自己組織化反応押出、マイクロフルイディクス, 経由で複数の長さスケールでの分解性感温ハイドロゲルを加工・ エレクトロスピニング

1. ヒドラジド機能性高分子の合成 注: 次の特定のレシピ PNIPAM 擬態感温 POEGMA 前駆体ポリマー (PO10) 30 mol % ヒドラジド化で提供されます。PNIPAM と POEGMA 前駆体ポリマー別の相転移温度は、これと同じ一般的な方法を用いて調製できるが、(各種 POEGMA ポリマーの変更のセクション 1.2 を参照)21を使用型とコア モノマーの比率を変更します。,25,27。 重量 37 mg 2,2′-azobis(2-methylpropionate) (AIBMe、イニシエーター) のうちジエチレング リコール メタクリル酸 (M(EO)2MA) の 3.1 g oligoethyleneglycol メタクリル酸 0.9 g (OEGMA475, 475 g/mol n = 7-8 エチレンオキシド リピート単位)、523 の μ L(AA、コモノマー) アクリル酸と thiolglycolic 酸 (TGA、連鎖移動剤) 20 mL バイアル シンチレーションに 7.5 μ L。 PO0 (部屋の温度遷移温度 POEGMA)、M(EO)2MA (475の OEGMA ないん) の 4.0 g を使用します。PO100 (転移温度 POEGMA)、OEGMA475 (M(EO)2MA) の 4.0 g を使用します。注: 中間相転移温度が可能 M(EO)2MA の OEGMA475, 中間混合物の使用に基づいてルッツらによると23 1 つまたは複数の首丸底フラスコにジオキサン (5 mL/g 全モノマー) すべての試薬を溶解します。 30 分の窒素 (UHP グレード) フローと反応を消去します。 一度削除された窒素と 400 rpm 磁気攪拌下で 4 h 75 ° C で維持される予熱した油浴中でフラスコを配置します。 4 h 後 50 ° C、200 rpm に設定回転蒸発器を用いて溶媒を削除します。 150 mL の脱イオン水で得られたポリマー製品を溶解します。 ポリマーに組み込まれて AA 残基の数を 5 倍モル超アジピン酸 dihydrizide (ADH) を追加 (この例で、AA は電導べ度滴定法に従って生成ポリマーの単量体の単位の 29 モル % を含む)。 Ph 4.75 0.1 M hcl 溶液の pH を調整します。 PH が安定したら追加N-(3-dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide (EDC) AA 残基の存在の数に 5-fold モル超)。 0.1 M HCl 4 h 以上の滴下で反応 pH 4.75 を維持します。 ままに、一晩撹拌反応をします。 注ぐ製品ソリューション 3 〜 30 cm 長い透析チューブ (3500 Da 分子量カットオフ、1 インチの厚さ) に流出を最小限に抑えるために漏斗の使用。ピンチ クランプを使用してクランプ整合性を改善するために管の小さな (~ 2 cm) セグメントを折ることによって充填する前にチューブの底を閉じる(空気の泡を削除するを押す) 上部に繰り返し充填が完了したとき。脱イオン水の 100 余分なボリュームの内部管を配置し、完全の交換水目的の純度を達成するために透析の 6 サイクル、少なくとも 6 時間を残します。 最終的な乾燥ポリマー製品を得るため透析のサンプルを凍結乾燥します。 2. アルデヒド官能基化ポリマーの合成 アルデヒド前駆体モノマー N-(2,2-Dimethoxyethyl) メタクリル酸 (DMEMA) の合成 20 w/v NaOH 溶液 500 mL 3 首丸底フラスコに場所 200 mL。 氷浴でソリューションを冷却し、反応中に氷で 0 ° C の温度を維持します。 冷却の NaOH 溶液に aminoacetyl アルデヒド ジメチル アセタールの 50 mL を追加します。 テンポの 0.1 g で追加 ((2,2,6,6-Tetramethylpiperidin-1-イル) オキシル)、電磁攪拌棒を使用してテンポを完全に溶解するまで 400 rpm でかき混ぜます。 メタクリロイル塩化滴下ビュレット 2 h 以上を使用して、48 mL を追加します。 2 時間後、アルミ箔と残す、一晩撹拌反応槽をカバーします。 1 L 分離漏斗で石油エーテル 75 mL に反応製品を追加、揺れ、脱ガス、および最上位のレイヤーを破棄することによって製品を抽出します。 2.1.7 のステップを 3 回繰り返します下部層製品を原料製品として各抽出のステップから次の抽出サイクルに追加します。 最終的な底層製品、100 mL ビーカーに転送を削除します。 追加 〜 5 g 硫酸マグネシウム (Mg2SO4)「雪の世界」までモノマーとビーカーに効果が観察されます。 など4100 mL Mg2を削除するブフナーをフィルター処理します。 Tert-ブチル エーテル、たびに漏斗を通して洗浄液を注いで 〜 75 mL で 2 回ビーカーをすすいでください。 500 mL の丸底フラスコに製品を譲渡し、常温ロータリーエバポレーターを使用して溶媒を蒸発させる最終製品を収集するために 200 の RPM。 アルデヒド官能基化ポリマーの合成注: 次の特定のレシピ PNIPAM 擬態 POEGMA 前駆体ポリマー (PO10) 30 mol % アルデヒド官能基化で提供されます。PNIPAM と POEGMA 前駆体ポリマー別の相転移温度は、同じ一般的な方法を用いて調製できるが、(各種 POEGMA ポリマーの変更のセクション 1.2 を参照)21を使用型とコア モノマーの比率を変更します。,25,27。 37 mg 2,2′-azobis(2-methylpropionate) (AIBMe) M(EO)2メタクリル酸ジエチレング リコール、MA、3.10 g のオリゴ エチレング リコール メタクリル酸 0.1 g を量り (OEGMA475、475 g/mol、n = 7-8 エチレンオキシド リピート単位)、n-(2, 2-1.30 gdimethoxyethyl) アクリルアミド (DMEMA) および thiolglycolic 酸 (TGA) 20 mL バイアル シンチレーションに 7.5 μ L。 PO0 (部屋の温度遷移温度 POEGMA)、M(EO)2MA (475の OEGMA ないん) の 4.0 g を使用します。PO100 (転移温度 POEGMA)、OEGMA475 (M(EO)2MA) の 4.0 g を使用します。注: 中間相転移温度を実現できます M(EO)2MA の OEGMA475, 中間混合物の使用に基づいてルッツらによると。23 1 つまたは複数の首丸底フラスコにジオキサン (5 mL/g 全モノマー) すべての試薬を溶解します。 30 分の窒素 (UHP グレード) フローと反応を消去します。 一度削除された予熱した油浴中で場所フラスコは窒素と 400 rpm 磁気攪拌下で 4 h 75 ° C で維持されます。 4 h 後 50 ° C、200 rpm に設定回転蒸発器を用いて溶媒を削除します。 100 mL の脱イオン H2o. に結果として得られる高分子製品を溶解します。 溶存液に 1 M 塩酸 50 mL を追加し、磁気攪拌 (400 回転) 24 h DMEMA でアセタールの機能を完全に加水分解するためにかき混ぜます。 反応完了後 1.13 のステップごとの透析チューブに高分子溶液を転送します。 最終的な乾燥ポリマー製品を得るため透析のサンプルを凍結乾燥します。 3. ヒドラゾン架橋一括ゲルの作製 ヒドラジドとアルデヒド官能基化ポリマー別に 10 mM リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)、または目的濃度の溶液を作成する、すべての必要な水性バッファーに溶解します。注: 5-40 wt % の質量濃度通常使用される低濃度ポリマーに高機能グループの分数がある場合可能でゲル化。 シングル バレル スポイトを使用して転送ソリューション、ソリューションを読み込む各前駆体 (〜 1 mL 各) ダブル バレル シリンジ (1:1 の比率のシリンジ 2.5 mL ボリューム) の別の樽にスタティック ミキサー (長さ 1.5″) および (オプション) (通常 18 G、注射器に接続されています。1.5″in vitro 試験の長さ) と (必要に応じて) 注射器 (通常 18 G、1.5″ in vitro 試験の長さ)。 シリコーン ゴム シートに所望の厚さ、形状、パンチング穴径の金型を準備します。注: 典型的な実験標準パンチ セットが 1/16″厚さシリコーン ゴム シート (貯水池 〜 300 μ L の総ボリューム) の内部 7 mm 径の円筒穴をパンチに使用されています。 シリコーン型を標準的なガラス顕微鏡スライド金型で穴をパンチするようマウントは、ガラスによって完全にサポートされます。 ガラスの 0.1 M HCl 洗浄は推奨事項は、シリコーン型の取付前に必要ありません。 共同完全に記入 (または少しあふれて、上部に半月板と) シリコーン型スタティック ミキサーを通してダブル バレル注射内容を押し出します。注: 複数のサンプルは、ゲル化時間が同程度の大きさのまたは複数の型を満たすために必要な合計時間よりも長く、1 つのサンプルの間に準備します。 金型の上に別の標準的なガラス顕微鏡スライドを配置し、ゲル化を完了するを待ちます。メモ: 合成セクション ゲル内で説明されている標準的なレシピ < 1 分ゲル化に時間がかかる (そして必要な待機時間が長く) は、官能基密度が低い、低高分子濃度および/または OEGMA475 M(EO)2MA (POEGMA ヒドロゲル) の基準の高い分数で観察されます。 トップの顕微鏡スライドを外し、シリコーンゴム型からハイドロゲルをプッシュするヘラを使用します。 さらにテストのヒドロゲルを回復する下の顕微鏡スライドから金型を持ち上げます。 4. ヒドラゾン架橋ゲル微粒子の作製 マイクロ流体チップの作製 シリコン ・ ウエハを脱水 (D = 76.2 mm、380 μ P ドープ 向き) ホット プレートで 5 分の 200 ° C の加熱による。 ウェーハ スピン コーターに SU 8 ~ 7 mL を用いた SU 8 100 フォトレジストの ~ 100 μ m 厚い層レジスト コートをセンター、500 rpm/s とし、速度を保持して、3000 rpm で 30 秒間の割合で 3000 rpm までの速度ランプをスピン。 前 10 分の 65 ° C でコーティングを焼くと、- 95 ° C、30 分で塗装を焼くソフト。 透過セクション重合レジスト層の所望のパターンにあるような透明度に図 2A、によって定義されたマイクロ パターンとフォトマスクを印刷します。 マスクア ライナー、フォトレジスト コーティング シリコンウェハー、フォトマスクを挿入し、95 の 365 nm の光にウェーハを公開 s (6.5 W 露出力)。 65 ° C でホット プレート上に配置し、その後 10 ° C/分で 95 ° C にホット プレートを加熱によって最初 95 ° C で 10 分間のパターン付きウェハを焼きます。 ホット プレート、500 mL ビーカー 100 mL SU 8 開発者少なくとも 10 分を含む、非曝露フォトレジストを削除するソリューション全体でゆっくりとウェーハを旋回の場所からウェハを削除します。10 分後イソプロパノールとパターン付きウェハをすすいで空気乾燥します。パターン付きウェハをソフト ・ リソグラフィー レプリカ成形に使用しないときに光から涼しい、乾燥した環境に格納します。 ペトリ皿にパターン化されたマイクロ金型を配置します。入り江やチップの店で L/S 13 シリコン チューブの位置 〜 10 mm 長さ。 ポリ (ジメチル シロキサン) 〜 10 mL を注ぐ (PDMS; 10:1 の比率でシリコーンのエラストマー ベースとシリコーンのエラストマーの硬化剤を混合することによって準備)、チップ上に配置されたシリコーン チューブ内の任意の PDMS を組み込む慎重に回避します。 パターンの建物周辺を永続化、硬化時に空気の泡を削除する 〜 10 分の真空チャンバーにペトリ皿を配置します。 パターン金型と 2-3 h の 85 ° c 鉄板未硬化 PDMS を含むペトリ皿を置くことによって、PDMS を治します。 マイクロ金型の柔らかい線描パターン PDMS レプリカを公開するパターンのシリコンウエハーから硬化 PDMS を慎重にはがします。 パターン PDMS の場所とフィードの空気クリーナー高出力プラズマで逆さまにスライド ガラス。200 mtorr プラズマと 90 の 45 W 適用 s をスライド ガラスに PDMS を結合し、最終的なマイクロ流体チップを作成します。 ゲル微粒子の合成 無水エタノール 20 mL に NIPAM (4.5 g)、アクリル酸 (0.5 g – 15 mol % 全モノマー)、チオグ リコール酸 (TGA、80 μ L)、2, 2-azobisisobutyric 酸ジメチル (AIBME、0.056 g) を溶解することにより酸ヒドラジド修飾 PNIPAM (PNIPAM Hzd) を準備し、その後手順 1.4 1.14、合成を完了する手順 1.5 の 56 ° C と反応温度の変化が。 20 の NIPAM (4 g)、n-(2, 2-dimethoxyethyl) メタクリル酸 (DMEMA、0.95 g – 13.4 mol % 全モノマー)、チオグ リコール酸 (TGA、80 μ L)、2, 2-azobisisobutyric 酸ジメチル (AIBME、0.056 g) を溶解することによりアルデヒド官能基化 PNIPAM (PNIPAM Ald) を準備します。mL のエタノールと続いて次の手順 2.2.4-2.2.10、合成を完了するは、反応温度を 56 ° C に変更することがで 2.2.5 がステップします。 別の標準的な 5 mL 注射器に脱イオン水と負荷 6 wt % で PNIPAM Hzd と PNIPAM Ald を溶解します。 1 wt % ノニオン界面活性剤 (例えば、スパン 80) 重いパラフィン油を溶解し、標準 60 mL 注射器にソリューションを読み込みます。 マイクロ流体チップとマイクロ流体チップを経由して 1/32″ID シリコーン チューブ (~ 30 cm 長さ、入口あたりのオイル入口チャネルにパラフィン油液の 2 つの独立した高分子入口チャネル 2 前駆体高分子ソリューション注射器を個別に接続します。~ 45 cm アウトレットあたり)。 輸液ポンプ ・ シリンジ ポンプ (1 つ上流の石油は、ノズル後追加されたオイルの 1 つ) を分離 2 を使用して、主要なチップとチップを確実にポリマー流を起動することがなく流量 1.1 mL/h と 5.5 mL/h の間でチップに油を提供無料の欠陥と 運用 (通常維持される 30 分間)。 別注入シリンジ ポンプを使用すると、流量 0.03 mL/h でチップに、高分子溶液のそれぞれを提供します。 次の流れが平衡し、均一粒子形成 (30 分-1 時間)、ように初期安定化期間磁気撹拌丸底フラスコ内の粒子を収集します。 すべてのオイルが消費される (流れによって h 12-55、) まで粒子を収集します。シリンジ ポンプを停止し、ポンプをきれいにチップを介して前駆体高分子溶液の代わりに水がすぐに必要な場合。 ただし、流れが停止したときは、これらの材料の急速なその場でゲル化を与え、それは各別の実験のための新しいチップを使用する勧めします。 磁気攪拌を切り、解決するゲル微粒子を許可します。ピペットを使用してすべての利用可能なパラフィン油をデカントします。 残りのパラフィン油を削除するペンタン (微粒子量ごとの 0.5 mL を 10 mL の量で適用される) ゲル微粒子を洗浄、エマルジョンを精力的にミックス 〜 1 分再 1 ~ 2 のために解決するゲル微粒子を許可する時間をデカントし、ピペットを使用して残留有機相。完全パラフィン油除去を確保するため、少なくとも 5 回を繰り返します。 20 mL バイアル シンチレーション中 10 mL の脱イオン水でゲル微粒子を再懸濁しますおよび任意の残留ペンタンを削除する窒素を一晩でバイアルをパージします。 5. ヒドラゾン架橋ナノゲルの作製 PNIPAM Hzd の貯蔵液を溶解 (1 w/v%) と PNIPAM Ald (1 w/v%) 脱イオン水。4.2.1 と 4.2.2 のセクションでそれぞれ説明 PNIPAM Hzd や PNIPAM Ald を準備します。 70˚C する PNIPAM Hzd 保存溶液 20 mL バイアル シンチレーション内電磁攪拌 (350 RPM) の下のオイルの浴室を使用しての 5 mL の約数を加熱します。注: ソリューション必要があります不透明になる (すなわち温度が PNIPAM Hzd の下限臨界溶液温度を超える場合)、表示される沈殿物は成立しないが。 PNIPAM Ald の 0.25 mL の約数を追加 (PNIPAM Hzd の質量の 5-20 wt % シード ソリューションに存在) 5-10 秒の期間にわたって温水 PNIPAM Hzd ソリューションに伝。 混合用シンチレーションでソリューション バイアルを削除した後、追加の 15 分油浴からサンプルを続行し、一晩室温に冷却する製品を許可します。 脱イオン水、非架橋ポリマーを削除に反対 (3500 kDa MWCO 透析膜を使用して) 6 x 6 時間サイクルで結果ナノゲルを dialyze します。必要な場合は、ストレージの凍乾します。 6. ヒドラゾン架橋ナノファイバーの作製 37 mg ジメチル 2,2′-azobis(2-methylpropionate) (AIBMe)、4.0 g oligoethyleneglycol メタクリル酸を溶解することにより酸ヒドラジド機能 POEGMA (POEGMA-Hzd) を準備 (OEGMA475、475 g/mol、n = 7-8 エチレンオキシド リピート単位)、および 0.25 g アクリル酸(AA) 20 mL ジオキサン及び 1.3-1.14 合成を完了する手順を実行します。 50 mg ジメチル 2,2′-azobis(2-methylpropionate) (AIBMe)、4.0 g oligoethyleneglycol メタクリル酸を溶解することによりアルデヒド官能基化 POEGMA (POEGMA Ald) を準備 (OEGMA475、475 g/mol、n = 7-8 エチレンオキシド リピート単位)、および 0.60 g N-(2, 2-dimethoxyethyl) (DMEMA) メタクリル酸 20 mL ジオキサンと合成を完了する次の手順 2.2.3-2.2.10 溶解 POEGMA Hzd (15 wt %) と POEGMA Ald (15 wt %) 別の脱イオン水ソリューションで。 ポリ (エチレンオキ サイド) を溶解 (PEO、Mw= 600 × 103 g/mol、5 wt %) 脱イオン水。 7.5 wt %poegma 前駆体高分子と 2.5 wt %peo の最終的な前駆体溶液を作成するステップ 6.3 で準備して各反応 POEGMA 溶液の PEO 溶液のミックス 1 mL。 3 (1.5″スタティック ミキサーも含む) に記載されている同じダブル バレル シリンジの樽に 2 つのソリューションをロードおよび輸液シリンジ ポンプにダブル バレル注射器をマウントします。 スタティック ミキサーと鈍チップ 18 G 針を二重バレル注射器に接続します。 コレクターは接地鈍先端の針に高電圧の電源を接続します。注: コレクターはアルミ箔の 10 mm × 10 mm の正方形のいずれかを構成または 200 rpm の速度で回転、~ 10 mm 径のアルミ ディスク両方垂直にマウント 10 cm の距離で針針の端から。 0.48 mL/h の速度で注射器のポンプを起動し、同時に、8.5 の高電圧スイッチ、静電紡糸ナノファイバーの作製し kV。 異なる太さのまたは入口のソリューションがなくなるまで足場を作るに必要に応じてエレクトロスピニングを続行します。 PEO エレクトロスピニング援助を削除するには、脱イオン水で 24 時間収集した足場を浸します。