Ein Nicht-invasive und in technischer Hinsicht nicht intensive Verfahren zur Induktion und Phänotypisierung für experimentelle bakterielle Pneumonie bei Mäusen
Summary
Verschiedene Verfahren wurden für die Modellierung von bakterieller Pneumonie bei Mäusen in der Literatur beschrieben. Hier beschreiben wir eine nicht-invasive, kostengünstige, schnelle Methode zur Lungenentzündung durch Aspiration induzierenden (dh Inhalation) eines bakteriellen Inokulums in den Oropharynx pipettiert. Downstream Methoden zur Beurteilung der Lungen angeborenen Immunantwort sind auch detailliert.
Abstract
Obwohl ambulant erworbener Pneumonie ein großes Problem der öffentlichen Gesundheit bleibt, haben murine Modelle von bakteriellen Pneumonie kürzlich signifikante präklinische Fortschritte in unserem Verständnis der zugrunde liegenden zellulären und molekularen Pathogenese erleichtert. In – vivo – Maus – Modellen der integrierten Physiologie und Widerstandsfähigkeit des Wirtsabwehrreaktion erfassen in eine Weise , die nicht durch alternative, vereinfachte ex – vivo – Ansätze offenbart. Verschiedene Verfahren wurden in der Literatur für intrapulmonale Inokulation von Bakterien in Mäusen, einschließlich Aerosolisierung, intranasale Verabreichung, perorale endotracheal Kanülierung unter "blind" und visualisiert Bedingungen und transkutane endotracheal Kanülierung beschrieben. Alle Methoden haben relativen Vorteile und Einschränkungen. Hier beschreiben wir im Detail eine nicht-invasive, technisch nicht-intensiven, kostengünstige und schnelle Methode zur intratrachealen Lieferung von Bakterien , die Aspiration (dh Inhalation) von der Maus umfassteines infektiösen Inokulum in den Mund-Rachenraum während unter Vollnarkose pipettiert. Dieses Verfahren kann für die pulmonale Abgabe einer großen Vielzahl von nicht-ätzenden biologischen und chemischen Mitteln verwendet werden, und ist relativ leicht zu erlernen, auch für Labors mit minimaler Erfahrung mit pulmonaler Verfahren. Neben der Aspirationspneumonie Methode beschreiben wir auch die nachfolgende zum Testen in vivo pulmonalen angeborenen Immunantwort der Maus, insbesondere Verfahren zur Quantifizierung von bakteriellen Clearance und die zelluläre Immunantwort des infizierten Atemwegs Schritt- für -Schritt – Verfahren bereitzustellen. Dieses integrierte und einfache Ansatz zu einer Lungenentzündung Beurteilung ermöglicht eine schnelle und robuste Bewertung der Wirkung von genetischen und Umwelt Manipulationen auf Lungen angeborenen Immunität.
Introduction
Die ambulant erworbene Pneumonie bleibt die häufigste Todesursache von Infektion in den USA, mit insgesamt nur wenig Veränderung der Sterberaten in den letzten 40 Jahren trotz Verbesserungen bei der Impfung und Antibiotika – Strategien 1,2. Trotz des Mangels an spürbaren Fortschritte bei der öffentlichen Gesundheit Ebene, in den letzten Jahren dramatisch Fortschritte wurden in unserem Verständnis der molekularen und zellulären Pathogenese der Lungenentzündung, mit vielen dieser Schritte nach vorn gemacht möglich durch die Verwendung von Maus-Modellen der Lungeninfektion gemacht. Die genetische Lenkbarkeit der Maus, die Ähnlichkeit des murinen und humanen Immunsystem und die breite Palette von Maus-bezogenen immunologischer Reagenzien, die kommerziell verfügbar sind, haben zusammen rasche Fortschritte des Feldes erleichtert.
Mausmodelle von bakterieller Pneumonie in der Literatur beschrieben wurden im allgemeinen auf eine von vier technischen Wege zur Pathogen Inokulation verlassen: i) Aerosolisierung; ii) intranasal Lieferung; iii) peroralen Abgabe; und iv) chirurgische intratracheale Injektion (dh Tracheotomie) 3. Alle Routen der Infektion haben Vor- und Nachteile 3. Insbesondere bezüglich Exposition der oberen Atemwege, Potenzial für eine Beimischung von oronasal Flora, Anforderungen für die allgemeine Anästhesie, Variabilität der an das distale Lunge zuge Inokulum, lobar Verteilung der gelieferten Erregern, technisches Know-how-Anforderungen und Verfahrens Morbidität variieren stark über diese Ansätze.
Häufig verwendete peroralen Infektion Techniken umfassen über Kanülierung endotracheal (translaryngeale) entweder einen Ansatz "blind" (nicht sichtbar), oder unter direkter Larynx – Visualisierung 3-5. Beide Methoden, während robust, erfordern erhebliche Ausbildung und auch tragen Risiko von Trauma an der oberen Atemwege. Im vorliegenden Bericht beschreiben wir eine technisch nicht intensiv, nicht-invasive, kostengünstige und schnelle Methode der peroralen Infektion, whiermit Bakterien (Klebsiella pneumoniae in dem gegebenen Beispiel) pipettiert Oropharynx eines betäubten Maus in die Lunge über aspiration geliefert (dh inhalation). Wir und andere haben die Aspirationspneumonie Technik erfolgreich 6-9 verwendet. Dieses vielseitige und leicht Lungen-Delivery – Methode gelernt kann in die Lunge auf die Lieferung von vielen zusätzlichen nicht-ätzende Mittel erweitert werden, einschließlich Zytokine und andere Proteine, pathogen-assoziierte Moleküle (zB Lipopolysaccharide), Zellen (dh adoptiven Transfer), und Toxine (zB Bleomycin). Zusätzlich wichtigen technischen Überlegungen Erörterung beschreiben wir auch ein integriertes, quantitative Ansatz für die nachfolgende Wirtsantwort auf Pneumonie Beurteilung, einschließlich stromabwärts Messung von bakteriellen Clearance (dh koloniebildende Einheit [CFU] Quantifizierung in der Lunge und peripheren Organen) und Leukozyt Akkumulation im Luftraum.
Protocol
Representative Results
Discussion
Murine Modelle von bakteriellen Lungenentzündung, die in Partnerschaft mit Gen – Targeting und di – vivo – biologischen und pharmakologischen Interventionen, zur Verfügung gestellt haben kritische Einblicke in die Lungenabwehrreaktion. Große Fortschritte wurden insbesondere in unserem Verständnis der Chemokine und Adhäsionsmoleküle gemacht worden , die 10,11 Rekrutierung von Neutrophilen auf den infizierten Luftraum beherrschen. In – vivo – Modellen an einer Lungenent…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported in part by the Intramural Research Program of the National Institutes of Health, National Institute of Environmental Health Sciences (Z01 ES102005).
Materials
| Klebsiella pneumoniae, serotype 2 | ATCC | 43816 | |
| Tryptic soy broth | Becton Dickenson | 211825 | |
| Excel Safelet IV Catheters, 18G x 1 1/4" | Claflin Medical Equipment | MEDC-031122 | |
| Hema 3 Solution 1 | Fisher | 23-122-937 | |
| Hema 3 Solution 2 | Fisher | 23-122-952 | |
| Hema 3 Fixative | Fisher | 23-122-929 | |
| 27½ gauge tuberculin syringes | Fisher | 14-826-87 | |
| Lithium heparin plasma collectors | Fisher | 2675187 | |
| L-shaped disposable spreaders | Lab Scientific | DSC | |
| 1x PBS, pH 7.4 | prepared in-house | n/a | Distilled water (5 L), NaCl (40 g), KCl (1 g), Na2HPO4 (5.75 g), KH2PO4 (1 g) |
| ACK lysis buffer | prepared in-house | n/a | NH4Cl (4.145 g), KHCO3 (0.5 g), EDTA (18.6 mg), bring up to 500 ml with distilled water and pH to 7.4 |
Riferimenti
- Mizgerd, J. P. Acute lower respiratory tract infection. N Engl J Med. 358 (7), 716-727 (2008).
- Waterer, G. W., Rello, J., Wunderink, R. G. Management of community-acquired pneumonia in adults. Am J Respir Crit Care Med. 183 (2), 157-164 (2011).
- Mizgerd, J. P., Skerrett, S. J. Animal models of human pneumonia. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 294 (3), L387-L398 (2008).
- Revelli, D. A., Boylan, J. A., Gherardini, F. C. A non-invasive intratracheal inoculation method for the study of pulmonary melioidosis. Front Cell Infect Microbiol. 2, 164 (2012).
- Morales-Nebreda, L., et al. Intratracheal administration of influenza virus is superior to intranasal administration as a model of acute lung injury. J Virol Methods. 209, 116-120 (2014).
- Aujla, S. J., et al. IL-22 mediates mucosal host defense against Gram-negative bacterial pneumonia. Nat Med. 14 (3), 275-281 (2008).
- Chen, K., et al. Th17 cells mediate clade-specific, serotype-independent mucosal immunity. Immunity. 35 (6), 997-1009 (2011).
- Draper, D. W., et al. ATP-binding cassette transporter G1 deficiency dysregulates host defense in the lung. Am J Respir Crit Care Med. 182 (3), 404-412 (2010).
- Robinson, K. M., et al. Influenza A exacerbates Staphylococcus aureus pneumonia by attenuating IL-1beta production in mice. J Immunol. 191 (10), 5153-5159 (2013).
- Mizgerd, J. P. Molecular mechanisms of neutrophil recruitment elicited by bacteria in the lungs. Semin Immunol. 14 (2), 123-132 (2002).
- Balamayooran, G., Batra, S., Fessler, M. B., Happel, K. I., Jeyaseelan, S. Mechanisms of neutrophil accumulation in the lungs against bacteria. Am J Respir Cell Mol Biol. 43 (1), 5-16 (2010).
- Quinton, L. J., et al. Hepatocyte-specific mutation of both NF-kappaB RelA and STAT3 abrogates the acute phase response in mice. J Clin Invest. 122 (5), 1758-1763 (2012).
- Gowdy, K. M., et al. Key role for scavenger receptor B-I in the integrative physiology of host defense during bacterial pneumonia. Mucosal Immunol. 8 (3), 559-571 (2015).
- Madenspacher, J. H., et al. p53 Integrates host defense and cell fate during bacterial pneumonia. J Exp Med. 210 (5), 891-904 (2013).
- Brain, J. D., Knudson, D. E., Sorokin, S. P., Davis, M. A. Pulmonary distribution of particles given by intratracheal instillation or by aerosol inhalation. Environ Res. 11 (1), 13-33 (1976).
- Card, J. W., et al. Gender differences in murine airway responsiveness and lipopolysaccharide-induced inflammation. J Immunol. 177 (1), 621-630 (2006).
- Ivanov, I. I., et al. Induction of intestinal Th17 cells by segmented filamentous bacteria. Cell. 139 (3), 485-498 (2009).
- Hooper, L. V., Littman, D. R., Macpherson, A. J. Interactions between the microbiota and the immune system. Science. 336 (6086), 1268-1273 (2012).
