O isolamento, a diferenciação e a quantificação de anticorpo humano secretoras de células B de sangue: ELISpot como uma leitura funcional de Imunidade Humoral

As células B desempenham um papel central no desenvolvimento da imunidade humoral. Eles inicialmente se desenvolvem na medula óssea e entram na corrente sanguínea como células naive B, que podem migrar para os tecidos linfóides, tais como o baço, nódulos linfáticos, amígdalas, e para um maior desenvolvimento. Após a Ag encontro, algumas células B naïve migrar para folículos linfóides, onde as células de centro germinal B podem se diferenciar em células B de memória e plasmablasts (PBS) / células plasmáticas (PCs). Enquanto a maioria dos computadores PBS / egressos para a corrente sanguínea, alguns, eventualmente, residem na medula óssea a sofrer diferenciação terminal em PCs ¹ de vida longa. As células B em circulação são heterogêneos, e no estado estacionário, PBS / PCs são raros no sangue periférico ^2. Como resultado da disponibilidade de marcadores de superfície específicos da linhagem, citometria de fluxo tornou-se um método popular para a identificação e caracterização das subpopulações de células B no sangue periférico. Uma aplicação alargada dos cytometr fluxoy é a adição de uma função de separação de células, que permite a separação e isolamento de subconjuntos individuais de células B com elevada pureza. Com base na expressão de receptores de superfície específicos em diferentes fases de desenvolvimento, as células B circulantes humanos são geralmente classificados em três subpopulações principais: células B virgens (CD19 ⁺ CD27 ^– CD38 ^-), células B de memória (CD19 ⁺ CD27 ⁺ CD38 ^-), e PBS / PCS (CD19 ⁺ CD27 ⁺ CD38 ^{+) 3-4} (Figura 1). células B virgens, por natureza, não encontrei Ags. No entanto, eles podem ser diferenciadas em células CD27 ⁺ IgM ⁺ B de memória. Embora as células B virgens são homogêneos em expressar receptor do antigénio das células B (BCR) moléculas -associated (por exemplo, CD19, CD20 e CD22) eles são heterogêneos em seu repertório imunoglobulina ^5. A maioria das células CD27 ⁺ B de memória podem ser diferenciados em CD27+ / CD38 ⁺ oi PBS / PCs ^6. Além disso, as células B de memória e PBS / PCs são policlonais e exibem desenvolvimento e funcionais heterogeneidade ^4-7. PBS / PCs em circulação são normalmente de curta duração e não expressam CD138, mas aqueles feitos para se estabelecer na medula óssea irá terminal diferenciar e se tornar longa duração. Terminalmente PCs diferenciadas expressam CD138 e para baixo-regular moléculas CD27 em suas superfícies ^8. Uma vez que tanto PBS e PCs são capazes de secretar Abs, em muitas ocasiões, eles são colectivamente denotado como ASC. Em contraste, nem as células B naive nem células B de memória pode produzir quantidades apreciáveis de Abs ^9-10. No entanto, quando isolados, tanto em células B naive e de memória podem ser diferenciadas em ASC em 3 – 10 dias, quando colocado em condições de cultura adequadas ^{6, 11-15.} Na verdade, ASC derivado in vitro compartilhar diferenciação expressões superficiais semelhantes de CD27 e CD38 com os fr diretamente isoladosangue periférico om ^6. Além disso, as ASC diferenciadas in vitro expressam um baixo nível de superfície CD20, semelhante que circula de PBS / PCs ^6. Embora as ASC derivado de cultura são todos de curta duração, podem secretar Abs, indicando que eles são funcionalmente competentes e capazes de contribuir para a imunidade humoral.

Ambos ELISA e ELISpot são, de longe, os métodos mais geralmente aplicado com o qual para obter informação funcional sobre a resposta imunológica humoral. ELISA é um ensaio baseado em placa de 96 poços, e é frequentemente utilizado para medir os títulos de soro Abs Ag-specific e outros analitos (por exemplo, citocinas). É conveniente e escalável. ELISA foi concebido para utilizar um ensaio de enzima de fase sólida para detectar a presença de ABS ou de outras substâncias, tais como soro, numa amostra ^de líquido ^16. As leituras de ELISA no soro têm sido amplamente utilizados para representar a resposta imune do corpo. Uma ferramenta necessária para a aquisição de readouts de ensaios de ELISA é um leitor de microplacas espectrofotométrico. O leitor pode determinar a densidade óptica (DO) dos produtos finais normalmente resultantes da reacção de peroxidase de rábano (HRP) Abs detecção -conjugated e seus substratos específicos ^17. No que diz respeito a informações sobre a resposta imunológica humoral, os níveis de soro AB determinado por ELISA representam a colectiva, mas não indivíduo, o desempenho de ASC no corpo. Em adição, a ELISA não tem em conta a participação de células B de memória, que não secretam Abs.

Tal como ELISA, ELISpot é um método amplamente utilizado para a detecção e monitorização da resposta imunitária em amostras de sangue periférico ^17-18. ELISpot é uma técnica relacionada com um ELISA de tipo sanduíche. Nele, as células são colocadas dentro do difluoreto de polivinilideno (PVDF) poços apoiados por uma membrana de microplacas de 96 poços para uma cultura de curto prazo. O ensaio ELISpot é análoga à execução de uma transferência de Western em microplacas e developing as manchas na membrana de PVDF em cada poço. Um sistema de leitor de ELISpot automatizado ou um estereomicroscópio para contagem manual é necessária. A principal vantagem de ELISpot na detecção de uma resposta imunitária é a sua excelente sensibilidade na quantificação da ASC e células secretoras de citocinas. Ela reporta as suas actividades funcionais na imunidade humoral e celular, respectivamente. Na medição da função imune humoral, os níveis de soro AB determinado por ELISA e o número de ASC enumerados por ELISPOT são frequentemente correlacionados, mas as leituras de dados a partir destes dois ensaios têm algumas diferenças em implicações funcionais ^19-20. A principal vantagem de ELISpot é a sua sensibilidade do método. O nível dos títulos de soro AB como relatado por ELISA apresenta-se semi-quantitativamente, como leituras de DO, que denota o nível de Ab relativa, ou mais quantitativamente, como leituras de concentração quando uma quantidade conhecida dos isotipos apropriados de Abs é incluída para referência. Em contraste, os resultados de ELISpot são Presented como o número absoluto de ASC em uma associação de células de interesse (por exemplo, células não fraccionadas mononucleares de sangue periférico (PBMC) e células B purificadas a partir de PBMCs). ELISpot pode detectar um único ASC, mas ELISA requer quantidades ab a partir da ASC para atingir concentrações dependente de ensaio optimizadas antes da medição. Assim, é obviamente superior ELISpot para ELISA na sensibilidade da quantificação. Além disso, também ELISpot é adequada para a quantificação dos ASC diferenciadas in vitro a partir de células B de memória activadas. células B de memória não secretam Abs, mas podem se diferenciar em ASC sobre a ativação; Eles, portanto, não tem nenhuma contribuição para Abs de soro detectados por ELISA. Assim, ELISpot é o método de escolha para a medição da resposta imune de células de memória B em circulação após a activação em cultura. Ele permite o acompanhamento da manutenção da imunidade humoral a longo prazo.