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Bioingegneria

Fabricación de hidrogeles degradables de interpenetrantes en múltiples escalas de la longitud mediante extrusión reactiva, microfluídica, uno mismo-Asamblea y Electrospinning

Published: April 16, 2018
doi:
10.3791/54502
, , , , ,
1Department of Chemical Engineering,McMaster University

Summary

Se describen los protocolos para la fabricación de hidrogeles degradables interpenetrantes basados en hidrazona Cross-linking de oligómeros poliméricos en la escala de a granel microescala, nanoescala y el último para la preparación de nanopartículas de gel y nanofibras.

Abstract

Mientras que se han explorado diferentes materiales inteligentes para una variedad de aplicaciones biomédicas (por ejemplo, el suministro de medicamentos, ingeniería de tejidos, Bioimagen, etcetera), su último uso clínico ha sido obstaculizado por la falta de biológicamente relevantes degradación observada para materiales más inteligentes. Esto es particularmente cierto para hidrogeles sensibles a la temperatura, que se basan casi uniformemente en los polímeros que son funcionalmente no degradables (p. ej., poly(N-isopropylacrylamide) (PNIPAM) o poli (metacrilato de glicol oligoetileno) (POEGMA) ). Como tal, para traducir con eficacia el potencial de los hidrogeles interpenetrantes a los desafíos del control remoto o regulado por el metabolismo del fármaco, andamios con interacciones de material celular armoniosas, teranosis materiales con potencial de la célula para la proyección de imagen y entrega de la droga y otras tales aplicaciones, un método es necesario para procesar los hidrogeles (si no totalmente degradables) menos capaz de depuración renal después de la vida útil requerida del material. Para ello, este protocolo describe la preparación de hidrogeles degradables hidrolítico hidrazona-reticulado en múltiples escalas de la longitud basados en la reacción entre hidrazida y aldehído funcionalizados oligómeros PNIPAM o POEGMA molecular pesos por debajo del límite de filtración renal. Específicamente, métodos para fabricar interpenetrantes degradable a granel hidrogeles (utilizando una técnica de jeringa doble barril), las partículas de hidrogel (en ambos la microescala mediante el uso de una plataforma de microfluídica facilitando la mezcla simultánea y emulsificación de los polímeros del precursor y la nanoescala mediante el uso de una térmica basada en el uno mismo-Asamblea y método del cross-linking), y nanofibras de hidrogel (usando una estrategia reactiva electrospinning) se describen. En cada caso, los hidrogeles con temperatura sensible propiedades similares a los obtenidos vía convencional radical libre Cross-linking procesos pueden lograrse, pero la red entrelazada de hidrazona puede ser degradada en el tiempo para volver a formar las oligoméricas precursor de polímeros y habilitar espacio. Así, prevemos que estos métodos (que puede ser aplicado genéricamente a cualquier sintético polímero soluble en agua, no sólo inteligentes materiales) permitirá más fácil traducción de sintético materiales inteligentes para aplicaciones clínicas.

Introduction

Materiales inteligentes han atraído considerable atención debido a su potencial reversible “on-demand” las respuestas a las señales externas o ambientales. Materiales sensibles a la temperatura han atraído interés particular debido a su comportamiento de temperatura (LCST) solución crítica inferior, resultando en la precipitación basada en temperatura a las temperaturas T > LCST1,2. En el contexto de los hidrogeles interpenetrantes, este comportamiento de temperatura de solución crítica inferior se manifiesta por reversibles inflamación/de-swelling eventos que resultan en tamaños de temperatura regulables a granel (más grande en T < LCST)3, tamaños de poro (mayores a T < LCST)4y las propiedades interfaciales (más hidrofílicos t < LCST)5. Estas transiciones se han aplicado extensamente en el suministro de medicamentos (medicamento externo o medio ambiente-triggerable soltar4,6,7), cultura de la ingeniería y de la célula del tejido (para la adherencia de célula termoreversibles / delaminación8,9,10), separaciones (de porosidades de la membrana cambiable y permeabilidades o térmicamente reciclable apoya diagnóstico11,12, 13), procesos de microfluidos (para válvulas de cierre regulador flujo14,15) y modificadores reológicos (para viscosidades temperatura regulables16). Los más comúnmente investigada interpenetrantes hidrogeles se basan en poly(N-isopropylacrylamide) (PNIPAM)17, aunque trabajo importante (y creciente) también se ha realizado en poli (metacrilato de glicol oligoetileno) (POEGMA)2 ,18 y poly(vinylcaprolactam) (PVCL)19,20. POEGMA ha suscitado particular interés reciente por su biocompatibilidad mejorada esperado21,22y su comportamiento LCST de fácil ajuste, que linealmente previsible mezclas de monómeros con diferentes números de unidades repetidas de óxido de etileno en sus cadenas laterales pueden alterar la LCST de ~ 20 ° C a > 90 ° C2,23. Sin embargo, cada uno de estos polímeros es preparado por polimerización de radicales libres y por lo tanto contiene un esqueleto de carbono, limita significativamente la utilidad potencial y traducción de estos polímeros en el contexto de aplicaciones biomédicas en las que degradación (o al menos la capacidad de separación por filtración renal) es típicamente un requisito.

En respuesta a esta limitación, recientemente hemos informado ampliamente acerca de la aplicación de la hidrazona química (es decir., la reacción entre hidrazida y prepolímeros funcionalizados aldehino) preparar análogos degradables de interpenetrantes hidrogeles24,25,26,27,28,29. La reacción rápida y reversible entre grupos aldehido e hidrazida sobre la mezcla de los polímeros funcionalizados precursor del30 permite tanto congelación en situ (permitiendo fácil inyección de estos materiales sin necesidad de cirugía implantación o cualquier tipo de estímulo externo polimerización como iniciación de irradiación o químico UV) así como de degradación hidrolítica de la red a una velocidad controlada por la química y la densidad de los sitios de entrecruzamiento. Además, manteniendo el peso molecular de los polímeros previa para preparar hidrogeles por debajo del límite de filtración renal, hidrogeles constituidos este enfoque se degradan en los polímeros de los precursores que pueden eliminarse del cuerpo de la25 ,27,28. Junto con la baja citotoxicidad y respuesta bajo tejido inflamatorio inducido por estos materiales25,26,27, este enfoque ofrece un método potencialmente traducible para el uso de interpenetrantes hidrogeles inteligentes en medicina, sobre todo si pueden fabricarse bien controlados degradables análogos de estos hidrogeles en todas las escalas de longitud (a granel, micro y nano).

En este protocolo, se describen métodos para la fabricación sintética interpenetrantes pre polímeros funcionalizados con números controlados de hidrazida y aldehino grupos así como métodos para aplicar estos polímeros para crear hidrogeles con dimensiones bien definidas en varias escalas de longitud. En concreto, este manuscrito describe cuatro enfoques distintos que se han desarrollado para controlar la mezcla de la hidrazida reactiva y prepolímeros aldehído funcionalizados y así crear interpenetrantes redes de hidrogel con geometrías bien definidas y morfologías:

Para crear hidrogeles degradables a granel con tamaños definidos, se describe una estrategia de plantillas por el cual se cargan los prepolímeros reactivos en barriles separadas de una jeringa de doble cañón equipa a su salida de un mezclador estático y posteriormente coestruida en un molde de silicona con el hidrogel deseada forma y dimensiones21,27 (figura 1).

Figure 1
Figura 1 : Esquema de formación de hidrogel a granel. Hidrazida y soluciones de polímeros funcionalizados de aldehído (en agua o tampón acuoso) se cargan en barriles separadas de una jeringa de doble barril y co extrusión a través de un mezclador estático en un molde cilíndrico de silicón. Congelación rápida en situ sobre mezcla forma un hidrogel reticulado de hidrazona, que es libre (una vez retirado el molde) dentro de segundos a minutos, dependiendo de concentración y grupo funcional la densidad de los polímeros del precursor. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Para crear las partículas de gel degradables en la escala del micrón, se describe un método de microfluídica reactiva en que precursor soluciones de polímeros son simultáneamente mezclado y emulsionado mediante un diseño de chip de microfluidos con plantilla litografía suave, lo que permite la formación de gotas de la mezcla polímero reactivo que posteriormente gel en situ para micropartículas de gel forma con tamaños con plantillas de la emulsión (figura 2)31,32.

Figure 2
Figura 2 : Esquema de formación de micropartículas de gel mediante microfluídica reactiva. (A, B) Hidrazida y soluciones de polímeros funcionalizados de aldehído (en agua o tampón acuoso) son alimentadas por la bomba de jeringa en depósitos separados que están conectados aguas abajo a través de una serie de zig-zag de canales diseñados para crear un gradiente de presión prevención de contraflujo. Los polímeros son mezclados antes de ser cortado por el aceite de parafina que sale de ambos lados (también impulsados por una bomba de jeringa) y forzados a través de un inyector, dando por resultado la producción de enfoque de flujo de acuoso gotitas (solución de polímero) en una fase de aceite continua parafina (véase (B) para una ilustración de la zona de la boquilla y el proceso de formación de la gotita). Un adicional dos entradas de aceite de parafina se colocan después de la boquilla que más separa las gotitas en el canal de recogida para permitir la completa gelificación antes de quitar la partícula de flujo laminar, después de lo cual el resultante particulada geles son recogidos en un vaso de precipitados agitada magnéticamente; (C) imagen de proceso de generación de gotas en la boquilla (Nota ese polímero de hidrazida es etiquetado como azul para ilustrar la mezcla)

Para crear las partículas de gel degradables en la nanoescala, térmicamente impulsado reactiva autoensamblaje es describir el método en el que una solución de uno de los polímeros reactivos precursores (el polímero de “semilla”) se calienta por encima de su LCST para formar una nanoaggregate estable que es posteriormente reticulado por adición del polímero precursor reactivo complementario (el polímero de “crosslinking”); el nanogel de reticulado de hidrazona resultante tiene un tamaño de plantilla directamente por el nanoaggregate (figura 3)28.

Figure 3
Figura 3 : Esquema de nanogel formación vía impulsado térmicamente reactiva uno mismo-Asamblea. Una solución acuosa que contiene el polímero de hidrazida funcionalizados (interpenetrantes) se calienta por encima de su temperatura de solución crítica inferior para crear un ámbito estable nanoaggregate. Un polímero funcionalizados de aldehído se agrega a la reticulación el nanoaggregate a través de la formación del enlace de hidrazona y estabilizar así la partícula nanogel por enfriamiento por debajo de la LCST. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Para crear nanofibras degradables, se describe una técnica de Electrohilado reactiva en que una jeringa de barril doble equipada con un mezclador estático en su salida (como los utilizados para la fabricación de los hidrogeles a granel) se une a una plataforma de electrospinning estándar (figura 4 )33.

Figure 4
Figura 4 : Esquema de la formación de nanofibras de hidrogel mediante electrospinning reactivo. Una jeringa de doble cañón con un mezclador estático (cargado como se ha descrito para los hidrogeles a granel pero también incluyendo una fracción de alto peso molecular poly(ethylene oxide) como una ayuda de electrospinning) está montada en una bomba de jeringa con la aguja en el extremo de la jeringa conectada a una fuente de alimentación de alto voltaje. Hidrazona reticulación ocurre durante la fibra hilatura proceso para que cuando la corriente del colector (papel de aluminio o un disco giratorio de aluminio) se mantiene la morfología de nanofibras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La aplicación de tales métodos para la creación de redes degradable hidrogel inteligente se demuestra en el presente Protocolo mediante PNIPAM o POEGMA como el polímero de interés; sin embargo, los enfoques básicos descritos pueden ser traducidos a cualquier polímero soluble en agua, aunque con ajustes apropiados para la viscosidad y (en el caso de la uno mismo-Asamblea nanogel método de fabricación) la estabilidad del polímero previa en la formación de la semilla nanoaggregate.

Protocol

1. síntesis de polímeros funcionalizados hidrazida Nota: La siguiente receta específica está proporcionada para el mimética PNIPAM interpenetrantes POEGMA precursor de polímeros (PO10) 30 funcionalización de hidrazida de % mol. Polímeros de precursor PNIPAM y POEGMA con temperaturas de transición de fase diferentes se pueden preparar utilizando este mismo método general pero modificando el tipo y proporción de los monómeros base utilizado (véase la sección 1.2 para modificaciones de diversos polímeros POEGMA)21 , 25 , 27. Pesar 37 mg de 2,2′-azobis(2-methylpropionate) (AIBMe, iniciador), 3,1 g de metacrilato de glicol del dietileno (M(EO)2MA), 0,9 g de oligoethyleneglycol metacrilato (OEGMA475, 475 g/mol n = unidades de repetición de óxido de etileno de 7-8), 523 μl de ácido acrílico (AA, comonoméricas) y 7,5 μl de ácido thiolglycolic (TGA, agente de transferencia de cadena) en un vial de centelleo de vidrio de 20 mL. Para PO0 (temperatura de transición de temperatura POEGMA), utilizar 4,0 g de M(EO)2MA (no OEGMA475). PO100 (no temperatura de transición POEGMA), utilizar 4,0 g de OEGMA475 (sin M(EO)2MA).Nota: Fase intermedia las temperaturas de transición se logra basado en el uso de mezclas intermedias de M(EO)2MA y OEGMA475, según Lutz et al. 23 Disolver todos los reactivos en dioxano (monómero total 5 mL/g) en un matraz de fondo redondo con uno o más cuellos. Purgar la reacción con flujo de nitrógeno (grado UHP) para 30 minutos. Una vez purgado, coloque el matraz en un baño de aceite precalentado mantenido a 75 ° C durante 4 horas bajo nitrógeno y agitación magnética de 400 rpm. Después de 4 h, eliminar el disolvente utilizando un rotavapor a 50 ° C y 200 rpm. Disolver el producto resultante del polímero en 150 mL de agua desionizada. Añadir adípico ácido dihydrizide (ADH) en un exceso molar quintuplicó el número de residuos de AA incorporados en el polímero (en este ejemplo, AA comprende 29 mol % de las unidades de monómero en polímeros producidos, según conductrimétrico titulación). Ajustar el pH de la solución a pH 4.75 con 0.1 M de HCl. Una vez que se ha estabilizado el pH, añadir N-(3-dimethylaminopropyl) -N’-etilcarbodiimida (EDC) en un exceso molar 5-fold a la cantidad de residuos de AA presentes). Mantener el pH de reacción 4.75 con adición gota a gota de ácido clorhídrico 0,1 M sobre 4 h. Dejar la reacción para revolver durante la noche. Vierta la solución de producto en tres tubos de diálisis larga ~ 30 cm (3500 Da peso molecular de corte, espesor de 1 pulgada), utilizando un embudo para minimizar el derrame. Utilizar una abrazadera de presión para cerrar la parte inferior del tubo antes del llenado doblando un segmento pequeño (~ 2 cm) del tubo para mejorar la integridad de la abrazadera; repetición en la parte superior (presionar para eliminar burbujas de aire) cuando el llenado es completo. Coloque los tubos dentro de un 100-fold volumen de exceso de agua desionizada y dejar durante al menos 6 h, reemplazando completamente el agua más de seis ciclos de diálisis para lograr la pureza deseada. Liofilizar la muestra dializada para obtener un producto de polímero seco final. 2. síntesis de polímeros funcionalizados de aldehído Síntesis de aldehídos Precursor monómero metacrilato de N-(2,2-Dimethoxyethyl) (DMEMA) Lugar 200 mL de una solución de NaOH 20% p/v en un matraz de fondo redondo de 500 mL 3 cuello. Enfríe la solución en un baño de hielo y mantener una temperatura de 0 ° C con hielo durante la reacción. Añadir 50 mL de aminoacetyl dimetilacetal de aldehído a la solución de NaOH fría. Agregar 0,1 g de TEMPO ((2.2.6.6-Tetramethylpiperidin-1-yl) oxyl) y revuelva a 400 rpm usando una barra de agitación magnética hasta que el TEMPO se disuelva completamente. Agregar a 48 mL de cloruro de methacryloyl gota a gota con una bureta durante 2 h. Después de 2 h, cubrir el recipiente de la reacción con papel de aluminio y dejar de revolver durante la noche. Extraer el producto por añadir producto de la reacción a 75 mL de éter de petróleo en un embudo de separación 1 L, sacudiendo, desgasificación y descartando la capa superior. Repita el paso 2.1.7 tres veces agregando el producto de la capa de fondo de cada paso de la extracción como la materia prima para el siguiente ciclo de extracción. Retire el producto de capa inferior final y la transferencia a un vaso de precipitados de 100 mL. Añadir ~ 5 g sulfato de magnesio (Mg2SO4) vaso de precipitados con monómero hasta una “bola de nieve” se observa el efecto. Filtrar con un embudo de Buchner para eliminar el magnesio2de 100 mL SO4. Enjuague el vaso dos veces con ~ 75 mL de éter de metil tert-butílico, verter la solución de enjuague a través del embudo cada vez. Transferir el producto a un matraz de fondo redondo de 500 mL y evaporar el solvente usando un evaporador rotativo a temperatura ambiente 200 RPM para recoger el producto final. Síntesis de polímeros funcionalizados de aldehídoNota: La siguiente receta específica está proporcionada para el polímero precursor de PNIPAM mimética POEGMA (PO10) 30 funcionalización de aldehído de % mol. Polímeros de precursor PNIPAM y POEGMA con temperaturas de transición de fase diferentes se pueden preparar utilizando el mismo método general pero modificando el tipo y proporción de los monómeros base utilizado (véase la sección 1.2 para modificaciones de diversos polímeros POEGMA)21 , 25 , 27. Pesar 0,1 g de oligo etilenglicol metacrilato 37 mg de 2,2′-azobis(2-methylpropionate) (AIBMe), 3,10 g de dietileno glicol metacrilato M(EO)2MA, (OEGMA475, 475 g/mol, n = 7-8 repetición unidades de óxido de etileno), 1,30 g de N-(2, 2- dimethoxyethyl) acrilamida (DMEMA) y 7.5 μl de ácido thiolglycolic (TGA) en un vial de centelleo de vidrio de 20 mL. Para PO0 (temperatura de transición de temperatura POEGMA), utilizar 4,0 g de M(EO)2MA (no OEGMA475). PO100 (no temperatura de transición POEGMA), utilizar 4,0 g de OEGMA475 (sin M(EO)2MA).Nota: Fase intermedia las temperaturas de transición se logra basado en el uso de mezclas intermedias de M(EO)2MA y OEGMA475, según Lutz et al. 23 Disolver todos los reactivos en dioxano (monómero total 5 mL/g) en un matraz de fondo redondo con uno o más cuellos. Purgar la reacción con flujo de nitrógeno (grado UHP) para 30 minutos. Una vez purgado, mantenido lugar matraz en un baño de aceite previamente calentado a 75 ° C durante 4 horas bajo nitrógeno y agitación magnética de 400 rpm. Después de 4 h, eliminar el disolvente utilizando un rotavapor a 50 ° C y 200 rpm. Disolver el producto resultante del polímero en 100 mL de desionizada H2O. Añadir 50 mL de 1 M de HCl en la solución disuelta y mezcle con agitación magnética (400 RPM) durante 24 h hidrolizar completamente las funcionalidades de acetal en DMEMA. Una vez terminada la reacción, transferencia de la solución de polímero en la tubería de la diálisis, según paso 1.13. Liofilizar la muestra dializada para obtener un producto de polímero seco final. 3. fabricación de hidrazona reticulado a granel hidrogeles Disolver hidrazida y polímeros funcionalizado aldehído por separado en 10 mM fosfato tamponada salino (PBS) o cualquier buffer acuosa deseada, para crear soluciones de concentración deseada.Nota: Las concentraciones de masa entre 5-40% de peso suelen usar normalmente, con congelación en concentraciones más bajas posibles si mayor grupo funcional fracciones están presentes en los polímeros. Utilizando una jeringa de barril único a la transferencia de las soluciones, cada solución precursora (~ 1 mL cada uno) en barriles separadas de una jeringa de doble barril (volumen de 2.5 mL, jeringa de relación 1:1) conectado a un mezclador estático (longitud de 1.5″) y (opcionalmente) una jeringa (típicamente 18 G, de la carga longitud 1.5″ para estudios in vitro) y (opcionalmente) una jeringa (típicamente 18 G, 1.5″ longitud para estudios in vitro). Preparar moldes de espesor deseado, la forma y el diámetro de perforación de agujeros en una hoja de goma de silicona.Nota: En un experimento típico, se utiliza un conjunto estándar de perforación para perforar un agujero cilíndrico de 7 mm de diámetro dentro de un 1/16″ espesor de silicona hoja de goma (volumen total de embalse ~ 300 μL). Monte el molde de silicona en un microscopio estándar de vidrio Deslice los agujeros perforados en el molde que están totalmente respaldados por vidrio.  Un lavado con ácido clorhídrico de 0,1 M del vidrio se recomienda pero no es necesario antes del montaje del molde de silicona. Co extrusión contenido de la jeringa de barril doble a través del mezclador estático para llenar completamente (o sobrellene ligeramente, con un menisco en la parte superior) el molde de silicona.Nota: Las muestras múltiples se pueden preparar durante muestra una extrusión siempre el tiempo de gelificación es en el mismo orden de magnitud o más que el tiempo total necesario para llenar moldes múltiples. Coloque otro portaobjetos de vidrio estándar en la parte superior del molde y esperar la gelificación completar.Nota: Las recetas estándar se describe en el gel de la sección de síntesis dentro de < 1 minuto; tiempos de gelificación más lentos (y por lo tanto tiempo de espera requerido) se observa en menores densidades de grupo funcional, menores concentraciones de polímero o fracciones mayores de OEGMA475 en relación con M(EO)2MA (para POEGMA los hidrogeles). Retire el portaobjetos superior y use una espátula para empujar el hidrogel del molde del caucho de silicona. Levantar el molde de portaobjetos inferior para recuperar los hidrogeles para más pruebas. 4. fabricación de micropartículas de Gel reticulado hidrazona Fabricación de Chip de microfluidos Deshidratar una oblea de silicio (D = 76,2 mm, 380 μm de grosor, P-dopado, orientación) por calentamiento en una placa caliente a 200 ° C durante 5 minutos. Centro de la oblea en un recubridor spin y abrigo de una gruesa capa de ~ 100 μm de photoresist SU-8 100 aplicando ~ 7 mL de SU-8 resistir, el giro en rampa la velocidad a 3000 rpm a una velocidad de 500 rpm y luego manteniendo la velocidad a 3000 rpm durante 30 segundos. Hornear previamente la capa a 65 ° C durante 10 minutos y luego suave-cueza al horno la capa a 95 ° C durante 30 minutos. Imprimir un photomask en una transparencia con el patrón de microfluidos definido por figura 2A, tal que las secciones transparentes son el patrón deseado de la capa de photoresist polimerizado. Inserte la oblea de silicio recubiertos de fotoprotección y el photomask en un alineador de la máscara y expone la oblea a la luz de nm 365 95 s (energía de exposición de 6.5 W). Hornear primero la oblea con 10 min a 95 ° C, colocando sobre una placa caliente a 65 ° C y posteriormente calentar la placa a 95 ° C a 10 ° C/min. Retirar la oblea de la placa y colóquela en un vaso de precipitados de 500 mL que contiene desarrollador 100 mL SU-8 para al menos 10 minutos, girando la oblea lentamente en la solución a través de quitar photoresist expuesto no. Después de 10 min, enjuagar la oblea modelada con isopropanol y secar con aire. Almacenar la oblea modelada en un ambiente fresco y seco lejos de la luz cuando no esté en uso para el moldeado de litografía suave réplica. Coloque el molde de microfluidos estampado en una placa Petri. Longitudes del tubo de silicona de 13 L/S en las entradas y salidas del chip en posición ~ 10 mm. Vierta aproximadamente 10 mL de poli (siloxano dimethyl) (PDMS; preparado mediante la mezcla de Base de elastómero de silicona y agente de curado de elastómero de silicona en una proporción 10:1) encima de la viruta, evitando incorporar cualquier PDMS dentro de la tubería de silicona colocado. Coloque la placa de Petri en una cámara de vacío para ~ 10 min eliminar las burbujas de aire que persiste en y alrededor de la estructura modelada durante el curado. Curar el PDMS colocando la placa de Petri que contiene el molde estampado y PDMS no curada en una placa caliente a 85 ° C para 2-3 h. Cuidadosamente Pele el PDMS curados de la oblea de silicio con motivos para exponer la suave réplica PDMS modelada litográfica del molde microfluídicos. Lugar el modelado PDMS y una diapositiva de cristal boca abajo en un plasma de alta potencia con una alimentación de aire. Se aplica el plasma en 200 mTorr y 45 W para 90 s para enlazar el PDMS para el portaobjetos de cristal y crear el chip microfluídico final. Síntesis de micropartículas de Gel Preparar PNIPAM hidrazida funcionalizados (PNIPAM Hzd) disolviendo NIPAM (4,5 g), ácido de acrílico (0,5 g – monómero total de 15 mol %), ácido tioglicólico (TGA, 80 μL) y éster del ácido dimetil 2, 2-azobisisobutyric (AIBME, 0,056 g) en 20 mL de etanol anhidro y posteriormente siguiendo los pasos 1.4-1.14 para completar la síntesis, aunque cambiando la temperatura de reacción a 56 ° C en paso 1.5. Preparar PNIPAM aldehído funcionalizados (PNIPAM-Ald) disolviendo NIPAM (4 g), N-(2, 2-dimethoxyethyl) metacrilato (DMEMA, 0,95 g – monómero total de 13,4 mol %), ácido tioglicólico (TGA, 80 μL) y el éster del ácido dimetil 2, 2-azobisisobutyric (AIBME, 0,056 g) en 20 mL de etanol y posteriormente después de 2.2.4-2.2.10 pasos para completar la síntesis, aunque cambiando la temperatura de reacción a 56 ° C en paso 2.2.5. Disolver PNIPAM Hzd y PNIPAM-Ald en el 6% de peso en agua desionizada y carga en jeringas separadas estándar 5 mL. Disolver 1 wt % agente tensioactivo no iónico (por ejemplo, el Span 80) en aceite de parafina pesada y cargar la solución en una jeringa de 60 mL estándar. Conectar las jeringas de solución de polímero dos precursor individualmente a los dos canales de entrada separado del polímero en el chip de microfluidos y la solución de aceite de parafina para el canal de entrada de aceite en el chip de microfluidos vía 1/32″ ID del silicón (~ 30 cm de longitud por entrada, de la tubería ~ 45 cm largo por salida). Usando dos separar bombas de jeringa de infusión (uno para el aceite arriba, para que el aceite añadido después de la boquilla), entregar el aceite en el chip con un caudal entre 1,1 mL/h y 5,5 mL/h sin iniciar el flujo de polímero para cebar el chip y el chip esté libre de defectos y operativa (normalmente mantenida durante un período de 30 minutos). Usando una bomba de jeringa de infusión separada, cada una de las soluciones acuosas de polímeros entregar el chip a un flujo de 0.03 mL por hora. Tras un periodo de estabilización inicial para asegurar que el flujo ha equilibrado y uniforme partículas forman (30 min – 1 h), recoger las partículas en un matraz de fondo redondo agitada magnéticamente. Recoger las partículas hasta que todo el aceite se consume (12-55 h, dependiendo del flujo). Parada de las bombas de jeringa y, si lo desea, inmediatamente la bomba agua en lugar de las soluciones de polímero precursor a través de la viruta para limpiar.  Sin embargo, dada la rápida congelación in situ de estos materiales cuando el flujo se detiene, se recomienda usar un chip nuevo para cada experimento independiente. Apagar la agitación magnética y dejar que las micropartículas de gel resolver. Decantar el aceite de parafina disponibles todas con ayuda de una pipeta. Para quitar la parafina restante, lavar las micropartículas de gel con pentano (aplicado a un volumen de 10 mL por cada 0,5 mL de volumen de micropartículas), Mezcle vigorosamente la emulsión para ~ 1 minuto, deje que las micropartículas de gel volver a colocar para ~ 1-2 horas y decantar apagado la fase orgánica residual con una pipeta. Repetir al menos 5 veces para asegurar el retiro de aceite de parafina completo. Resuspender las micropartículas de gel en 10 mL de agua desionizada en un vial de centelleo de vidrio de 20 mL y frasco con nitrógeno durante la noche para quitar cualquier pentano residual de purga. 5. fabricación de hidrazona reticulado Nanogels Disolver las soluciones madre de PNIPAM 9101s (1 w/v%) y PNIPAM Ald (1 w/v%) en agua desionizada. Preparar PNIPAM Hzd y PNIPAM Ald como se describe en las secciones 4.2.1 y 4.2.2, respectivamente. Calentar una alícuota de 5 mL de la solución madre de PNIPAM Hzd a 70 ° c utilizando un baño de aceite con agitación magnética (350 RPM) dentro de un vial de centelleo de vidrio de 20 mL.Nota: La solución debe ser opaca (es decir, la temperatura supera la baja temperatura de solución crítica de PNIPAM Hzd), pero no precipitado visible debe ser formado. Añadir una alícuota del 0.25 mL de PNIPAM Ald (5-20% en peso de la masa de PNIPAM Hzd presente en la solución de semilla) drop-wise en la solución de PNIPAM Hzd climatizada durante un período de 5-10 s. Continuar mezclando que la solución en el centelleo viales para 15 minutos más, después de que saque la muestra del baño de aceite y deje que el producto se enfríe a temperatura ambiente durante la noche. Dializan nanogels resultante en ciclos de 6 x 6 hora (con una membrana de diálisis 3500 kDa MWCO) contra agua desionizada para eliminar cualquier polímero no reticulado. Si lo desea, liofilizar para almacenamiento. 6. fabricación de nanofibras de hidrazona reticulado Preparar funcionalizados hidrazida POEGMA (POEGMA-Hzd) 37 mg dimetil 2,2′-azobis(2-methylpropionate) (AIBMe), metacrilato de oligoethyleneglycol 4,0 g de disolución (OEGMA475, 475 g/mol, n = 7-8 repetición unidades de óxido de etileno) y ácido de acrílico de 0.25 g (AA) en dioxano 20 mL y siguiendo pasos 1.3-1.14 para completar la síntesis. Preparar POEGMA aldehído funcionalizados (POEGMA-Ald) disolviendo 50 mg dimetil 2,2′-azobis(2-methylpropionate) (AIBMe), metacrilato de 4,0 g oligoethyleneglycol (OEGMA475, 475 g/mol, n = 7-8 repetición unidades de óxido de etileno) y 0,60 g N-(2, 2- metacrilato de dimethoxyethyl) (DMEMA) en 20 mL dioxano y siguientes pasos 2.2.3-2.2.10 para completar la síntesis. Disolver POEGMA Hzd (15% peso) y POEGMA-Ald (15% en peso) en soluciones separadas de agua desionizada. Disolver polivinílico (óxido de etileno) (PEO, Mw= 600 x 103 g/mol, 5% en peso) en agua desionizada.  Mezclar 1 mL de la solución PEO con cada reactivo solución POEGMA preparado en el paso 6.3 para crear soluciones de precursor final de 7.5 wt % POEGMA precursor del polímero y 2,5% de peso PEO. Cargar las dos soluciones en barriles separadas de la misma jeringa de doble cañón que se describe en la sección 3 (también incluyendo el mezclador estático 1.5″) y Monte la jeringa doble barril en una bomba de jeringa de infusión. Instale un mezclador estático y una aguja de punta Roma 18G en la jeringa de doble cañón. Conecte una fuente de alimentación de alto voltaje a la aguja de punta Roma, conectado a tierra en el colector.Nota: Colectores consisten ya sea de un cuadrado de 10 x 10 mm de papel de aluminio o un ~ 10 mm diámetro aluminio disco gira a una velocidad de 200 rpm, ambos montados perpendicular a la aguja a una distancia de 10 cm desde el extremo de la aguja. Arrancar la bomba de jeringa a una tasa de 0,48 mL/h y, simultáneamente, interruptor de alta tensión de 8,5 kV para realizar el electrospinning y crear nanofibras. Continuar el electrospinning como deseado para hacer andamios de diferentes espesores o hasta que se agoten las soluciones de entrada. Para quitar la ayuda de electrospinning PEO, remoje los andamios recogidos durante 24 h en agua desionizada.

Representative Results

Hidrogeles a granel, sacados una jeringuilla de doble barril en un molde de silicona se ajustan a las dimensiones del molde y ser libre al retirar del molde; Gelación típicamente ocurre segundos a minutos siguiente Co-extrusión según precursores de polímero utilizado. Caracterización típica vía inflamación (medida gravimétricamente mediante una inserción de la cultura de célula para eliminar fácilmente el hidrogel de la solución de inflamación), thermoresponsivity (medido usando la misma técnica pero ciclismo la temperatura de incubación anterior y debajo de la temperatura de transición fase), degradación (medido usando la misma técnica pero sobre períodos más largos) y corte o módulo de resistencia a la compresión (medido usando muestras de 2 mm de espesor y 7 mm diámetro moldeado) demuestra la afinabilidad del hidrogel respuestas dependiendo de la química del polímero precursor (específicamente, para POEGMA, la relación de corto a los monómeros OEGMA de cadena larga usados para preparar el hidrogel), la fracción de grupos funcionales en los polímeros del precursor y la concentración de los precursor de polímeros (figura 5)27. Microfluídica conduce a la formación de micropartículas de gel bien definidos en la escala de tamaño de 25-100 μm, con el tamaño controlable basado en las tasas de flujo de aceite o el polímero acuoso combinado fases (figura 6A)31. Microscopía óptica etapa caliente confirma que las micropartículas de gel mantengan la naturaleza interpenetrantes de los hidrogeles a granel, mostrando reversible dependiente de la temperatura inflamación-desinchazón con sólo una leve histéresis en el ciclo 1 (atribuible a formación irreversible de enlaces de hidrógeno entre grupos vecinos de amida en el colapsado estado34) consistente con lo observado en bulto PNIPAM hidrogeles (Figura 6B)32. Además, las micropartículas de gel se degradan a sus precursores los con el tiempo, permitiendo la depuración renal (figura 6)32. Uno mismo-Asamblea impulsada por el nanoaggregation de un polímero PNIPAM hidrazida funcionalizados en una solución caliente seguido por reticulación con un aldehino-functionalized PNIPAM polímero resultado altamente monodispersa nanogels (polidispersidad < 0.1) en el gama del tamaño de 180-300 nanómetro, dependiendo de las condiciones del proceso había utilizado (figura 7A)28. Las nanogels conservar el comportamiento típico interpenetrantes de nanogels PNIPAM convencional reticulado de radicales libres, con menores grados de térmica desinchazón observó como cross-linking más polímero fue agregado (figura 7B). La nanogels puede ser liofilizada y redispergidos sin un cambio en el tamaño de las partículas (figura 7C) y se degradan con el tiempo a través de hidrólisis para volver a formar los polímeros de los precursores utilizados para formular el nanogels (figura 7D). Electrospinning reactivo crea un nanofibras hidrogel estructura (figura 8A), con diámetros de nanofibras orden del día de ~ 300 nm alcanzable sin partículas visibles electrosprayed presentan33. Remojo las nanofibras en base POEGMA en agua resulta en la rápida hidratación (aproximadamente dos órdenes de magnitud más rápidas que logra con un gel a granel de una misma composición, figura 8B) pero mantiene la morfología de nanofibras durante 8-10 semanas antes degradación hidrolítica en condiciones fisiológicas; degradación más rápida se observa en ambientes catalizada por ácido, como se esperaba debido al potencial de degradación de bonos de hidrazona catalizada por ácido (figura 8C). Las nanofibras estructuras son también mecánicamente robustas en los Estados seco e inflamados durante varios ciclos, lo que permite un manejo fácil y repetitivo filtra (figura 8D). Figura 5 : Propiedades de in situ -gelificación a granel hidrogeles degradables interpenetrantes. (A) POEGMA representante del gel red microestructuras y a granel hidrogel imágenes con los correspondientes tiempos de gelificación en función de la incorporación de % mol de OEGMA475 en los polímeros del precursor; (B-C) Módulo de almacenamiento de información de la PO100 hidrogeles por diferente concentración de polímero de precursor (B) y (C) mole % grupo funcional incorporación por polímero precursor; (D-F) Propiedades fisicoquímicas de los hidrogeles POEGMA en función de la incorporación de OEGMA475 mole %: Perfil de degradación de módulo (E) (D) almacenamiento en 1 M HCl y temperatura de transición de fase (F) volumen en respuesta a la temperatura cambian en el rango 20-60 ° C. Todas las barras de error representan la desviación estándar de n = 4 medidas replicadas. Adaptado de la referencia27 , con permiso de Elsevier. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 6 : Propiedades de micropartículas de gel degradables de microfluídica reactiva. (A) efecto del caudal de aceite de parafina en gel (purificada) tamaño de micropartículas en el agua; (B) Thermoresponsivity de micropartículas de gel purificado en agua siguiendo un ciclo térmico solo por encima y por debajo de la temperatura de transición de fase de volumen; Evaluación (C) Visual (fotos) y gel de rastros de cromatografía de permeación (gráfico) confirma degradación de micropartículas de gel de nuevo a sus componentes de polímero precursor (aquí, en 1 M de HCl para facilitar la degradación acelerada en la escala de tiempo de la proyección de imagen); barra de escala = 100 μm. adaptado de referencia32. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 7 : Propiedades de nanogels degradable de reactivo uno mismo-Asamblea. (A) distribución de tamaño de partícula de nanogels con cocientes masa del polímero de diferentes aldehídos: hidrazida de dispersión ligera dinámica (inserción: micrografía electrónica de transmisión confirmar la naturaleza esférica de la nanogels); (B) Thermosensitivity de uno mismo-montado partículas en función de la relación masa de polímero de aldehído: hidrazida para preparar el nanogels (de la dispersión ligera dinámica), con barras de error que representa la desviación estándar de n = 4 repeticiones; Confirmación Visual (C) la falta de agregación de nanogel pre y posterior liofilización; (D) confirmación visual de la degradación catalizada por ácido de nanogels (aquí en 1 M de HCl para la consistencia con otros estudios anteriores); (E) el gel permeación cromatógrafo los rastros de productos de degradación de nanogel indicando su semejanza a la hidrazida y polímeros funcionalizados aldehído precursor. Adaptado con permiso de referencia28. Derechos reservados 2015, American Chemical Society. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 8 : Propiedades de nanofibras degradables de electrospinning reactivo. (A) microscopía electrónica de imágenes de nanofibras en el seco estado (izquierda), la mitad sumergido en agua (media, fina película) y completamente empapan en agua durante la noche (andamio derecha, grosor); (B) hinchamiento del hidrogel de nanofibras (rojo) en relación con un hidrogel a granel (azul) de la misma composición, con barras de error que representa la desviación estándar de n = 4 repeticiones; (C) exploración imágenes visuales la microscopia electrónica y (recuadro) seguimiento de la degradación catalizada por ácido de nanofibras en 1 M de HCl; (D) hinchadas (325 ciclos, 10% elongación/ciclo en 10 mM PBS) y ciclismo resistencia a la tracción de seco (80 ciclos, 20% elongación/ciclo) hidrogeles de nanofibras electrospun. Figura modificada de referencia33 y reproducido con permiso de la Real Sociedad de química. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Hemos aplicado con éxito todas estas técnicas de fabricación en varios sistemas de polímero con sólo ligeras variaciones de los métodos descritos en detalle por encima de PNIPAM y POEGMA; sin embargo, los usuarios de estos protocolos deben ser conscientes de los problemas potenciales que pueden surgir cuando se sustituyen los otros polímeros en estos procesos. En particular, aumentando la viscosidad de los polímeros de precursor puede afectar negativamente el tratamiento (especialmente en el método de microfluidos) así como la eficiencia de la mezcla de los polímeros de dos precursores. Además, debe controlarse el tiempo de gelificación de los polímeros a una velocidad que depende de la morfología dirigida para evitar la gelificación prematura que sirve para inhibir el flujo o impedir la interdifusión de los prepolímeros reactivos, esenciales para formar la estructuras de gel homogéneo. A continuación se describen las limitaciones específicas de cada estrategia, así como los enfoques que hemos usado para adaptar los enfoques para abordar las limitaciones en cada escala de la longitud de fabricación,

A granel hidrogeles mediante coextrusión de jeringa de doble barril
Tiempo de gelificación es la variable clave a controlar para asegurar la eficacia de la técnica de la jeringa de doble barril para formar hidrogeles a granel. Polímeros que gel demasiado rápido al entrar en contacto ( 5 s es preferible (aunque no necesario) para el uso de esta técnica; Esto es particularmente importante si replicar los hidrogeles están siendo fundidos para que análisis físico o mecánico asegurar que cada reparto de hidrogel tiene la misma composición. Tiempo de gelificación puede ser fácilmente alterado modificando la densidad de grupos funcionales reactivos en una o polímeros de precursor (grupo funcional una densidad más baja lleva a congelación lenta) o cambiando la concentración de los polímeros de precursor utilizado para formar el gel ( disminuir concentraciones que gelificación lenta)21. Alternativamente, reemplazando el grupo aldehído (más reactivo) con el grupo cetona (menos reactivo) como electrófilo en el gelificación par significativamente reduce el tiempo de gelificación sin cambiar significativamente la composición de la35 del hidrogel resultante ; polímeros preparan con mezclas de aldehído y precursores monoméricos cetona pueden utilizarse para ajustar el tiempo de gelificación deseado sin cambiar la concentración de polímeros precursor utilizado (y por lo tanto el porcentaje de masa de sólidos en el gel resultante formado).

También quisiera señalar que el primer elenco de hidrogel no siempre tiene las mismas propiedades como hidrogeles posterior del molde, una observación atribuida a ligeras diferencias en la tasa a la que el contenido de los dos barriles alcanza el mezclador estático. Como resultado, por lo general cebe la jeringa de barril doble sacando un pequeño (< 0,3 mL) fracción de gel antes de iniciar el proceso de fundición para reducir dicha variabilidad. Por último, aunque no típicamente problemático al usar los polímeros sintéticos de antes, la viscosidad de una o más soluciones de polímero precursor puede plantear un desafío en el contexto de esta técnica, tanto en términos de facilitar el flujo con depresión simple pulgar así como la promoción efectiva de mezcla en el mezclador estático. Sin embargo, sorprendentemente, incluso precursor polímero soluciones marcadamente diferentes viscosidades todavía forman hidrogeles relativamente homogéneos, utilizando los accesorios de mezclador estático que se describe en la lista de piezas (por ejemplo, PNIPAM con una alta molecular peso carbohidratos26), sugiriendo que preocupa mezclado ineficiente como resultado de mal emparejados viscosidades puede no ser significativa por lo menos en la escala de a granel. Si es necesario, el uso de una bomba de jeringa (en vez del pulgar) al flujo de la unidad y/o el uso de una aguja de calibre más grande en la salida puede ayudar a superar problemas asociados con la extruibilidad en estos sistemas.

Hidrogeles de microescala mediante microfluídica reactiva
El paso clave asociado con el enfoque de la microfluídica para la fabricación de micropartículas de gel es el oscurecimiento del chip de microfluidos con los dos polímeros reactivos. Si los polímeros son entregados con diferentes presiones o a diferentes velocidades en el chip, la presión diferencial puede conducir el reflujo de la solución de polímero de una precursora en el depósito (o al menos hacia el embalse) del otro polímero precursor. Esto resulta en congelación antes de la formación de partículas, con eficacia bloqueando el flujo y por lo que requiere la eliminación de viruta. El tortuoso camino impreso entre cada depósito y el punto mezcla crea una resistencia significativa a contraflujo; sin embargo, incluso un operador capacitado en ocasiones gel un chip antes de un régimen de flujo estable. Basándonos en nuestra experiencia, entre 1-2 min es típicamente necesaria para estabilizar los flujos después de la iniciación de la formación de la gota (en el cual tiempo relativamente polidispersas micropartículas de gel se producen); Si no hay problemas se observan durante los primeros 5-10 minutos de operación, es probable que se pueden conseguir varias horas de producción de partículas continuo monodispersa. El uso de precursor de polímeros con viscosidades relativamente bien emparejados así como tiempos de gelificación no instantáneo (al menos > 15 s preferible) ayuda grandemente en evitar tales problemas y promoviendo la formación de flujos estables.

Nota que varios caudales que van desde 0.01-0.1 mL/h en la fase acuosa y 1.1 5.5 mL/h en la fase de petróleo han sido probados con este diseño de viruta, conduce a la fabricación de partículas en el rango de tamaño de ~ 25-100 μm según el corte aplicado en la enfoque de flujo de salida; tasas de flujo más rápidas equivalen a esquileo superior y así las partículas más pequeñas formaron31,32. Variando el caudal de aceite manteniendo la tasa de flujo acuoso total baja (~0.03 mL/h, según lo citado en el protocolo) fue encontrada para ser más eficiente para controlar tamaño de micropartículas de gel sin comprometer monodispersity o la vida útil del dispositivo, los cuales fueron observado para reducir de manera significativa en el extremo superior de las tasas de flujo acuoso total citado. Grandes caudales de aceite (> 5,5 mL/h) para crear las partículas más pequeñas son posibles, pero aumentó el riesgo de delaminación de chip (una limitación común encontrada con chips de microfluídica PDMS plasma en condiciones de servidumbre). Las virutas usando otro método de la vinculación puede permitir tasas de flujo más rápidas y por lo tanto menor producción de micropartículas de gel, una estrategia que actualmente estamos explorando. Disminuir el tamaño de la boquilla también puede ayudar a reducir el tamaño de las micropartículas que se pudieran producir, aunque a un mayor riesgo de gelificación prematura antes de la formación de partículas. Las tasas de flujo más lento tienden a conducir a inestabilidades y polydispersities mayor y un mayor riesgo de gelificación de la viruta; Esta limitación podría superarse mediante el uso de un sistema de control de flujo de microfluidos multicanal que tiene mayor estabilidad y mayor resolución que las bombas de jeringa estándar utilizadas en el presente Protocolo.

La elección del aceite fue fundamental para el éxito de este protocolo, como los aceites más pesados (favorables en términos de prevenir la aglomeración de micropartículas de gel después de la recolección) conducido a mucho menos coherente formación de partículas en la boquilla que el aceite de silicona ligeros registrados en el protocolo. Presumimos que esta reducción es consecuencia de la menor consistencia de la jeringa de bombeo de los aceites más pesados, a esquileo más variable en el punto de mezcla. Evitar la agregación de micropartículas de gel en el frasco de colección también fue un desafío, particularmente inmediatamente a la salida del dispositivo de microfluidos en ese momento en situ gelificación no era completa y gran número de disponibles reactivo funcionales los grupos estaban disponibles a los puentes de formulario entre las partículas que colisionan en el baño de la colección. Se aborda este reto: aumentar la longitud del canal de salida en el chip de microfluidos sí mismo, manteniendo las micropartículas de gel en cabina de flujo laminar para un largo periodo de tiempo para promover la gelificación más completa; agregar los canales laterales después de la boquilla de alimentación más aceite en el chip y así se separa mejor las micropartículas de gel en este canal la mezcla sin afectar a los campos de esquileo en la boquilla de sí mismo o la tasa de producción de partículas; y agregar un mezclador magnético al matraz de recogida para evitar sedimentación de micropartículas de gel y mantener una mayor separación media entre partículas adyacentes. Mientras que polímeros gelificantes muy lentas probablemente mejoraría la estabilidad del dispositivo y minimizar los problemas con imprimación, estos sistemas también fueron observados para incrementar significativamente el riesgo de la agregación de micropartículas de gel, como un mayor número de grupos funcionales reactivos permanece sin reaccionar (y por lo tanto capaz de puentes entre partículas de forma) durante un período más largo de tiempo. Así, tiempos de gelificación del orden de 15-60 s parecen óptimo para esta técnica: lentitud suficiente para permitir el cebado pero lo suficientemente rápido para grupos funcionales más reactivos se consumen antes de las micropartículas de gel saliendo del canal de flujo laminar en el frasco de colección.

Finalmente, extracción del aceite de las plantillas es esencial para asegurar que las partículas resultantes mantengan que las propiedades inteligentes esperado basado en la composición de los pre polímeros añadido y permiten el uso de estas partículas en un contexto biomédico. El pentano lavado procedimiento descrito fue altamente eficaz en este sentido para la producción de micropartículas de gel general. Sin embargo, la aplicación de esta técnica en un contexto biomédico directo (p. ej., encapsulado en un chip celular) requeriría nueva evaluación de este protocolo. También hemos explorado el uso de aceite de oliva, sugerido para ser que un aceite más inerte en el contexto de ponerse en contacto con las células36, como el dispersante. Mientras que la formación de partículas era posible, las poblaciones de micropartículas de gel fueron significativamente más polidispersas que podría lograrse con aceite mineral, por lo menos con el actual diseño de viruta. Así, mientras que el chip parece ser adaptable a polímeros sintéticos y polímeros naturales de formación de micropartículas de gel31, un diseño modificado puede ser necesario para explotar esta técnica más ampliamente a través de todas las posibles combinaciones de material.

Hidrogeles de nanoescala vía reactivo uno mismo-Asamblea
Nanogels se han formado mediante una amplia gama de condiciones, incluyendo diferentes concentraciones de polímero semilla de procesamiento (0.5-2% en peso), diversos cocientes de polímero crosslinking:seed (0.05-0.2), diferentes temperaturas (40-80 ° C), diferentes mezclas (velocidades) 200-800 rpm) y calefacción diferentes tiempos después de la adición del crosslinker polímero (2-60 min)28. En términos de concentraciones, las tendencias observadas son generalmente como se predijo, como altas concentraciones de polímero de semilla de plomo para mayor nanogels y cocientes más altos de polímero de crosslinker:seed llevan a nanogels con mayor densidad de reticulación y así bajar thermoresponsivities. Cabe destacar que el polímero de semilla en aumento concentración demasiado alta conduce finalmente a la agregación en lugar de nanoaggregation, consistente con lo observado en el proceso de precipitación convencional radical libre para formar interpenetrantes nanogels3. Tiempos más cortos de la calefacción también resultaron favorables para formar más y más partículas monodispersa. Presumimos sostiene la nanoaggregate en tiempos más largos a una temperatura superior a la LCST uno o ambos de los polímeros de precursores aumenta la probabilidad de agregación nanogel de colisión, con la mayor hidrofobicidad de la hidrazona bonos relativos al ya sea el precursor aldehino o hidrazida grupos funcionales haciendo esta agregación más probable según aumenta el grado de entrecruzamiento alcanzado. En definitiva, tiempos más cortos de la calefacción son favorables desde una perspectiva de proceso, como una población de nanogel monodispersa puede ser formada en tan sólo 2 minutos después de la adición de polímero crosslinker; 10 min fue encontrado para ser el tiempo más largo que podría producir constantemente monodispersa nanogels permitiendo también para la producción de más altamente reticulado nanogels. Curiosamente, el método es notablemente insensible a la mezcla, con tamaños de partícula casi idéntico y distribuciones de tamaño de partícula resultante de la mezcla a distintas velocidades o incluso escalar el proceso a volúmenes más grandes. Mientras que inicialmente sorprendido por este resultado, lo probable es que habla para el papel principal de la termodinámica en la regulación de la producción de nanogel.

Para lograr el polydispersities baja, la estabilidad coloidal y el grado de hidratación de la nanoaggregate parecen ser las variables clave. Por ejemplo, nanoaggregates preparados utilizando los polímeros funcionalizados hidrazida más hidrofílicos como la semilla en comparación con los polímeros funcionalizados aldehído menos hidrofílicos llevar a nanogels con polydispersities significativamente menor. La diferencia entre la temperatura del montaje experimental y LCST del polímero semilla también es fundamental. Operando a una temperatura justo por encima del polímero de semilla LCST ((T-LCST) < 5 ° C) ofrece la mayor probabilidad de formación de nanogel monodispersa; de funcionamiento muy por encima de la LCST crea más nanoaggregates hidrofóbica y colapsado que tienen más probabilidades de agregado y menos probable de reticulación, funcionando por debajo de los resultados LCST en un polímero de semilla relativamente no-compacto que no puede ser eficaz o reproducible reticulado. Para la mejor predicción de partículas monodispersity, recomendamos primero realizar una exploración de UV/vis para medir el inicio LCST del polímero de semilla y posteriormente realizar la uno mismo-montaje proceso a una temperatura de 1-2 ° C por encima de eso LCST.

Observe que nanogels mediante este método podría liofilizado y redispergidos sin ningún cambio en la estabilidad coloidal, a menudo no es posible para uno mismo-montado estructuras y consideramos a nuestro método de estabilización de la reticulación. Anticipamos también que sólo el polímero de la semilla tiene que ser interpenetrantes para este método de trabajo; uso de la reticulación de los polímeros que son no responde o responde a otros estímulos puede ampliar aún más la máxima aplicabilidad de esta técnica. Por último, ya que la mezcla de los dos polímeros reactivos precursor es en este caso pasivo frente a activo, tiempo de gelificación es mucho menos importante en términos de control de proceso en relación con las estrategias de fabricación que se describe. Sin embargo, incluso en esta técnica, manteniendo el tiempo de reticulación total < 30 min es deseable para minimizar el riesgo de agregación de las partículas.

Hidrogeles de nanofibras mediante electrospinning reactiva
Controlar el tiempo de gelificación de los prepolímeros reactivos nuevamente es esencial para el éxito de la producción de nanofibras de gel. En particular, emparejando aproximadamente el tiempo de residencia de los polímeros del precursor en el mezclador estático (controlada cambiando el flujo de la solución de la jeringa de doble cañón, así como la longitud y tortuosidad de los mezcladores estáticos) con la gelificación a granel tiempo de los polímeros de precursor es esencial tanto para preservar entallabilidad así como asegurar la efectiva entrecruzamiento de las fibras hiladas entre la aguja y el selector. Congelación más rápida conduce a ineficaz desarrollo de cono de Taylor y así entallabilidad pobre, mientras que resultados de gelificación lentas en una solución acuosa en vez de un gel de golpear al colector, resultando en la difusión y la formación final de una película delgada de gel en vez de nanofibras. Trabajo en tiempos de residencia un poco más abajo el tiempo de gelificación a granel también se ha encontrado para ser eficaz (y de hecho es preferible para reducir el riesgo de obstrucción de la aguja) ya que la evaporación del agua como la solución es girar efectivamente concentra los polímeros del precursor de la de la corriente y así acelera la cinética de la congelación durante el proceso de hilado. En este mismo sentido, operan a mayores distancias de recolector de aguja (> 10 cm) es generalmente favorable en este proceso, como distancias más cortas reducen el tiempo disponible para la evaporación del agua y por lo tanto requieren control más riguroso sobre la relación entre tiempo de permanencia y tiempo de congelación para preservar un producto nanofibras.

Tenga en cuenta que el uso de PEO (u otro peso de molecularidad elevada y fácilmente electrospun polímero) es esencial en este protocolo para promover la formación de nanofibras, como los oligómeros POEGMA cortos y muy ramificados solo no pueden alcanzar un adecuado grado de enredo para inducir Electrospinning; en cambio, resultados de electrospray en todas condiciones de proceso probadas para formulaciones sólo POEGMA (aunque esto también puede tener aplicaciones para la fabricación de partículas de gel degradables utilizando esta misma química). Una concentración mínima de PEO de 1% en peso (peso molecular de 1 MDa) es necesaria para mantener una morfología completamente nanofibras. Tenga en cuenta que se puede quitar el PEO de las fibras siguiendo un simple procedimiento de remojo (agua desionizada, 24 h) sin alterar la integridad de la red de nanofibras. de esta manera, PEO actúa más como una ayuda transitoria electrospinning que un componente esencial del producto final nanofibras. Tenga en cuenta también que varios tipos de colectores de aluminio sencilla (para crear hidrogeles de capa delgada que pueden delaminate del colector en remojo) así como un disco giratorio de aluminio (para crear andamios más gruesos) pueden utilizarse en conjunción con este mismo técnica, siempre las otras variables del proceso que controla la velocidad de gelificación, la tasa de electrospinning y la tasa de evaporación de agua durante el electrospinning permanecen inalteradas.

Curiosamente, dependiendo del método usado para preparar las diferentes morfologías, se han observado diferencias significativas en los tiempos de degradación de los hidrogeles preparados a partir de los mismos precursores de hidrogel. Por ejemplo, POEGMA nanofibras hidrogeles se degradan más lentamente que a granel POEGMA hidrogeles con la misma composición a pesar de su área de superficie significativamente mayor y así el acceso al agua para hidrolizar los enlaces de hidrazona. Relacionamos estas diferencias a los contrastes inherentes de los protocolos descritos en términos de la geometría de la mezcla de los polímeros del precursor, que pueden llevar a gel interno homogeneidades o morfologías que son significativamente diferentes o en situ concentración de precursores de polímero en la misma escala de tiempo como gelificación, particularmente relevante en electrospinning debido a la evaporación del agua simultáneo y reticulación observada en este proceso. Mientras que esto puede complicar un poco la elección de los polímeros de precursor si un polímero está dirigido para el uso en cada protocolo, también puede ofrecer una oportunidad técnica en cuanto a que los hidrogeles con una composición química pero de propiedades físicas muy diferentes.

En general, los métodos descritos ofrecen una estrategia para la fabricación de análogos degradables (o por lo menos renally deposites) de polímeros interpenetrantes en múltiples escalas de la longitud (a granel, micro y nano) y con múltiples tipos de estructuras internas (partículas o fibras). Tales protocolos de la dirección los obstáculos claves para la traducción acertada de materiales interpenetrantes sintético preparado convencionalmente en el ámbito biomédico: inyectabilidad y degradabilidad. Seguimos a explorar la aplicación de tales materiales en la administración de fármacos y tejidos ingeniería de aplicaciones que van desde la orientación física de cánceres, el transporte de drogas a través de la barrera blood – brain, el suministro terapéutico de proteínas en la parte posterior del ojo, el crecimiento direccional de los tejidos y termoreversibles adhesión y diferenciación de las células, entre otras aplicaciones.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Financiación de las ciencias naturales e Ingeniería investigación Consejo de Canadá (NSERC), el crear de NSERC-(diseño integrado de Matrices extracelulares) Programa 20/20: NSERC oftálmico red de investigación de biomateriales y el Ministerio de Ontario de la investigación y Programa de premios de investigador temprano de innovación se reconoce.

Materials

Chemicals
2,2 – azobisisobutryic acid dimethyl ester Wako Chemicals 101138
Di(ethylene glycol) methyl ether methacrylate (M(EO)2MA) Sigma Aldrich 447927 188.2 g/mol, n=2 ethylene oxide repeat units
Oligo (ethylene glycol) methyl ether methacrylate (OEGMA475) Sigma Aldrich 447943 475 g/mol, n=8-9 ethylene oxide repeat units
Acrylic acid (AA), 99% Sigma Aldrich 147230
Thioglycolic acid (TGA), 98% Sigma Aldrich T3758
Dioxane, 99% Caledon Labs 360481
Nitrogen, UHP grade Air Liquide Alphagaz1 765A-44
Adipic acid dihydrazide (ADH), 98% Alfa Aesar A15119
N'-ethyl-N-(3- dimethylaminopropyl)-carbodiimide (EDC, x%) Carbosynth FD05800
Hydrochloric acid (HCl), 37% Sigma Aldrich 320331
Sodium hydroxide (NaOH), 97% Sigma Aldrich 221465
Aminoacetyl aldehyde dimethyl acetal, 99% Sigma Aldrich 121967
4-Hydroxy-TEMPO, 97% Sigma Aldrich 176141
Methacryloyl chloride,97x% Sigma Aldrich 523216
Petroleum ether, 95% Sigma Aldrich 32047
Magnesium sulfate, 99.5% Sigma Aldrich M7506
tert-Butyl methyl ether, >99.0% Sigma Aldrich 443808
Phosphate buffered saline BioShop PBS405.1 1x, pH 7.3-7.5
N-isopropylacrylamide, 99% J&K Scientific 258717 Recrystallized from 60% hexanes/40% toluene
Ethanol, anhydrous Commerical Alchols P016EAAN
Span 80 Sigma Aldrich S6760
Heavy paraffin oil Caledon Labs 1326197
Pentane, reagent grade Caledon Labs 1/10/7800
Poly (ethylene oxide) average Mv 600,000 Sigma Aldrich 182028
Supplies essential for synthesis and hydrogel fabrication
Rotary evaporator Heidolph G3
Dialysis tubing (3500 Da molecular weight cut-off) Spectrum Labs 28170-166 Vol/length= 6.4mL/cm
Double barrel syringe Medmix L series L series, 2.5 mL, 1:1 volume ratio
Static mixer Medmix L series L series, 2.5 mL, 1:1 volume ratio, 1.5" length
Silicone rubber sheet, 1/16" thickness McMaster-Carr 9010K12, 30A Durometer (Super Soft)
Syringe pump KD Scientific KDS Legato 200 Infuse Only Dual Syringe Pump
High voltage power supply Spellman 230-20R 0 to 20 kV
Microfluidic Chip Fabrication
Silicon wafer University Wafer 2080 D = 76.2 mm; 380 µm thickness; P-doped; <100> orientation 
SU-8 100 MicroChem Y131273
SU-8 Developer MicroChem Y020100
Custom 2.5" spincoater Built in-house N/A
Mask Aligner KARL SUSS MJB3 UV400 (with a 276 W lamp)
Masterflex L/S 13 Silicone Tubing Cole Parmer OF-96400-13 Peroxide-cured
Dow Corning Sygard 184 Silicone Elastomer Base  Ellsworth Adhesives 4019862
Dow Corning Sygard 184 Silicone Elastomer Curing Agent  Ellsworth Adhesives 4019862
High Power Plasma Cleaner  Harrick PDC-002-HP
Characterization Instruments
Mach 1 micromechanical tester Biomomentum LB007-EN
Cellstar tissue culture 12 well plate Greiner Bio-one 665 180
Cell culture insert for 12 well plate Corning 08-771-12 8 µm pore size
Optical microscope Olympus BX51 optical microscope BX51
Temperature-controlled microscope stage Linkam Scientific THMS600
Gel permeation chromatograph (GPC) Waters 590 HPLC Pump Waters Styragel columns (HR2, HR3, HR4; 30 cm x 7.8 mm (ID); 5 mm particles), Waters 410 refractive index detector
Dynamic light scattering (DLS) Brookhaven 90Plus Particle Size Analyzer
Transmission electron microscopy (TEM) TEMSCAN JEOL 1200EX Accelerating voltage 100 kV
Scanning electron microscopy (SEM) Tescan Vega II LSU Accelerating voltage 10 kV
Microsquisher CellScale Biomaterials Testing MS-50M-01
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Riferimenti

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Sivakumaran, D., Bakaic, E., Campbell, S. B., Xu, F., Mueller, E., Hoare, T. Fabricating Degradable Thermoresponsive Hydrogels on Multiple Length Scales via Reactive Extrusion, Microfluidics, Self-assembly, and Electrospinning. J. Vis. Exp. (134), e54502, doi:10.3791/54502 (2018).
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