Fabbricando degradabile Hydrogel idrogeli su scale di lunghezza Multiple tramite estrusione reattiva, microfluidica, auto-assemblaggio ed elettrofilatura

Abbiamo applicato con successo tutte queste tecniche di fabbricazione di sistemi multipli di polimero con solo lievi variazioni dei metodi descritti in dettaglio sopra per PNIPAM e POEGMA; Tuttavia, gli utenti di questi protocolli devono essere consapevoli dei potenziali problemi che possono sorgere quando vengono sostituiti con altri polimeri in questi processi. In particolare, aumentando la viscosità dei polimeri precursore può influire negativamente sulle sia la lavorabilità (soprattutto nel metodo microfluidica), nonché l’efficienza di miscelazione dei polimeri due precursore. Inoltre, il tempo di gelificazione dei polimeri deve essere controllato ad un tasso dipendono la morfologia mirata al fine di evitare la prematura gelificazione che serve a inibire il flusso o prevenire interdiffusione dei pre-polimeri reattivi, essenziali per formare la desiderata strutture di gel omogeneo. Le limitazioni specifiche di ogni strategia, nonché approcci che abbiamo usato per adattare questi approcci per affrontare tali limitazioni in ogni scala di lunghezza di fabbricazione, sono descritti di seguito.

Idrogeli tramite coestrusione di siringa doppia canna di massa
Tempo di gelificazione è la variabile chiave di controllo per garantire l’efficacia della tecnica siringa doppia canna per la formazione di idrogeli di massa. Polimeri che gel troppo veloce al contatto ( 5 s sono preferibili (anche se non obbligatorio) per l’utilizzo di questa tecnica; Ciò è particolarmente importante se replicati idrogeli sono essere lanciati per analisi fisiche o meccanica garantire che ogni lancio di idrogel ha la stessa composizione. Tempo di gelificazione può essere facilmente alterato modificando la densità di gruppi funzionali reattivi su uno o sia polimeri precursore (bassa densità di gruppo funzionale che porta a gelificazione più lento) o cambiando la concentrazione dei polimeri precursore utilizzato per formare il gel ( abbassare le concentrazioni che conduce a gelificazione più lento)²¹. In alternativa, sostituendo il gruppo aldeidico (più reattivo) con il gruppo chetonico (meno reattivo) come l’elettrofilo nella coppia gelificante significativamente riduce il tempo di gelificazione senza modificare significativamente la composizione dell’idrogel risultante³⁵ ; polimeri preparati con miscele di aldeide e precursori monomerici chetone possono essere utilizzati per ottimizzare il tempo di gelificazione come desiderato senza modificare la concentrazione di polimeri precursore utilizzato (e quindi la percentuale in massa di solidi nel gel risultante formata).

Notiamo anche che il primo cast di idrogel non ha sempre le stesse proprietà idrogeli successivi lanci, un’osservazione attribuita a lievi differenze nel tasso a cui il contenuto di due bariletti effettivamente raggiunge il miscelatore statico. Di conseguenza, abbiamo in genere adescare la siringa doppia canna estrudendo un piccolo (< 0,3 mL) frazione di gel prima di iniziare il processo di fusione per ridurre al minimo tale variabilità. Infine, mentre non è in genere problematico quando si utilizza oligomerici pre-polimeri sintetici, la viscosità di una o più soluzioni di polimero precursore può rappresentare una sfida nel contesto di questa tecnica, sia in termini di agevolazione del flusso mediante depressione semplice pollice oltre a promuovere efficace miscelazione all'interno del miscelatore statico. Tuttavia, piuttosto sorprendentemente, anche soluzioni di polimero precursore con viscosità nettamente diverse formano ancora relativamente omogenei idrogeli utilizzando gli allegati di miscelatore statico descritti nell'elenco delle parti (ad es., PNIPAM con un alto molecolare peso del carboidrato²⁶), suggerendo che le preoccupazioni circa la miscelazione inefficiente a seguito di mis-matched viscosità potrebbe non essere significativo almeno sulla scala di massa. Se necessario, l’uso di una pompa a siringa (anziché il pollice) al flusso di auto e/o l’uso di un ago di calibro più grande presso l’outlet può aiutare a superare problemi associati estrudibilità in questi sistemi.

Idrogeli di Microscala via reattiva microfluidica
Il passo chiave connesso con l’approccio di microfluidica per fabbricazione di microparticelle di gel è l’innesco del chip microfluidici con due polimeri reattivi. Se i polimeri vengono consegnati con pressioni differenti o a velocità diverse nel chip, la pressione differenziale può guidare il riflusso di soluzione polimerica un precursore nel serbatoio (o almeno verso il serbatoio) di altro polimero precursore. Ciò provoca gelificazione a Monte da formazione di particelle, bloccando il flusso e quindi smaltire chip. Il percorso tortuoso improntato tra ciascun serbatoio e il punto di miscelazione crea una resistenza significativa a riflusso; Tuttavia, anche un operatore addestrato occasionalmente gel un chip prima che sia raggiunto un regime di flusso stabile. Basandoci sulla nostra esperienza, tra 1-2 min è in genere necessaria per stabilizzare i flussi che seguono l’inizio della formazione della gocciolina (nel quale tempo relativamente polidispersi gel microparticelle sono prodotti); Se si osservano entro i primi 5-10 minuti di funzionamento senza problemi, è probabile che molte ore di produzione delle particelle monodisperse continuo possono essere raggiunto. L’uso di polimeri di precursore con viscosità relativamente ben abbinati, nonché tempi di gelificazione non istantanea (almeno > 15 s preferibile) notevolmente aiuta a evitare tali problemi e promuovendo la formazione di flussi stabili.

Nota che varie portate che vanno da 0,01-0,1 mL/h nella fase acquosa e 1.1-5.5 mL/h in fase di olio sono stati testati utilizzando la progettazione di chip, che conduce alla fabbricazione delle particelle dell’intervallo di dimensioni di ~ 25-100 µm secondo la cesoia applicata presso il giunzione di flusso-messa a fuoco; velocità di flusso equivale a taglio più alto e così le particelle più piccole formano^31,32. Variando la velocità di flusso di olio, mantenendo basso il tasso di flusso acquoso totale (mL/h ~0.03, come citato nel protocollo) è stato trovato per essere più efficiente per controllare la dimensione di microparticelle di gel senza compromettere la durata del dispositivo o monodispersity, entrambi i quali sono stati osservato per fare diminuire significativamente all’estremità superiore dei tassi citati totale flusso acquoso. Grandi portate di olio (> 5,5 mL/h) per creare particelle più piccole sono possibili, ma ha aumentato il rischio di delaminazione chip (una limitazione comune incontrata con plasma-legato chip microfluidici PDMS). I chip utilizzando un altro metodo di legame può consentire velocità di flusso e così più piccola produzione di microparticelle di gel, una strategia che attualmente stiamo esplorando. Diminuire le dimensioni dell’ugello può anche contribuire a ridurre le dimensioni delle microparticelle che potevano essere prodotto, seppur ad un elevato rischio di gelificazione prematura prima della formazione della particella. Più lenta velocità di flusso teso a portare a flusso instabilità e così polidispersità superiore e un rischio aumentato di gelificazione chip; Questa limitazione potrebbe essere superata utilizzando un sistema di controllo di flusso multicanale microfluidici che ha più alta stabilità e una risoluzione superiore rispetto alle pompe siringa standard utilizzata nel presente protocollo.

La scelta dell’olio è stato fondamentale per il successo di questo protocollo, come gli oli più pesanti (favorevoli in termini di prevenzione agglomerazione di microparticelle di gel dopo la raccolta) ha portato alla formazione di particelle molto meno coerente all’ugello che l’olio di silicone luce segnalato il protocollo. Supponiamo che questo ridotto riproducibilità è un risultato di bassa consistenza della siringa di pompaggio di oli pesanti, portando a più variabili di taglio al punto di miscelazione. Evitando l’aggregazione di microparticelle di gel nella beuta di raccolta è stata anche una sfida, specialmente immediatamente all’uscita dal dispositivo microfluidico al punto che in situ gelificazione non era completo e gran numero di disponibile reattivo funzionale i gruppi erano disponibili a formare ponti fra le particelle scontrantesi nella vasca di raccolta. Questa sfida è affrontata da: aumento della lunghezza del canale di uscita su chip microfluidici stesso, mantenendo le microparticelle di gel a flusso laminare per un lungo periodo di tempo per promuovere più completa gelificazione; aggiungendo i canali laterali dopo l’ugello alimentano più petrolio il chip e così meglio separare le microparticelle di gel in questo canale post-miscelazione senza influenzare i campi di taglio presso l’ugello stesso o il tasso di produzione delle particelle; e l’aggiunta di un mescolatore magnetico per la beuta di raccolta per evitare gel microparticella sedimentazione e mantenere una maggiore separazione media fra particelle adiacenti. Mentre molto lenti polimeri gelificanti sarebbero probabilmente migliorare la stabilità del dispositivo e ridurre al minimo i problemi con adescamento, tali sistemi sono stati osservati anche per aumentare significativamente il rischio di aggregazione di microparticelle di gel, come un numero maggiore di gruppi funzionali reattivi rimane non reagito (e quindi in grado di formare ponti inter-particella) su un periodo più lungo di tempo. Come tale, tempi di gelificazione nell’ordine di 15-60 s sembrano essere ottimale per questa tecnica: lento sufficiente per permettere di adescamento, ma abbastanza veloce per garantire più reattivi gruppi funzionali sono consumati prima le microparticelle di gel di uscita il canale di flusso laminare nella pallone di raccolta.

Infine, la rimozione dell’olio ai modelli è essenziale per garantire che le particelle risultanti mantengano che le proprietà smart previsto sulla base della composizione dei pre-polimeri aggiunto e consentire l’utilizzo di queste particelle in un contesto biomedico. Il pentano lavatrice procedura descritta era altamente efficace a questo proposito per la produzione di microparticelle di gel generale. Tuttavia, l’applicazione di questa tecnica in un contesto biomedico diretto (ad es., incapsulamento di cellule su chip) richiederebbe rivalutazione del presente protocollo. Abbiamo anche esplorato l’uso di olio di oliva, suggerita per essere che un olio più inerte nel contesto di contatto con le cellule³⁶, come il disperdente. Mentre la formazione di particelle era possibile, le popolazioni di microparticelle di gel erano significativamente più polidispersi quello che potrebbe essere raggiunto con olio minerale, almeno con l’attuale design di chip. Quindi, mentre il chip sembra essere adattabile a polimero sintetico e da polimeri naturali gel microparticella formazione³¹, un design modificato può essere richiesto per sfruttare questa tecnica più largamente attraverso tutte le possibili combinazioni di materiali.

Su scala nanometrica idrogeli via reattiva auto-assemblaggio
Nanogel sono state formate utilizzando una gamma molto ampia di condizioni, tra cui diverse concentrazioni di polimero semi di lavorazione (0,5-2% in peso), differenti rapporti di crosslinking:seed polimero (0.05-0.2), diverse temperature (40-80 ° C), diverse miscelazione velocità ( 200-800 giri/min) e riscaldamento diversa volte dopo l’aggiunta del reticolante polimero (2-60 min)²⁸. In termini di concentrazioni, le tendenze osservate sono generalmente come sarebbe preveduto, come le più alte concentrazioni di polimero semi portano a nanogel più grandi e più alti rapporti di polimero crosslinker:seed portano a nanogel con elevate densità di reticolazione e così più basso thermoresponsivities. Va sottolineato che aumentando il polimero semi concentrazione troppo alta infine conduce all’aggregazione al contrario di nanoaggregation, coerente con ciò che si osserva nel processo di precipitazione convenzionale del radicale libero per la formazione di massa Hydrogel nanogel³. Più brevi tempi di riscaldamento inoltre sono stati trovati per essere favorevole per formare più piccolo e più particelle monodisperse. Supponiamo che tenendo il nanoaggregati a volte più a lungo ad una temperatura sopra il LCST uno o entrambi i polimeri precursore aumenta la probabilità di aggregazione su nanogel collisione, con la maggiore idrofobicità del legame idrazone relativi a sia i precursore aldeide o idrazide maleica gruppi funzionali rendendo questa aggregazione più probabile come è aumentato il grado di reticolazione raggiunto. In definitiva, più brevi tempi di riscaldamento sono favorevoli da un punto di vista del processo, come una popolazione di nanogel monodispersi può essere formata in meno di 2 min dopo l’aggiunta di polimero reticolante; 10 min è stato trovato per essere il più lungo tempo che potrebbe produrre costantemente monodispersi nanogel consentendo anche per la produzione di più altamente reticolato nanogel. È interessante notare che, il metodo è notevolmente insensibile alla miscelazione, con dimensioni quasi identiche delle particelle e distribuzioni di dimensione delle particelle derivanti dalla miscelazione a velocità diverse o persino riducendo il processo ai volumi più grandi. Mentre inizialmente sorpresi da questo risultato, è probabile che parla per il ruolo principale della termodinamica nella regolazione della produzione di nanogel.

Per raggiungere polidispersità basso, la stabilità colloidale e il grado di idratazione della nanoaggregati sembrano essere le variabili chiave. Ad esempio, nanoaggregati preparati utilizzando i polimeri funzionalizzati idrazide maleica più idrofilici come il seme in contrasto con i polimeri funzionalizzati aldeide meno idrofilici portano a nanogel con polidispersità significativamente più basso. La differenza tra la temperatura del complessivo sperimentale e il LCST del polimero semi è anche critica. Operando ad una temperatura appena sopra il polimero semi LCST ((T-LCST) < 5 ° C) offre la più alta probabilità di formazione di nanogel monodisperse; di funzionamento ben di sopra il LCST crea più nanoaggregati idrofobo e compresso che è più probabile a aggregazione e meno probabilità di crosslink, pur operando sotto i risultati di LCST in un polimero di seme relativamente non-compatto che non può essere efficacemente o riproducibile reticolato. Per la migliore previsione della particella monodispersity, consigliamo innanzitutto eseguire una scansione di UV/vis per misurare l'insorgenza LCST del polimero semi e successivamente eseguire l'auto-assemblaggio processo ad una temperatura di 1-2 ° C sopra quella LCST.

Si noti che nanogel prodotta utilizzando questo metodo potrebbe essere liofilizzato e ridisperse senza alcun cambiamento nella stabilità colloidale, spesso non è possibile per strutture auto-assemblate e a nostro avviso attribuibile al nostro metodo di stabilizzazione di reticolazione. Prevediamo inoltre che solo il polimero di seme deve essere Hydrogel per questo metodo di lavoro; utilizzo di cross-linking polimeri che sono non-responsivi o reattivo ad altri stimoli può ampliare ulteriormente l’applicabilità finale di questa tecnica. Infine, poiché la miscelazione dei due polimeri reattivi precursore è in questo caso passivo al contrario attivo, tempo di gelificazione è molto meno importante in termini di controllo di processo rispetto alle altre strategie di fabbricazione descritto. Tuttavia, anche in questa tecnica, mantenendo il tempo di reticolazione totale < 30 min è auspicabile per ridurre al minimo il rischio di aggregazione delle particelle.

Nanofibrous idrogel tramite elettrofilatura reattiva
Controllare il tempo di gelificazione dei pre-polimeri reattivi nuovamente è essenziale per il successo della produzione di nanofibra di gel. In particolare, circa il tempo di permanenza dei polimeri precursore nel miscelatore statico (controllata cambiando la portata della soluzione da siringa doppia canna nonché la lunghezza e la tortuosità del miscelatore statico) di corrispondenza con la gelificazione di massa tempo dei polimeri precursore è essenziale sia per preservare la rotatività, nonché assicurare efficace reticolazione delle fibre del filato tra l’ago e il collettore. Gelificazione più veloce porta allo sviluppo del cono di Taylor inefficace e così povero rotatività, mentre più lento gelificazione risultati in una soluzione acquosa invece di un gel che colpisce il collettore, con conseguente diffusione e la formazione finale di un film sottile di gel invece di nanofibre. Lavorare in tempi di permanenza leggermente di sotto del tempo di gelificazione di massa è stato trovato per essere efficace (e infatti preferibile per ridurre il rischio di intasamento dell’ago) poiché l’evaporazione dell’acqua come la soluzione è filata efficacemente si concentra i polimeri di precursore nella streaming e così accelera la cinetica di gelificazione durante il processo di filatura. In questa stessa ottica, operanti a distanze superiori di ago-a-collector (> 10 cm) è generalmente favorevole in questo processo, come distanze più brevi riducono il tempo disponibile per l’evaporazione dell’acqua e quindi richiedono più rigorose di controllo sopra il rapporto tra tempo di permanenza e tempo di gelificazione al fine di preservare un prodotto di nanofibrous.

Si noti che l’uso di PEO (o un altro elettrofilate polimero ad alto peso molecolare e facilmente) è essenziale in questo protocollo per promuovere la formazione di nanofibra, come oligomeri POEGMA brevi e altamente ramificati da solo non riesce a raggiungere un adeguato grado di entanglement per indurre elettrofilatura; invece, electrospray risultati affatto testate per formulazioni di sola POEGMA (anche se questo può anche avere applicazioni per rendere le particelle di gel degradabile utilizzando questa chimica stessa) dalle condizioni di processo. Per mantenere una morfologia completamente nanofibrous è necessaria una concentrazione minima di PEO del 1% in peso (peso molecolare di 1 MDa). Si noti che il PEO può essere rimosso dalle fibre seguendo una semplice procedura di immersione (acqua deionizzata, 24 h) senza interrompere l’integrità della rete nanofibrous; in questo modo, PEO agisce più come un aiuto di elettrofilatura transitoria che un componente essenziale del prodotto finale nanofibrous. Notare inoltre che vari tipi di collezionisti, tra cui foglio di alluminio semplice (per creare gli idrogel sottile strato che possono delaminare dal collettore all’ammollo) come pure un disco rotante in alluminio (per creare più spessore impalcature) possono essere utilizzati in combinazione con questo stesso tecnica, fornito le altre variabili di processo controllo il tasso di gelificazione, il tasso di elettrofilatura e il tasso di evaporazione dell’acqua durante elettrofilatura rimangono inalterate.

È interessante notare che, a seconda del metodo utilizzato per preparare le diverse morfologie, sono state osservate differenze significative nei tempi degradazione degli idrogeli preparati con lo stessa precursori di idrogel. Ad esempio, POEGMA nanofibrous idrogeli degradano più lentamente di idrogeli POEGMA di massa con la stessa composizione nonostante la loro superficie significativamente più alto e così l’accesso all’acqua per idrolizzare i legami idrazone. Ci relazioniamo queste differenze per i contrasti inerente tra i protocolli descritti in termini di geometria di miscelazione i polimeri di precursore, che possono portare a impurita ‘ interna in gel e/o morfologie che sono significativamente differenti e/o la in situ concentrazione di precursori di polimero sulla stessa scala di tempo come gelificazione, particolarmente rilevante in elettrofilatura a causa dell’evaporazione dell’acqua simultanea e osservato in questo processo di reticolazione. Mentre questo può complicare un po’ la scelta dei polimeri precursore se un polimero è mirato per l’uso in ogni protocollo, può anche offrire un’opportunità tecnica in termini di fabbricazione idrogel con una composizione chimica ma molto differenti proprietà fisiche.

Nel complesso, i metodi descritti forniscono una strategia per fabbricare degradabile (o almeno per via renale azzerabili) analoghi di polimeri Hydrogel su più scale di lunghezza (massa, micro e nano) e con diversi tipi di strutture interne (particelle o fibre). Tali protocolli di affrontare i principali ostacoli alla traduzione successo dei materiali preparati convenzionalmente Hydrogel sintetico al campo biomedico: iniettabilità e degradabilità. Stiamo continuando a esplorare l’applicazione di tali materiali in sia di farmaci e applicazioni che vanno dalla fisica come destinazione di cancri, di ingegneria tissutale il trasporto di farmaci attraverso la barriera ematomeningea, la consegna terapeutica delle proteine a parte posteriore dell’occhio, la crescita direzionale dei tessuti e l’adesione termoreversibile e differenziazione delle cellule, tra le altre applicazioni.