / PC'ler 6. Buna ek olarak, hafıza B hücreleri, ve PBS / PC poliklonal ve gelişimsel ve fonksiyonel heterojenliği 4-7 sergiler. dolaşımda PB / PC'ler normalde kısa ömürlü ve CD138 ifade etmezler, ancak kemik iliğinde yerleşmek için yapılanlar ölümcül farklılaştırmak ve uzun ömürlü olacaktır. Terminal farklılaşmış PC'ler CD138 ifade ve yüzeyleri 8 CD27 molekülleri aşağı-düzenler. PB ve PC'ler hem Abs salgılayan yeteneğine sahip olduğundan, pek çok kez onlar topluca TSK olarak belirtilir. Buna mukabil, naif B hücreleri de bellek B hücreleri de Abs 9-10 kayda değer miktarda üretebilir. Uygun kültür koşulları 6, 11-15 yerleştirildiğinde 10 gün – izole Yine de, hem naif ve bellek B hücreleri 3 TSK içine ayırt edilebilir. Aslında, TSK bu doğrudan izole fr ile CD27 ve CD38 in vitro farklılaştırma payı benzer yüzey ifadeler türetilmişom periferik kan 6. Buna ek olarak, in vitro farklılaşan TSK bu PBS / PC 6 dolaşan benzer yüzey CD20 düşük seviyede eksprese eder. kültür kaynaklı TSK tüm kısa ömürlü olmasına rağmen, onlar işlevsel yetkin ve hümoral bağışıklık katkıda mümkün olduğunu belirten Abs salgılar olabilir.
kadar en sık uygulanan yöntemler hümoral immün yanıta fonksiyonel bilgi elde etmek için ELISA ve ELISpot hem de. ELISA 96 gözlü plaka bazlı deney, ve sık sık, serum Ag-spesifik Abs ve diğer analitler (örneğin, sitokinler) titreleri ölçmek için kullanılır. Bu uygun ve ölçeklenebilir. ELISA Sıvı bir numunede 16, ABS veya serum gibi diğer maddelerin varlığını tespit etmek için bir katı-faz enzim tahlili kullanmak üzere tasarlanmıştır. Serum ELISA ile ilgili okumalar yaygın vücudun bağışıklık tepkisini temsil etmek için kullanılmaktadır. yeniden kazanılması için gerekli bir araçELISA tahlilleri ile ilgili adouts bir spektrofotometrik mikroplaka okuyucu. Okuyucu, tipik olarak yaban turbu peroksidazı (HRP) ile birleştirilmiş bayır algılama Abs ve spesifik alt tabakalar 17 reaksiyonundan elde edilen son ürünlerin optik yoğunluk (OD) belirleyebilir. humoral immün tepkisi raporlama ile ilgili olarak, ELISA ile tespit serum antikor düzeyleri vücutta TSK toplu, ancak tek tek değil, performans belirtmektedir. Buna ek olarak, ELISA dikkate Abs salgılar yok bellek B hücreleri tarafından katılımını almak için başarısız olur.
ELISA gibi, ELISpot tespit ve periferik kan örnekleri 17-18 bağışıklık yanıtı izlemek için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. ELISPOT bir sandviç ELISA ile ilgili bir tekniktir. İçinde hücre polivinilidin diflorin (PVDF) kısa süreli bir kültür 96 çukurlu mikrolevhaların membran destekli kuyu içine yerleştirilir. ELISpot tahlil bir mikroplaka ve developin batı blotting gerçekleştirmeden benzerdirg her kuyuda PVDF zarı üzerinde lekeler. Bir otomatik ELISpot okuyucu sistemi veya elle sayım için bir stereomikroskopta gereklidir. bir bağışıklık tepkisinin tespit bölgesindeki ELISPOT ana avantajı TSK ve sitokin salgılayan hücrelerin miktarının onun süper hassasiyettir. Sırasıyla, humoral ve hücresel bağışıklık işlevsel faaliyetlerini bildirir. Hümoral bağışıklık fonksiyonu ölçümünde, ELISA ve ELISPOT tarafından numaralandırılan TSK sayısına göre belirlenir serum Ab düzeyleri sıklıkla ilişkilidir, ancak bu iki deneyleri veri readouts fonksiyonel etkileri 19-20 bazı farklılıklar var. ELISPOT ana avantajı yönteminin onun hassasiyetidir. Abs uygun izotiplerinin bilinen bir miktarı, referans olarak dahil edildiğinde, ELISA ile belirlendiği şekilde, serum antikor titrelerinin seviyesi konsantrasyon çıktılan olarak, daha çok nicel göre antikor seviyesi gösteren OD çıktılan olarak da yarı-nicel olarak sunulmaktadır, ya da. Bunun aksine, ELISPOT sonuçları presente olanilgi konusu bir hücre havuzu TSK mutlak sayısı D (ör bölünmemiş periferal kan tek-çekirdekli hücreleri (PBMC) ve PBMC'lerden Saflaştırılmış B hücreleri) içerir. ELISpot tek ASC algılayabilir, ancak ELISA ölçümden önce optimize tahlil bağımlı konsantrasyonları ulaşmak için TSK dan Ab miktarda gerektirir. Bu nedenle, ELISpot ölçümü duyarlılığı ELISA besbelli üstündür. Ayrıca, ELISPOT, aynı zamanda aktive edilmiş hafıza B hücreleri in vitro farklı TSK ölçülmesi için uygundur. Bellek B hücreleri Abs salgılar yok ama aktivasyon üzerine TSK içine ayırt edebilirsiniz; bu nedenle ELISA ile tespit edilen serum Abs hiçbir katkısı var. Bu nedenle, ELISPOT kültüründe aktif hale bellek B hücrelerinin, dolaşımdaki bağışıklık tepkisinin ölçümü tercih edilen bir yöntemdir. Uzun vadeli humoral bağışıklığın bakım izlenmesi için izin verir.
Protocol
Representative Results
Discussion
İzolasyon ve İnsan periferal kan B hücrelerinin saflaştırılması
Normalde, RBCs verimli rüptüre ve lizis tamponu (adım 1.2) tarafından silinebilir. hücre canlılığı amonyum klorür ile etkilenebilir gibi, 5 dakika daha uzun RBC parçalama tamponu ile PBMC'ler inkübe önemlidir. Seçenek olarak ise, RBC ve trombositlerin aynı zamanda aşağıdaki protokol ile temizlenebilir.
asit dekstroz sitrat (ACD) tamponu taze tam kan karıştırın (39 mM sit…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by a research grant from the Ministry of Science and Technology of the Executive Yuan of Taiwan (NSC99-2320-B-002-011). I would like to acknowledge the excellent service provided by the Flow Cytometric Analyzing and Sorting Core of the First Core Laboratory in College of Medicine of National Taiwan University.
Materials
| BD Vacutainer K2E | BD Biosciences | 367525 | 10 ml tube |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-02 | endotoxin-free |
| Trypan blue 0.5% solution | Biological Industries | 03-102-1B | |
| IMag Human B lymphocyte enrichment set | BD Biosciences | 558007 | |
| Biotinylated CD27 mAb | Biolegend | 302804 | clone O323 |
| Streptavidin magnetic microbeads | BD Biosciences | 9000810 | |
| 15 ml Falcon tubes | BD Falcon | 352196 | |
| Blue nylon mesh cell strainer, 40 μm | BD Falcon | 352340 | |
| Anti-human CD19-APC | Biolegend | 302212 | clone HIB19 |
| Anti-human CD27-eFluor 450 | eBioscience | 48-0279-42 | clone O323 |
| Anti-human CD38-PE-Cy7 | Biolegend | 303516 | clone HIT2 |
| Anti-human CD38-PE-Cy7 | BD Biosciences | 560677 | clone HIT2 |
| Anti-human CD45-FITC | Biolegend | 304006 | clone HI30 |
| Anti-human CD45-FITC | BD Biosciences | 555482 | clone HI30 |
| Anti-mouse/rat/human CD27-PerCP Cy5.5 | Biolegend | 124213 | clone LG.3A10 |
| Anti-human CD27-PerCP Cy5.5 | BD Biosciences | 65429 | clone L128 |
| Anti-human CD19-FITC | Miltenyi Biotec | 130-098-064 | clone LT19 |
| Anti-human CD19-FITC | GeneTex | GTX75599 | clone LT19 |
| Anti-human CD20-FITC | BD Biosciences | 555622 | clone 2H7 |
| biotinylated anti-human CD27 | Biolegend | 302804 | clone O323 |
| biotinylated anti-human CD27 | eBioscience | 13-0279-80 | clone O323 |
| 7-aminoactinomycin D (7-AAD) | BD Biosciences | 559925 | |
| CpG (ODN 2006) | InvivoGen | tlrl-2006 | type B CpG |
| Recombinant human IL-2 | PeproTech | 200-02 | |
| Recombinant human IL-10 | PeproTech | 200-10 | |
| Recombinant human IL-21 | PeproTech | 200-21 | |
| Recombinant human sCD40L | PeproTech | 310-02 | |
| Protein A of S. aureus Cowan (SAC) | Sigma-Aldrich | 82526 | |
| Pokeweed mitogen (PWM) | Sigma-Aldrich | L9379 | |
| MultiScreen filter plates, 0.45 µm pore size | Merck Millipore | MSIPS4510 | sterile, clear 96-well filter plate with hydrophobic PVDF membrane |
| BCIP/NBT solution | Sigma-Aldrich | B6404 | |
| BCIP/NBT single reagent, alkaline phosphatase substrate | Merck Millipore | ES006 | |
| Human IgG | Jackson ImmunoResearch | 009-000-003 | |
| Human IgG, Fc fragment | Jackson ImmunoResearch | 009-000-008 | |
| F(ab')2 fragment of goat anti-human Ig (IgG+IgM+IgA) | Jackson ImmunoResearch | 109-006-127 | |
| Goat anti-human IgG-alkaline phosphatase, Fcγ fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 109-055-008 | |
| Goat anti-human IgM-alkaline phosphatase, Fcµ fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 109-055-095 | |
| Goat anti-human IgG-peroxidase, Fcγ fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 109-035-008 | |
| Goat anti-human IgM-peroxidase, Fcµ fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 109-035-095 | |
| BD ELISPOT AEC substrate kit | BD Biosciences | 551951 | |
| C.T.L. ImmunoSpot analyzer | C.T.L. |
Riferimenti
- Bemark, M. Translating transitions – how to decipher peripheral human B cell development. J. Biomed. Res. 29 (4), 264-284 (2015).
- Odendahl, M., et al. Generation of migratory antigen-specific plasmablasts and mobilization of resident plasma cells in a secondary immune response. Blood. 105 (4), 1614-1621 (2005).
- Jackson, S. M., Wilson, P. C., James, J. A., Capra, J. D. Human B cell subsets. Adv. Immunol. 98, 151-224 (2008).
- Sanz, I., Wei, C., Lee, F. E., Anolik, J. Phenotypic and functional heterogeneity of human memory B cells. Semin. Immunol. 20 (1), 67-82 (2008).
- Perez-Andres, M., et al. Human peripheral blood B-cell compartments: A crossroad in B-cell traffic. Cytometry B Clin. Cytom. 78 (Suppl 1), S47-S60 (2010).
- Huggins, J., et al. CpG DNA activation and plasma-cell differentiation of CD27- naïve human B cells. Blood. 109 (4), 1611-1619 (2007).
- Wu, Y. C., Kipling, D., Dunn-Walters, D. K. The relationship between CD27 negative and positive B cell populations in human peripheral blood. Front. Immunol. 2, 81 (2011).
- Maïga, R. I., Bonnaure, G., Rochette, J. T., Néron, S. Human CD38hiCD138⁺ plasma cells can be generated in vitro from CD40-activated switched-memory B lymphocytes. J. Immunol. Res. 2014, 635108 (2014).
- Wienands, J., Engels, N. The memory function of the B cell antigen receptor. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 393, 107-121 (2016).
- Kurosaki, T., Kometani, K., Ise, W. Memory B cells. Nat. Rev. Immunol. 15 (3), 149-159 (2015).
- Tzeng, S. J., Li, W. Y., Wang, H. Y. FcγRIIB mediates antigen-independent inhibition on human B lymphocytes through Btk and p38 MAPK . J. Biomed. Sci. 22, 87-98 (2015).
- Ettinger, R., et al. IL-21 induces differentiation of human naïve and memory B cells into antibody-secreting plasma cells. J. Immunol. 175 (12), 7867-7879 (2005).
- Bekeredjian-Ding, I., Foermer, S., Kirschning, C. J., Parcina, M., Heeg, K. Poke weed mitogen requires Toll-like receptor ligands for proliferative activity in human and murine B lymphocytes. PLoS One. 7 (1), e29806 (2012).
- Bernasconi, N. L., Traggiai, E., Lanzavecchia, A. Maintenance of serological memory by polyclonal activation of human memory B cells. Science. 298 (5601), 2199-2202 (2002).
- Defrance, T., Vanbervliet, B., Brière, F., Durand, I., Rousset, F., Banchereau, J. Interleukin 10 and transforming growth factor beta cooperate to induce anti-CD40-activated naive human B cells to secrete immunoglobulin A. J. Exp. Med. 175 (3), 671-682 (1992).
- Hornbeck, P., Fleisher, T. A., Papadopoulos, N. M., Coligan, J. E. Chapter 2, Unit 2.2, Isotype determination of antibodies. Current Protocols in Immunology. , (2001).
- Tanguay, S., Killion, J. J. Direct comparison of ELISPOT and ELISA-based assays for detection of individual cytokine-secreting cells. Lymphokine Cytokine Res. 13 (4), 259-263 (1994).
- Crotty, S., Aubert, R. D., Glidewell, J., Ahmed, R. Tracking human antigen-specific memory B cells: a sensitive and generalized ELISPOT system. J. Immunol. Methods. 286 (1-2), 111-122 (2004).
- Zhang, Y., Wang, Y., Zhang, M., Liu, L., Mbawuike, I. N. Restoration of retarded influenza virus-specific immunoglobulin class switch in aged mice. J. Clin. Cell. Immunol. 7 (2), 403 (2016).
- Doedée, A. M., Kannegieter, N., Öztürk, K., van Loveren, H., Janssen, R., Buisman, A. M. Higher numbers of memory B-cells and Th2-cytokine skewing in high responders to hepatitis B vaccination. Vaccine. 34 (19), 2281-2289 (2016).
- Heine, G., Sims, G. P., Worm, M., Lipsky, P. E., Radbruch, A., Coligan, J. E. Chapter 7, Unit 7.5, Isolation of human B cell populations. Current Protocols in Immunology. , (2011).
- Safarík, I., Safaríková, M. Use of magnetic techniques for the isolation of cells. J. Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl. 722 (1-2), 33-53 (1999).
- Morbach, H., Eichhorn, E. M., Liesem, J. G., Girschickm, H. J. Reference values for B cell subpopulations from infancy to adulthood. Clin. Exp. Immunol. 162 (2), 271-279 (2010).
- Thornton, A. M., et al., Coligan, J. E., et al. Chapter 3, Unit 3.5A, Fractionation of T and B cells using magnetic beads. Current Protocols in Immunology. , (2003).
- Klein, U., Rajewsky, K., Küppers, R. Human immunoglobulin (Ig)M+IgD+ peripheral blood B cells expressing the CD27 cell surface antigen carry somatically mutated variable region genes: CD27 as a general marker for somatically mutated memory)Bcells. J.Exp. Med. 188 (9), 1679-1689 (1998).
- Bohnhorst, J. &. #. 2. 1. 6. ;., Bjørgan, M. B., Thoen, J. E., Natvig, J. B., Thompson, K. M. Bm1-Bm5 classification of peripheral blood B cells reveals circulating germinal center founder cells in healthy individuals and disturbance in the B cell subpopulations in patients with primary Sjögren’s syndrome. J. Immunol. 167 (7), 3610-3618 (2001).
- Bleesing, J. J., et al., Coligan, J. E., et al. Chapter 7, Unit 7.35, Assays for B cell and germinal center development. Current Protocols in Immunology. , (2003).
- Horvatinovich, J. M., Sparks, S. D., Mann, K. P. Establishing a pure lymphocyte gate for subset analysis by flow cytometry. Cytometry. 26 (2), 172-177 (1996).
- Ruprecht, C. R., Lanzavecchia, A. Toll-like receptor stimulation as a third signal required for activation of human naive B cells. Eur. J. Immunol. 36 (4), 810-816 (2006).
- Smith, K., et al. Rapid generation of fully human monoclonal antibodies specific to a vaccinating antigen. Nat. Protoc. 4 (3), 372-384 (2009).
- Caraux, A., et al. Circulating human B and plasma cells. Age-associated changes in counts and detailed characterization of circulating normal CD138- and CD138+ plasma cells. Haematologica. 95 (6), 1016-1020 (2010).
- Kuchen, S., Robbins, R., Sims, G. P., Sheng, C., Phillips, T. M., Lipsky, P. E., Ettinger, R. Essential role of IL-21 in B cell activation, expansion, and plasma cell generation during CD4+ T cell-B cell collaboration. J. Immunol. 179 (9), 5886-5896 (2007).
- Pinna, D., Corti, D., Jarrossay, D., Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Clonal dissection of the human memory B-cell repertoire following infection and vaccination. Eur. J. Immunol. 39 (5), 1260-1270 (2009).
- Jahnmatz, M., et al. Optimization of a human IgG B-cell ELISpot assay for the analysis of vaccine-induced B-cell responses. J. Immunol. Methods. 391 (1-2), 50-59 (2013).
- Weiss, G. E., et al. High efficiency human memory B cell assay and its application to studying Plasmodium falciparum-specific memory B cells in natural infections. J. Immunol. Methods. 375 (1-2), 68-74 (2012).
- Leehan, K. M., Koelsch, K. A. T Cell ELISPOT: For the identification of specific cytokine-secreting T cells. Methods. Mol. Biol. 1312, 427-434 (2015).
- Karahan, G. E., et al. Quantification of HLA class II-specific memory B cells in HLA-sensitized individuals. Hum. Immunol. 76 (2-3), 129-136 (2015).
- Hadjilaou, A., Green, A. M., Coloma, J., Harris, E. Single-cell analysis of B cell/antibody cross-reactivity using a novel multicolor FluoroSpot assay. J. Immunol. 195 (7), 3490-3496 (2015).
- Janetzki, S., Rueger, M., Dillenbeck, T. Stepping up ELISpot: multi-level analysis in FluoroSpot assays. Cells. 3 (4), 1102-1115 (2014).
- Alatrakchi, N., Graham, C. S., He, Q., Sherman, K. E., Koziel, M. J. CD8+ cell responses to hepatitis C virus (HCV) in the liver of persons with HCV-HIV coinfection versus HCV monoinfection. J. Infect. Dis. 191 (5), 702-709 (2005).
- Smith, S. G., et al. Identification of major factors influencing ELISpot-based monitoring of cellular responses to antigens from Mycobacterium tuberculosis. PLoS. One. 4 (11), e7972 (2009).
- Sundararaman, S., et al. High reproducibility of ELISPOT counts from nine different laboratories. Cells. 4 (1), 21-39 (2015).
- Janetzki, S., et al. Guidelines for the automated evaluation of Elispot assays. Nat. Protoc. 10 (7), 1098-1115 (2015).
