Fabricating Degradable Thermoresponsive Hydrogels on Multiple Length Scales via Reactive Extrusion, Microfluidics, Self-assembly, and Electrospinning

Daryl Sivakumaran; Emilia Bakaic; Scott B. Campbell; Fei Xu; Eva Mueller; Todd Hoare

doi:10.3791/54502

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Bioingegneria

Herstellung von abbaubaren Thermoresponsive Hydrogele auf mehreren Längenskalen über reaktive Extrusion, Mikrofluidik, Selbstmontage und Elektrospinnen

Published: April 16, 2018

doi:

10.3791/54502

Daryl Sivakumaran¹, Emilia Bakaic¹, Scott B. Campbell¹, Fei Xu¹, Eva Mueller¹, Todd Hoare¹

¹Department of Chemical Engineering,McMaster University

Summary

Protokolle werden für die Herstellung von abbaubaren Thermoresponsive Hydrogele basierend auf Hydrazone Vernetzung von Polymeren Oligomere auf der Schüttgut-Skala, Microscale, und nanoskaligen, letztere für die Zubereitung von Gel-Nanopartikeln und Nanofasern beschrieben.

Abstract

Während verschiedene intelligente Materialien für eine Vielzahl von biomedizinischen Anwendungen (z. B.Drug-Delivery, Gewebetechnik, Bioimaging, etc.) untersucht wurden, wurde ihre ultimative klinische Anwendung durch den Mangel an biologisch relevante behindert Abbau für die meisten intelligenten Materialien beobachtet. Dies gilt insbesondere für Temperatur-responsive Hydrogele, die fast einheitlich auf Polymeren basieren, die funktionell nicht abbaubar sind (z. B.poly(N-isopropylacrylamide) (PNIPAM) oder Poly (oligoethy-Glykol Methacrylat) (POEGMA) ). Als solche, um das Potenzial der Thermoresponsive Hydrogele auf die Herausforderungen der ferngesteuerten oder Stoffwechsel reguliert Drug-Delivery effektiv zu übersetzen, Zell-Gerüste mit einstellbaren Zellmaterial Interaktionen, Theranostik Materialien mit dem potential für Bildgebung und Drug-Delivery, und andere solche Anwendungen ist eine Methode erforderlich, die Hydrogele (wenn nicht vollständig abbaubar) zumindest in der Lage, die renale Clearance nach der geforderte Lebensdauer des Materials zu rendern. Zu diesem Zweck beschreibt dieses Protokoll die Vorbereitung der hydrolytically abbaubar Hydrazone-vernetzte Hydrogele auf mehreren Längenskalen basierend auf die Reaktion zwischen hydrazid und Aldehyd funktionalisiert PNIPAM oder POEGMA Oligomere mit molekularen Gewichte unterhalb der renale Filtration. Insbesondere Methoden, abbaubaren Thermoresponsive Masse Hydrogele (über ein doppeltes Federhaus Spritze Technik), fabrizieren Hydrogel-Partikel (auf beide die Microscale durch den Einsatz einer Mikrofluidik Plattform gleichzeitige mischen und Emulgierung der Vorläufer Polymere und Nanobereich durch den Einsatz einer thermisch angetriebenen Selbstorganisation und Vernetzung Methode), und Hydrogel Nanofasern (mit einer reaktiven Elektrospinnen Strategie) werden beschrieben. In jedem Fall Hydrogele mit Temperatur-responsive Eigenschaften ähnlich denen erreicht über konventionelle radikalische Vernetzung Prozesse erreicht werden, aber die Hydrazone vernetzte Netzwerk kann im Laufe der Zeit, wieder die Oligomere form abgebaut werden Vorläufer-Polymere und Freigabe aktivieren. So erwarten wir, dass diese Methoden (die allgemein angewandte zu jedem synthetische wasserlösliche Polymer werden, nicht nur intelligente Materialien) einfacher Übersetzung der intelligente Kunststoffe in klinische Anwendungen ermöglichen werden.

Introduction

Intelligente Materialien haben erhebliche Aufmerksamkeit wegen ihres Potenzials für reversible “on Demand” Antworten auf externe und/oder ökologische Signale gezogen. Temperatur auf eine geschlechtergerechte Materialien stießen besonders interessant durch ihre untere kritische Temperatur (LCST) lösungsverhalten, was Temperatur-gesteuerte Niederschlag bei Temperaturen T > LCST¹^,². Im Rahmen der Thermoresponsive Hydrogele, manifestiert sich diese untere kritische Temperatur lösungsverhalten durch reversible Schwellung/de-swelling Ereignisse, die Temperatur-abstimmbaren Masse Größen führen (größere t < LCST)³, Porengrößen (größer bei T < LCST)⁴und Grenzflächen Eigenschaften (mehr hydrophile t < LCST)⁵. Solche Übergänge bei der Medikamentenabgabe weit verbreitet angewendet wurden (für externe oder ökologisch triggerbare Drug release⁴^,⁶^,⁷), Engineering und Zelle Gewebekultur (für Thermoreversible Zelladhäsion / Delamination⁸^,⁹^,¹⁰), Trennungen (für schaltbare Membran Porositäten und Durchlässigkeiten oder thermisch verwertbare diagnostische unterstützt¹¹^,¹²^, ( ¹³), mikrofluidischen verarbeitet (für ein-/ Ventile reguliert Durchfluss¹⁴^,¹⁵), und rheologische Modifizierer (für Temperatur-abstimmbaren Viskositäten¹⁶). Die am häufigsten untersuchte Thermoresponsive Hydrogele auf poly(N-isopropylacrylamide) (PNIPAM)^{17 basieren}, obwohl erhebliche (und zunehmend) Arbeit auch auf Poly (oligoethy-Glykol Methacrylat) durchgeführt wurde (POEGMA)² ^,¹⁸ und poly(vinylcaprolactam) (PVCL)¹⁹^,²⁰. POEGMA hat den letzten Interesse angesichts seiner erwarteten verbesserte Biokompatibilität²¹^,²²und seine einfache Melodie LCST Verhalten, welche linear vorhersehbaren Mischungen von Monomeren mit unterschiedlicher Anzahl von angezogen. Ethylen oxid wiederholen Einheiten in ihren Seitenketten verändern die LCST von ~ 20 ° C bis > 90 ° C²^,²³. Aber jedes dieser Polymere wird durch radikalische Polymerisation vorbereitet und enthält somit eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Rückgrat, erheblich zu begrenzen, den potenziellen Nutzen und Übersetzbarkeit von solche Polymere im Rahmen der biomedizinischen Anwendungen, bei denen Abbau (oder zumindest die Kapazitäten für die Abfertigung durch renale Filtration) ist in der Regel eine Voraussetzung.

In Reaktion auf diese Einschränkung, wir haben vor kurzem berichtete ausführlich über die Anwendung der Hydrazone Chemie (i.e., die Reaktion zwischen hydrazid und Aldehyd funktionalisiert Pre-Polymere) abbaubar Analoga von Thermoresponsive vorbereiten Hydrogele²⁴^,²⁵^,²⁶^,²⁷^,²⁸^,²⁹. Die schnelle und reversible Reaktion zwischen hydrazid und Aldehyd-Gruppen beim Mischen der Vorläufer der funktionalisierten Polymere³⁰ ermöglicht sowohl in Situ Gelierung (facile Injektion dieser Materialien ohne die Notwendigkeit für chirurgische Implantation oder jede Art von externen Polymerisation Reiz wie UV-Bestrahlung oder chemischer Einleitung) sowie hydrolytische Abbau des Netzes mit einer Rate, die durch die Chemie und die Dichte der Vernetzung Seiten gesteuert. Darüber hinaus beeinträchtigt durch die Beibehaltung des Molekulargewichts des Pre-Polymere verwendet, um die Hydrogele unterhalb der renale Filtration vorbereiten, Hydrogele gemacht mit diesem Ansatz zurück in die Oligomere Vorläufer-Polymere, die aus dem Körper^{25 gelöscht werden können} ^,²⁷^,²⁸. Gepaart mit der niedrigen Zytotoxizität und geringen entzündlichen Gewebe Reaktion induziert durch diese Materialien²⁵^,²⁶^,²⁷, bietet dieser Ansatz eine potenziell übersetzbare Methode für den Einsatz von thermoresponsive intelligente Hydrogele in der Medizin, insbesondere dann, wenn gut kontrollierten abbaubar Analoga von solchen Hydrogele auf allen Längenskalen (Bulk, Mikro und Nano) hergestellt werden können.

In diesem Protokoll beschreiben wir Methoden zur Herstellung von synthetischen Thermoresponsive Pre-Polymere funktionalisiert mit kontrollierten hydrazid und Aldehyd-Gruppen sowie Methoden anzuwenden diese Polymere Hydrogele mit klar definierten Abmessungen erstellen verschiedenen Längenskalen. Insbesondere diese Handschrift beschreibt vier unterschiedliche Ansätze haben wir entwickelt um die Vermischung von reaktiven hydrazid und Aldehyd funktionalisiert Pre-Polymeren zu steuern und damit vernetzen Thermoresponsive Hydrogel mit klar definierten Geometrien und Morphologien:

Abbaubare Bulk Hydrogele mit definierten Größen erstellen, eine Template-Strategie wird beschrieben durch die Pre-reaktive Polymere in separaten Fässern einer Doppel-Fass-Spritze, an dessen Ausgang mit einem statischen Mischer ausgestattet und anschließend in koextrudiert geladen werden eine Silikonform mit den gewünschten Hydrogel Form und Abmessungen²¹^,²⁷ (Abbildung 1).

Abbildung 1 : Schematische Bulk Hydrogel Formation. Hydrazid und Aldehyd funktionalisiert Polymerlösungen (in Wasser oder wässrigen Puffer) werden in separaten Fässern ein doppeltes Federhaus Spritze geladen und dann koextrudiert durch einen statischen Mischer in einem zylindrischen Silikonform. Rapid in Situ Gelierung beim Mischen Formen einer Hydrazone vernetzt Hydrogel, welche ist freistehend (sobald der Schimmel entfernt ist) innerhalb von Sekunden bis Minuten, je nach Konzentration und funktionelle Gruppe Dichte der Vorläufer Polymere. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Um abbaubaren Gel Partikel auf der Micron-Skala zu erstellen, ist eine reaktive Mikrofluidik-Methode beschrieben, in welcher Vorläufer Polymerlösungen gleichzeitig werden gemischt und emulgiert, verwenden eine weiche Lithographie-templated Mikrofluidik-Chip-Design, so dass die Bildung von gemischten reaktive Polymer Tröpfchen in Situ zu Form Gel Mikropartikel mit vorgefertigten Größen durch die Emulsion (Abbildung 2)³¹^,³², gel.

Abbildung 2 : Schaltplan der Gelbildung Mikropartikel über reaktive Mikrofluidik. (A, B) Hydrazid und Aldehyd funktionalisiert Polymerlösungen (in Wasser oder wässrigen Puffer) werden durch Spritzenpumpe in separaten Vorratsbehälter gespeist, die stromabwärts über eine Zick-Zack-Reihe von Kanälen entwickelt, um einem Druckgradienten verhindert Rückfluss verbunden sind. Die Polymere sind dann kurz vor von Paraffin-Öl fließt von beiden Seiten (auch getrieben durch eine Spritzenpumpe) geschoren werden gemischt und gezwungen durch eine Düse, wodurch Strömung mit Schwerpunkt Produktion von wässrigen (Polymerlösung) Tröpfchen in einer kontinuierlichen Paraffin-Öl-Phase (siehe (B) zur Veranschaulichung der Düse und des Entstehungsprozesses Tröpfchen). Eine zusätzliche zwei Paraffin Öl Buchten sind nach der Düse auf weitere Separate positioniert sind die Tröpfchen in den Sammelkanal vollständig Gelierung vor Partikelabscheidung aus Laminar-Flow ermöglicht nach dem daraus resultierenden Mikropartikel Gele in einem magnetisch gerührt Becher gesammelt; (C) Bild der Tröpfchen Generierung an der Düse (Beachten Sie, dass hydrazid Polymer ist beschriftet als blau mischen veranschaulichen)

Abbaubaren Gel Partikel im Nanomaßstab, eine thermisch angetriebene reaktive Selbstmontage Methode beschrieben wird, in dem eine Lösung eines reaktiven Vorläufer Polymere (“Samen” Polymer) erhitzt wird, über seine LCST eine stabile Nanoaggregate zu bilden, das Erstellen anschließend vernetzt durch die Zugabe von komplementären reaktiven Vorläufer Polymer (die “Vernetzung” Polymer); die daraus resultierende Hydrazone vernetzt Nanogel hat eine Größe Vorlagen direkt von der Nanoaggregate (Abbildung 3)²⁸.

Abbildung 3 : Schematische Nanogel Formation über thermisch angetriebene reaktive Selbstmontage. Eine wässrige Lösung enthält (Thermoresponsive) hydrazid funktionalisiert Polymer ist über seine unteren kritischen Lösung Temperatur erstelle ich eine stabile Uncrosslinked Nanoaggregate erhitzt. Folgend ein Aldehyd funktionalisiert Polymer wird Nanoaggregate über Hydrazone Anleihe Bildung Crosslink hinzugefügt und somit stabilisieren das Nanogel Teilchen beim Abkühlen unter den LCST. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Um abbaubare Nanofasern zu erstellen, ist eine reaktive Elektrospinnen Technik beschrieben, in dem eine doppeltes Federhaus Spritze mit einem statischen Mischer an die Steckdose (wie verwendet für die Herstellung von Bulk-Hydrogele) ausgestattet mit einer standard Elektrospinnen-Plattform (Abbildung 4 verbunden ist )³³.

Abbildung 4 : Schematische Hydrogel Nanofaser Formation über reaktive Elektrospinnen. Eine doppeltes Federhaus Spritze mit einem statischen Mischer (geladen wie für Schüttgut Hydrogele beschrieben aber auch einen Bruchteil der hochmolekularen Poly(ethylene oxide) als Auslegungshilfe Elektrospinnen) ist mit der Nadel am Ende der Spritze verbunden über eine Spritzenpumpe montiert. um eine Hochspannungsversorgung. Hydrazone Vernetzung tritt während der Faser Spinnerei Prozess, so dass wenn der Stream den Sammler (Alufolie oder einer rotierenden Aluminium-Scheibe) trifft die Morphologie der Nanofibrous erhalten bleibt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Die Anwendung solcher Methoden für die Erstellung von abbaubaren smart Hydrogel Netzwerke zeigt sich in dieses Protokoll mit entweder PNIPAM oder POEGMA als das Polymer von Interesse; jedoch die grundlegenden Ansätze beschrieben, wasserlöslichen Polymeren, wobei entsprechende Anpassungen für die Viskosität übersetzt werden können und (für die Selbstmontage Nanogel Herstellungsverfahren) die Stabilität des Pre-Polymers bei der Bildung der Samens Nanoaggregate.

Protocol

1. Synthese von Polymeren Hydrazid funktionalisiert Hinweis: Das folgende Rezept ist für das PNIPAM-mimetischen Thermoresponsive POEGMA Vorläufer Polymer (PO10) mit 30 Mol % hydrazid Funktionalisierung versehen. PNIPAM und POEGMA Vorläufer Polymere mit verschiedenen Phase übergangstemperaturen zubereitet werden, diese gleichen allgemeinen Methode aber ändern die Art und das Verhältnis der Kern-Monomere verwendet (siehe Abschnitt 1.2 für Modifikationen für verschiedene POEGMA Polymeren)21 , 25 , 27. Wiegen Sie 37 mg 2,2′-azobis(2-methylpropionate) (AIBMe, Initiator), 3,1 g Diäthylenglykol Glykol Methacrylat (M(EO)2MA), 0,9 g Oligoethyleneglycol Methacrylat (OEGMA475, 475 g/Mol n = 7-8 Ethylen oxid wiederholen Einheiten), 523 µL Acrylsäure (AA, Comonomer) und 7,5 µL der Thiolglycolic Säure (TGA, Kette-Transfer-Agent) in eine 20 mL Glasflasche funkeln. Verwenden Sie für PO0 (Raumtemperatur Übergangstemperatur POEGMA) 4,0 g M(EO)2MA (keine OEGMA475). Verwenden Sie für PO100 (keine Übergangstemperatur POEGMA) 4,0 g OEGMA475 (keine M(EO)2MA).Hinweis: Zwischenphase übergangstemperaturen lässt sich basierend auf der Verwendung von zwischen-Mischungen aus M(EO)2MA und OEGMA475, laut Lutz Et al. 23 Alle Reagenzien in Dioxan (5 mL/g total Monomer) in einem Rundboden-Kolben mit einem oder mehreren Hälsen auflösen. Die Reaktion mit Stickstoff (UHP-Klasse) Strom für 30 min zu bereinigen. Sobald gelöscht, legen Sie die Flasche in einem vorgewärmten Ölbad auf 75 ° C für 4 h unter Stickstoff und 400 u/min magnetische rühren gehalten. Entfernen Sie nach 4 h das Lösungsmittel mit einem drehverdampfer auf 50 ° C und 200 u/min eingestellt. Das resultierende Polymer-Produkt in 150 mL entionisiertem Wasser auflösen. Die Anzahl der AA Rückstände in das Polymer eingebaut Adipinsäure Säure Dihydrizide (ADH) an eine fünffache molaren Überschuss hinzufügen (in diesem Beispiel AA umfasst 29 mol% der Monomer-Einheiten in den Polymeren hergestellt, gemäß Conductometric Titration). Stellen Sie den pH-Wert der Lösung auf pH 4,75 mit 0,1 M HCl. Sobald der pH-Wert stabilisiert hat, fügen Sie N-(3-dimethylaminopropyl) -N’-Ethylcarbodiimide (EDC) zu einem 5-fold molaren Überschuß auf die Anzahl der AA Rückstände vorhanden). Pflegen Sie die Reaktion pH 4,75 mit tropfenweise Zugabe von 0,1 M HCl über 4 h. Lassen Sie die Reaktion über Nacht gerührt. Gießen Sie die Produktlösung in drei ~ 30 cm lange Dialyse Röhren (3500 Da Molekulargewicht Abschaltung, 1 Zoll Dicke), verwenden einen Trichter um verschütten zu minimieren. Verwenden Sie eine Prise Klemme, um der Boden des Röhrchens vor der Befüllung zu schließen, durch Falten ein klein (~ 2 cm) Segment des Rohres, die Klammer-Integrität zu verbessern; an der Spitze (drücken, um Luftblasen zu entfernen) wiederholen wenn Füllung beendet ist. Legen Sie die Röhren im Inneren ein 100-fold überschüssige Menge entionisiertem Wasser und lassen Sie für mindestens 6 h, vollständig ersetzen das Wasser über sechs Zyklen der Dialyse, gewünschte Reinheit zu erreichen. Lyophilize der dialysierten Probe um eine endgültige getrocknete Polymer-Produkt zu erhalten. 2. Synthese von Polymeren Aldehyd funktionalisiert Synthese von Aldehyd-Vorläufer Monomer N-(2,2-Dimethoxyethyl) Methacrylat (DMEMA) Statt 200 mL einer 20 % w/V-NaOH-Lösung in einem 500 mL 3 Hals Rundboden Kolben. Die Lösung im Eisbad abkühlen und eine Temperatur von 0 ° C mit Eis während der Reaktion zu erhalten. Die abgekühlte NaOH Lösung 50 mL Aminoacetyl Aldehyd Dimethyl Acetal hinzufügen. Fügen Sie in 0,1 g des TEMPOS ((2,2,6,6-Tetramethylpiperidin-1-Yl) Oxyl) und rühren Sie bei 400 u/min mit einer magnetischen rühren bis das TEMPO komplett auflöst. Hinzugeben Sie Methacryloyl-Chlorid tropfenweise mit einer Bürette über 2 h 48 mL. Decken Sie nach 2 h den Reaktionsbehälter mit Alu-Folie und lassen Sie über Nacht gerührt. Das Produkt von 75 mL Petrolether in einem 1 L Trennung Trichter das Reaktionsprodukt hinzufügen, schütteln, Entgasung und verwerfen die oberste Schicht zu extrahieren. Wiederholen Sie Schritt 2.1.7 dreimal, indem die untere Schicht Produkt aus jeder Extraktionsschritt als Rohprodukt für den nächsten Zyklus der Extraktion. Entfernen Sie die letzte Schicht Bodenprodukt und Übertragung auf eine 100 mL-Becherglas. Hinzufügen von ~ 5 g Magnesiumsulfat (Mg2SO4), Becher mit Monomer bis “Schneekugel” Effekt beobachtet. Filtern Sie durch eine 100 mL Buchner Trichter Entfernen der Mg2SO4. Spülen Sie den Becher mit ~ 75 mL Tert-Butyl-Methyl Ether, Gießen die Spüllösung durch den Trichter jeweils zweimal. Das Produkt auf einem 500 mL Rundboden Kolben übertragen und verdunsten des Lösungsmittels ein drehverdampfer bei Raumtemperatur mit 200 u/min, das Endprodukt zu sammeln. Synthese von Polymeren Aldehyd funktionalisiertHinweis: Das folgende Rezept ist für das PNIPAM-mimetischen POEGMA Vorläufer Polymer (PO10) mit 30 Mol % Aldehyd Funktionalisierung versehen. PNIPAM und POEGMA Vorläufer Polymere mit verschiedenen Phase übergangstemperaturen zubereitet werden, mit der gleichen allgemeinen Methode aber ändern die Art und das Verhältnis der Kern-Monomere verwendet (siehe Abschnitt 1.2 für Modifikationen für verschiedene POEGMA Polymeren)21 , 25 , 27. Wiegen Sie 37 mg 2,2′-azobis(2-methylpropionate) (AIBMe), 3,10 g Diäthylenglykol Glykol Methacrylat M(EO)2MA, 0,1 g von Oligo Ethylenglykol Methacrylat (OEGMA475, 475 g/Mol, n = 7-8 Ethylen oxid wiederholen Einheiten), 1,30 g n-(2,2- Dimethoxyethyl) Acrylamid (DMEMA) und 7,5 µL der Thiolglycolic Säure (TGA) in eine 20 mL Glasflasche funkeln. Verwenden Sie für PO0 (Raumtemperatur Übergangstemperatur POEGMA) 4,0 g M(EO)2MA (keine OEGMA475). Verwenden Sie für PO100 (keine Übergangstemperatur POEGMA) 4,0 g OEGMA475 (keine M(EO)2MA).Hinweis: Zwischenphase übergangstemperaturen lässt sich basierend auf der Verwendung von zwischen-Mischungen aus M(EO)2MA und OEGMA475, laut Lutz Et Al. 23 Alle Reagenzien in Dioxan (5 mL/g total Monomer) in einem Rundboden-Kolben mit einem oder mehreren Hälsen auflösen. Die Reaktion mit Stickstoff (UHP-Klasse) Strom für 30 min zu bereinigen. Einmal gereinigt, gepflegt Ort Kolben in einem vorgewärmten Ölbad bei 75 ° C für 4 h unter Stickstoff und 400 u/min magnetische rühren. Entfernen Sie nach 4 h das Lösungsmittel mit einem drehverdampfer auf 50 ° C und 200 u/min eingestellt. Auflösen der resultierenden Polymer-Produkt in 100 mL entionisiertem H2O. 50 mL 1 M HCl in die aufgelöste Lösung und rühren unter magnetische rühren (400 u/min) für 24 h, voll und ganz die Acetal-Funktionalitäten in DMEMA hydrolyseneigung. Übertragen Sie nach Abschluss der Reaktion die Polymerlösung in Dialyse-Schläuche gemäß Schritt 1.13. Lyophilize der dialysierten Probe um eine endgültige getrocknete Polymer-Produkt zu erhalten. (3) Herstellung von Hydrazone vernetzt Bulk Hydrogele Lösen Sie auf, hydrazid und Aldehyd funktionalisiert Polymere separat in 10 mM Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) oder jeder gewünschten wässrigen Puffer Lösungen der gewünschten Konzentrationen zu schaffen.Hinweis: Masse-Konzentrationen zwischen 5-40 Gew.-% werden in der Regel verwendet, mit Gelierung bei niedrigeren Konzentrationen möglich, wenn höhere Funktionsgruppe Brüche auf Polymere vorhanden sind. Mit Hilfe einer einzigen Lauf-Spritze zu übertragen der Lösungen, laden jede Vorläufer Lösung (~ 1 mL) in separaten Fässer ein doppeltes Federhaus Spritze (2,5 mL Volumen, Verhältnis 1:1 Spritze) angebracht zu einem statischen Mischer (1.5″ Länge) und (optional) eine Spritze (in der Regel 18 G, 1.5″ Länge für in-vitro-Studien) und (optional) eine Spritze (in der Regel 18 G, 1.5″ Länge für in-vitro-Studien). Formen der gewünschten Dicke, Form und Durchmesser durch Lochung in eine Silikon-Gummiplatte vorzubereiten.Hinweis: In einem typischen Experiment dient ein standard-Punsch-Set, eine 7 mm Durchmesser zylindrischen Bohrung innerhalb einer 1/16″ dicken Silikon gummiblatt (Gesamtvolumen von Reservoir ~ 300 µL) zu schlagen. Berg die Silikonform auf einem Standardglas Mikroskop schieben, dass die Löcher in der Form gestanzt werden vollständig durch Glas gesichert. Eine 0,1 M HCl Waschen des Glases ist empfohlen aber nicht vor der Montage die Silikonform erforderlich. Co extrudieren Sie doppeltes Federhaus Spritze Inhalt durch den statischen Mischer komplett ausfüllen (oder leicht überfüllen, mit einem Meniskus an der Spitze) die Silikonform.Hinweis: Mehrere Proben können während eine Extrusion-Probe vorbereitet werden, vorausgesetzt die Gelierung Zeit auf der gleichen Größenordnung oder mehr als die gesamte Zeit erforderlich, um mehrere Formen zu füllen ist. Ein weiterer standard-Glas-Objektträger oben auf dem Schimmel und warten Sie die Gelierung zu vervollständigen.Hinweis: Die standard Rezepte beschrieben im Abschnitt Gel Synthese innerhalb < 1 Minute; langsamer Gelierung Zeiten (und damit längere Wartezeiten erforderlich) sind bei geringeren dichten in funktionelle Gruppe, niedrigere Konzentrationen von Polymer und/oder höhere Bruchteilen von OEGMA475 im Vergleich zu M(EO)2MA (für POEGMA Hydrogele) beobachtet. Entfernen Sie die obere Objektträger und mit einem Spatel, um Hydrogel aus der Silikon-Kautschuk-Form zu drücken. Heben Sie die Form von niedrigeren Objektträger Hydrogele für weitere Tests zu erholen. 4. Herstellung von Hydrazone vernetzt Gel Mikropartikel Herstellung von mikrofluidischen Chip Entwässern einen Silizium-Wafer (D = 76,2 mm, 380 µm Dicke, P-dotierte Orientierung) durch Erhitzen auf einer Herdplatte bei 200 ° C für 5 Minuten. Zentrieren des Wafers auf eine Spin Coater und Mantel eine ~ 100 µm dicke Schicht von SU-8 100 Fotolack durch die Anwendung von SU-8 ~ 7 mL widerstehen, Rampen der Spins speed bis zu 3000 u/min mit einer Rate von 500 u/min/s, und dann die Geschwindigkeit bei 3000 u/min für 30 Sekunden gedrückt. Backen Sie die Beschichtung bei 65 ° C für 10 Minuten vor und dann Soft-Backen der Beschichtung bei 95 ° C für 30 Minuten. Drucken einer Fotomaske auf eine Transparenz mit dem mikrofluidischen Muster definiert durch Abbildung 2A, derart, dass die transparenten Abschnitte das gewünschte Muster der polymerisierten Photolack-Schicht sind. Legen Sie den Fotolack beschichteten Silizium-Wafer und die Fotomaske in einem Mask Aligner und aussetzen den Wafer bis 365 nm-Licht für 95 s (6,5 W Belichtung Leistung). Backen Sie die gemusterten Wafer für 10 min bei 95 ° C zuerst indem du es auf einer Herdplatte bei 65 ° C und anschließend Heizung Heizplatte bis 95 ° C bei 10 ° C/min. Entfernen Sie die Wafer aus der Kochplatte und in einen 500-mL-Becherglas mit 100 mL SU-8 Entwickler für mindestens 10 min, wirbelnden Wafers langsam in die Lösung im gesamten nicht-exponierten Fotolack entfernen. Nach 10 min den gemusterten Wafer mit Isopropanol abspülen und Trocknen mit Luft. Lagern Sie die gemusterten Wafer an einem kühlen, trockenen lichtgeschützt bei Nichtgebrauch für weiche Lithographie Replik Formteil. Legen Sie die gemusterten mikrofluidischen Form in einer Petrischale. Lage ~ 10 mm Länge L/S 13 Silikonschlauch auf der ein- und Ausgänge des Chips. Gießen Sie ~ 10 mL Poly (Dimethyl Siloxan) (PDMS; vorbereitet durch das Mischen von Silikon-Elastomer-Basis und Silikon-Elastomer Curing Agent im Verhältnis 10:1) auf dem Chip, sorgfältig vermeiden unter Einbeziehung einer PDMS innerhalb der platzierten Silikonschlauch. Legen Sie die Petrischale in einer Vakuumkammer für ~ 10 min, beharren in und rund um die gemusterten Struktur während der Härtung Luftblasen zu entfernen. Heilen Sie die PDMS indem man die Petrischale mit den gemusterten Schimmel und ungehärtetem PDMS auf einer Herdplatte bei 85 ° C für ca. 2-3 h. Ziehen Sie vorsichtig aus der ausgehärteten PDMS aus dem gemusterten Siliziumwafer, weichen lithografische gemusterte PDMS Replik der mikrofluidischen Form verfügbar zu machen. Ort der gemusterten PDMS und einen Objektträger kopfüber in einem Hochleistungs-Plasma Reiniger mit einem Hauch zu ernähren. Wenden Sie das Plasma bei 200 mTorr und 45 W für 90 s, Bindung der PDMS auf den Objektträger und Erstellen des endgültige Mikrofluidik-Chips. Synthese von Gel Mikropartikel Bereiten Sie hydrazid funktionalisiert PNIPAM (PNIPAM-Hzd) durch NIPAM (4,5 g), Acrylsäure (0,5 g – 15 Mol % total Monomer), Thioglycolic Säure (TGA, 80 µL) und 2,2-Azobisisobutyric saure Dimethyl Ester (AIBME, 0,056 g) in 20 mL wasserfreiem Ethanol auflösen und anschließend folgende Schritte 1,4-1.14 die Synthese abgeschlossen, obwohl die Reaktionstemperatur auf 56 ° C im Schritt 1.5 ändern. Vorbereiten von Aldehyd funktionalisiert PNIPAM (PNIPAM-Ald) durch Auflösen von 2,2-Azobisisobutyric saure Dimethyl Ester (AIBME, 0,056 g), NIPAM (4 g) und n-(2,2-Dimethoxyethyl) Methacrylat (DMEMA, 0,95 g – 13,4 Mol % total Monomer), Thioglycolic Säure (TGA, 80 µL), 20 mL Ethanol und anschließend folgende Schritte 2.2.4-2.2.10 vervollständigen die Synthese, obwohl die Reaktionstemperatur auf 56 ° C ändert in Schritt 2.2.5. PNIPAM-Hzd und PNIPAM-Ald bei 6 Gew.-% in entionisiertem Wasser und laden Sie in separaten standard 5 mL Spritzen auflösen. 1 wt % nichtionische Tenside (z. B. Span 80) in schweren Paraffinöl auflösen und die Lösung in eine standard-60-mL-Spritze zu laden. Verbinden Sie die beiden Vorläufer Polymer Lösung Spritzen individuell mit zwei separate Polymer-zulaufkanäle auf der Mikrofluidik-Chip und die Paraffin-Öl-Lösung für Öl-Einlasskanal auf der Mikrofluidik-Chip über 1/32″ ID Silikon Schläuche (~ 30 cm Länge pro Einlass, ~ 45 cm Länge pro Ausgang). Mit zwei separate Spritze Infusionspumpen (eine für das Öl stromaufwärts, eine für das Öl nach der Düse hinzugefügt), liefern das Öl in den Chip mit einer Durchflussrate von 1,1 mL/h bis 5,5 mL/h ohne die Polymer-Strömung um den Chip prime und sicherzustellen, dass der Chip mangelfrei und operative erhalten (in der Regel über einen Zeitraum von 30 min). Mit einer separaten Infusionspumpe Spritze bringen Sie jeweils die wässrige Polymerlösungen auf dem Chip mit einer Durchflussrate von 0,03 mL/h. Nach einer ersten Stabilisierung um sicherzustellen, dass die Strömung equilibriert hat und einheitliche Partikel gebildet werden (30 min – 1 h) sammeln Sie sich die Partikel in einem magnetisch gerührt Rundboden-Kolben. Sammeln Sie die Partikel, bis alles Öl verbraucht (12-55 h, je nach Strömung) ist. Stoppen Sie die Spritzenpumpen zu und auf Wunsch sofort Pumpen Sie Wasser anstelle der Vorläufer Polymerlösungen durch den Chip zu reinigen. Jedoch die schnelle in-situ Gelierung dieser Materialien gegeben, wenn der Durchfluss gestoppt wird, empfiehlt es, einen neuen Chip für jede separate Experiment zu verwenden. Schalten Sie das magnetische rühren und lassen Sie das Gel Mikropartikel zu begleichen. Dekantieren Sie aus allen verfügbaren Paraffin-Öl mit einer Pipette. Um das restliche Paraffinöl zu entfernen, waschen Sie die Gel-Mikropartikel mit Pentan (angewendet bei einem Volumen von 10 mL für jeden 0,5 mL Mikropartikel Volumen), kräftig mischen die Emulsion für ~ 1 Minute erlauben die Gel-Mikropartikel für ~ 1-2 umzusiedeln Stunden und Dekantieren aus die verbleibende organische Phase mit einer Pipette. Mindestens 5 Mal zu wiederholen, um sicherzustellen, dass vollständige Paraffin Öl entfernt. Aufschwemmen der Gel-Mikropartikel in 10 mL entionisiertem Wasser in eine 20 mL Glasflasche funkeln und Säuberung der Durchstechflasche mit Stickstoff über Nacht um jede verbleibende Pentan zu entfernen. 5. Herstellung von Hydrazone vernetzt Nanogels Auflösen von Stammlösungen der PNIPAM-Hzd (1 w/v%) und PNIPAM-Ald (1 w/v%) in entionisiertem Wasser. Bereiten Sie PNIPAM-Hzd und PNIPAM-Ald vor, wie in den Abschnitten 4.2.1 und 4.2.2, beschrieben. Erhitzen Sie einen 5 mL Aliquot der PNIPAM-Hzd Vorratslösung zu 70˚C mit einem Ölbad unter magnetische rühren (350 u/min) in eine 20 mL Glasflasche funkeln.Hinweis: Die Lösung sollte undurchsichtig (d.h. die Temperatur übersteigt die niedrigere Temperatur der kritischen Lösung des PNIPAM-Hzd), aber keine sichtbaren Niederschlag gebildet werden sollte. Fügen Sie eine 0,25 mL Aliquot der PNIPAM-Ald (5-20 wt % der Masse des PNIPAM-Hzd in der Samen-Lösung vorhanden) drop-wise in die beheizten PNIPAM-Hzd-Lösung über einen Zeitraum von 5-10 s. Weiter, die die Lösung in das Funkeln für weitere 15 Minuten, nach dem entfernen die Probe aus dem Ölbad Fläschchen mischen und das Produkt über Nacht auf Raumtemperatur abkühlen lassen. Dialyse die resultierende Nanogels über 6 x 6 Stunden Zyklen (mit einem 3500 MWCO Dialysemembran kDa) gegen deionisiertes Wasser, unvernetzten Polymeren zu entfernen. Falls gewünscht, lyophilize für die Lagerung. 6. Herstellung von Hydrazone vernetzt Nanofasern Bereiten Sie hydrazid funktionalisiert POEGMA (POEGMA-Hzd) durch Auflösen von 37 mg Dimethyl 2,2′-azobis(2-methylpropionate) (AIBMe), 4,0 g Oligoethyleneglycol Methacrylat (OEGMA475, 475 g/Mol, n = 7-8 Ethylen oxid wiederholen Einheiten), und 0,25 g Acrylsäure (AA) in 20 mL Dioxan und folgende Schritte 1.3-1.14 um die Synthese zu vervollständigen. Vorbereiten von Aldehyd funktionalisiert POEGMA (POEGMA-Ald) durch Auflösen von 50 mg Dimethyl 2,2′-azobis(2-methylpropionate) (AIBMe), 4,0 g Oligoethyleneglycol Methacrylat (OEGMA475, 475 g/Mol, n = 7-8 Ethylen oxid wiederholen Einheiten), und 0,60 g n-(2,2- Dimethoxyethyl) Methacrylat (DMEMA) in 20 mL Dioxan und folgende Schritte 2.2.3-2.2.10 um die Synthese zu vervollständigen. POEGMA-Hzd auflösen (15 Gew.-%) und POEGMA-Ald (15 Gew.-%) in separaten deionisiertes Wasserlösungen. Poly (Ethylenoxid) auflösen (PEO, Mw= 600 x 103 g/Mol, 5 Gew.-%) in entionisiertem Wasser. Mix 1 mL der PEO Lösung mit jedem reaktiven POEGMA Lösung in Schritt 6.3 endgültige Vorläufer Lösungen von 7,5 wt % POEGMA Vorläufer Polymer und 2,5 Gew.-% PEO vorbereitet. Laden Sie die beiden Lösungen in separaten Fässern der gleichen Doppel-Fass-Spritze beschrieben in Abschnitt 3 (auch mit der 1.5″ Statische Mischer) und montieren Sie doppeltes Federhaus Spritze auf eine Infusionspumpe Spritze. Die Doppel-Fass-Spritze ein statischer Mischer und eine stumpfe Spitze 18G Nadel zuordnen. Verbinden Sie eine Hochspannungs-Stromversorgung mit der stumpfen Spitze Nadel, geerdet am Kollektor.Hinweis: Sammler bestehen entweder aus einem Quadrat 10 x 10 mm aus Aluminium-Folie oder eine ~ 10 mm Durchmesser Aluminium-Scheibe mit einer Rate von 200 u/min drehen, montiert beide senkrecht auf die Nadel in einem Abstand von 10 cm vom Ende der Nadel. Starten Sie die Spritzenpumpe mit einer Rate von 0,48 mL/h, und schalten Sie gleichzeitig eine hohe Spannung von 8,5 kV, die Elektrospinnen durchzuführen und Nanofasern zu erstellen. Weiter Elektrospinnen wie gewünscht zu Gerüste in verschiedenen Stärken oder bis die Einlass-Lösungen erschöpft sind. Um die PEO Elektrospinnen Beihilfe zu entfernen, genießen Sie die gesammelten Gerüste für 24 h in entionisiertem Wasser.

Representative Results

Bulk Hydrogele aus ein doppeltes Federhaus Spritze in eine Silikonform extrudiert entsprechen die Abmessungen des Werkzeugs und freistehende werden bei der Entformung; Gelbildung tritt typischerweise Sekunden bis Minuten folgende Koextrusion je nach polymervorläufer verwendet. Typische Charakterisierung über Schwellungen (gravimetrisch mit einer Zelle Kultur einfügen leicht Hydrogel aus der Schwellung Projektmappe entfernen gemessen), Thermoresponsivity (gemessen mit der gleichen Technik aber Radfahren die Inkubationstemperatur oben und unterhalb der Phase Übergangstemperatur) zeigt Abbau (gemessen mit der gleichen Technik aber über längere Zeit), und Scherung oder Druckfestigkeit Elastizitätsmodul (gemessen mit 2 mm dick und 7 mm Durchmesser geformt Proben) die Einstellbarkeit der Hydrogel Antworten abhängig von der Chemie des Polymers (insbesondere für POEGMA, das Verhältnis von kurz, um lange Kette OEGMA Monomere verwendet, um das Hydrogel vorbereiten), Vorläufer der Maulwurf Bruchteil der Funktionsgruppen auf die Vorläufer-Polymere und die Konzentration der Vorläufer Polymere (Abbildung 5)27. Mikrofluidik führt zur Bildung von klar definierten Gel Mikropartikel auf der Größenskala von 25-100 µm, mit der Größe steuerbare basierend auf die Fördermengen von Öl und/oder die kombinierte wässrige Polymer Phasen (Abb. 6A)31. Heiße Phase optische Mikroskopie bestätigt, dass die Gel-Mikropartikel den Thermoresponsive Charakter des Bulk-Hydrogele, zeigt reversible temperaturabhängige Schwellung-deswelling mit nur einer leichten Hysterese auf Zyklus 1 (zuzurechnen erhalten irreversible Wasserstoffbrückenbindung Formation zwischen benachbarten amidgruppen im zusammengeschobenen Zustand34) entsprechen, die in loser Schüttung PNIPAM Hydrogele (Abb. 6 b)32beobachtet. Darüber hinaus verschlechtern Gel Mikropartikel zurück in ihre Oligomere Vorläufer im Laufe der Zeit die renale Clearance (Abbildung 6)32. Selbstmontage angetrieben durch die Nanoaggregation eines hydrazid funktionalisiert PNIPAM Polymers in einer beheizten Lösung gefolgt durch Vernetzung mit einem Aldehyd funktionalisiert PNIPAM Polymer ergibt sich in hohem Grade Monodisperse Nanogels (Polydispersität < 0,1) auf die Größenbereich von 180-300 nm, abhängig von den Prozessbedingungen verwendet (Abb. 7A)28. Die Nanogels behalten das typische Thermoresponsive Verhalten der konventionellen freie Radikale vernetzt PNIPAM Nanogels mit niedriger Grad der thermischen deswelling beobachtet, wie mehr Vernetzung Polymer (Abb. 7B) hinzugefügt wurde. Die Nanogels können lyophilisiert und dispergiert ohne eine Änderung der Partikelgröße (Abb. 7C) und im Lauf der Zeit über Hydrolyse zu den Oligomeren Vorläufer Polymere verwendet, um die Nanogels (Abbildung 7D) formulieren Re-form verschlechtern. Reaktive Elektrospinnen schafft eine Nanofibrous Hydrogel Struktur (Abbildung 8A), mit Nanofaser-Durchmesser in der Größenordnung von ~ 300 nm erreichbar ohne sichtbare entstehen Partikel33präsentieren. Führt schnelle Hydratation (etwa zwei Größenordnungen schneller als mit einem Masse-Gel von der gleichen Zusammensetzung, Abbildung 8Berreicht) aber unterhält die Nanofibrous Morphologie über 8-10 Wochen vor dem POEGMA-basierte Nanofasern in Wasser einweichen hydrolytische Abbau unter physiologischen Bedingungen; schneller Abbau wird in Säure-katalysierte Umgebungen, beobachtet, wie wegen des Potentials für Säure-katalysierte Hydrazone Anleihe Abbau (Abbildung 8C) erwartet. Die Nanofibrous Strukturen sind auch mechanisch robust in den trockenen und geschwollenen Staaten über mehrere Zyklen ermöglicht einfache Handhabung und wiederholte Anstrengung (Abbildung 8D). Abbildung 5 : Eigenschaften von in Situ -gelling bulk abbaubaren Thermoresponsive Hydrogele. (A) Vertreter POEGMA gel Netzwerk Mikrostrukturen und Bulk Hydrogel Bilder mit entsprechenden Gelierung Zeiten als Funktion der Maulwurf % Einbeziehung der OEGMA475 in den Vorläufer-Polymeren; (B-C) Speicher-Modul von PO100 Hydrogele durch unterschiedliche (B) Vorläufer Polymer Konzentration und (C) mol % Funktionsgruppe Eingliederung pro Vorläufer Polymer; (D-F) Physiochemischen Eigenschaften des POEGMA Hydrogele als Funktion der OEGMA475 mol % Aufnahme: (D) massenspeicherprofil Elastizitätsmodul (E) Abbau-1 M HCl und (F) Volumen Phase Übergangstemperatur in Reaktion auf die Temperatur zu ändern, über den Bereich 20-60 ° C. Alle Fehlerbalken stehen für die Standardabweichung von n = 4 wiederholte Messungen. Adaptiert von Referenz-27 mit freundlicher Genehmigung von Elsevier. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 6 : Eigenschaften von abbaubaren Gel Mikropartikel von reaktiven Mikrofluidik. (A) Auswirkungen der Paraffin-Öl-Volumenstrom auf (gereinigte) Gel Mikropartikel Größe im Wasser; (B) Thermoresponsivity des gereinigten Gel Mikropartikel im Wasser nach einem thermischen Zyklus oberhalb und unterhalb der Übergangstemperatur Volumen Phase; (C) visuelle Beurteilung (Fotos) und Gel Permeation Chromatographie Spuren (Grafik) bestätigt Abbau von Gel Mikropartikel zurück zu ihrer Vorläufer Polymerkomponenten (hier in 1 M HCl, beschleunigten Abbau auf der Zeitskala der Bildgebung zu erleichtern); Maßstabsleiste = 100 µm. Adapted von Referenz-32. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 7 : Eigenschaften von abbaubaren Nanogels von reaktiven Selbstmontage. (A) partikelgrößenverteilungen von Nanogels zubereitet mit verschiedenen Aldehyd: hydrazid Polymer Massenverhältnisse aus dynamische Lichtstreuung (Einschub: Transmission Electron Schliffbild bestätigte die kugelförmige Natur der Nanogels); (B) Thermosensitivity von selbst-zusammengebauten Partikel in Abhängigkeit von dem Massenverhältnis zwischen Aldehyd: hydrazid Polymer verwendet, um die Nanogels (von dynamische Lichtstreuung) vorbereiten, mit Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung von n = 4 Wiederholungen; (C) visuelle Bestätigung des Mangels an Nanogel Aggregation Pre- und Post-Lyophilisierung; (D) visuelle Bestätigung der Säure-katalysierte Zerstörung der Nanogels (hier in 1 M HCl auf die Übereinstimmung mit anderen Studien oben); (E) Gel Permeation Chromatograph Spuren Nanogel Abbauprodukte unter Angabe ihrer Ähnlichkeit zu den hydrazid und Aldehyd funktionalisiert Vorläufer Polymere. Adaptiert mit Erlaubnis von Referenz-28. Copyright 2015, American Chemical Society. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 8 : Eigenschaften von abbaubaren Nanofasern aus reaktiven Elektrospinnen. (A) Rasterelektronenmikroskopie Bilder von Nanofasern im trockenen Zustand (links), die Hälfte in Wasser (mittlere, dünne Film) getaucht und voll eingeweicht in Wasser über Nacht (rechts, dicken Gerüst); (B) Schwellung des Nanofibrous Hydrogel (rot) im Vergleich zu einer Masse Hydrogel (blau) von der gleichen Zusammensetzung, mit Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung von n = 4 Wiederholungen; (C) Scannen Elektronenmikroskopie und (kleines Foto) visuelle Bilder verfolgen den Säure-katalysierte Abbau von Nanofasern in 1 M HCl; (D) Zugfestigkeit Radfahren von Dry (80 Zyklen, 20 % Dehnung/Zyklus) und geschwollen (325 Zyklen, 10 % Dehnung/Zyklus in 10 mM PBS) Electrospun Nanofibrous Hydrogele. Abbildung von Referenz33 geändert und reproduziert mit freundlicher Genehmigung von der Royal Society of Chemistry. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Discussion

All diese Herstellungstechniken haben wir zu mehreren Polymersystemen unter Verwendung nur geringfügige Abweichungen von den Methoden ausführlich über PNIPAM und POEGMA erfolgreich eingesetzt; Benutzer dieser Protokolle müssen jedoch die potenziellen Probleme bewusst sein, die auftreten können, wenn andere Polymere ersetzt werden, in diese Prozesse. Insbesondere kann erhöhen die Viskosität der Polymere Vorläufer sowohl der Verarbeitbarkeit (vor allem in der Mikrofluidik-Methode) als auch die Effizienz der Vermischung der beiden Vorläufer Polymere beeinträchtigen. Darüber hinaus muss die Gelierung Zeit der Polymere gesteuert werden, mit einer Rate abhängig von der Morphologie, die gezielt zur Vermeidung vorzeitiger Gelierung, die Strömung zu hemmen oder verhindern Interdiffusion der reaktiven Pre-Polymere, wesentlich für die gewünschte form dient homogene Gel Strukturen. Die spezifische Beschränkungen jeder Strategie, als auch Ansätze, die wir verwendet haben, um diese Ansätze um solche Einschränkungen bei jeder Herstellung Längenskala zu beheben anzupassen sind nachfolgend beschrieben.

Bulk-Hydrogele über doppeltes Federhaus Spritze Co-extrusion
Gelierung ist der wichtigste Parameter zu kontrollieren, um die Wirksamkeit der doppeltes Federhaus Spritze Technik zur Bildung von Schüttgut Hydrogele zu gewährleisten. Polymere, die zu schnell nach dem Kontakt gel ( 5 s sind zu bevorzugen (obwohl nicht erforderlich) für den Einsatz dieser Technik; Dies ist besonders wichtig, wenn replizieren Hydrogele sind für physische oder mechanische Analyse um sicherzustellen, dass jeder Hydrogel-Guss die gleiche Zusammensetzung hat gewirkt. Gelierung Zeit kann leicht verändert werden, indem Sie die Dichte der reaktiven funktionellen Gruppen auf einem ändern oder Vorläufer Polymere (niedriger Funktionsgruppe Dichte führt zu langsameren Gelierung) oder ändern die Konzentration der Vorläufer Polymere verwendet, um bilden das Gel ( niedrigere Konzentrationen führt zu langsameren Gelierung)²¹. Abwechselnd, reduziert ersetzen (reaktive) Aldehyd-Gruppe mit der (weniger reaktiv) Keton-Gruppe als Elektrophil in die vergelung paar deutlich die Gelierung Zeit ohne deutlich verändern die Zusammensetzung der daraus resultierenden Hydrogel³⁵; Polymere mit Mischungen von Aldehyd vorbereitet und Keton Monomeren Vorstufen können verwendet werden, um die Gelierung wie gewünscht einstellen ohne Änderung der Konzentration der Vorläufer-Polymere verwendet (und damit der Massenanteil von Feststoffen in die resultierende Gel gebildet).

Wir möchte auch anmerken, dass die Erstbesetzung Hydrogel nicht immer die gleichen Eigenschaften wie nachfolgende Hydrogele gegossen haben, eine Beobachtung, die leichte Unterschiede im Preis, an dem der Inhalt der zwei Fässer tatsächlich Statikmischer erreichen, zugeschrieben. Infolgedessen haben wir in der Regel grundieren doppeltes Federhaus Spritze durch Extrudieren ein kleines (< 0,3 mL) Bruchteil der Gel vor dem Einleiten des Gießprozesses um solche Schwankungen zu minimieren. Zu guter Letzt kann zwar nicht in der Regel problematisch bei der Verwendung von Oligomeren Synthetische Polymere vor, die Viskosität des einen oder mehrere Vorläufer Polymerlösungen eine Herausforderung im Zusammenhang mit dieser Technik, sowohl im Hinblick auf die Erleichterung der Strömung mit einfachen Daumen Depression darstellen Neben der Förderung innerhalb des statischen Mischers effektives mischen. Allerdings etwas überraschend sogar Vorläufer Polymerlösungen mit stark unterschiedlichen Viskositäten bilden noch heute relativ homogene Hydrogele der statischen Mischer Anlagen beschrieben in der Teileliste verwenden (z. B. PNIPAM mit einem hohen molekularen Gewicht Kohlenhydrat²⁶), was darauf hindeutet, dass Bedenken über das ineffiziente mischen durch falsch abgestimmte Viskositäten erhebliche mindestens auf der Schüttgut-Skala möglicherweise nicht. Bei Bedarf kann die Verwendung einer Spritze-Pumpe (statt des Daumens) Laufwerk Strömung und/oder die Nutzung von einer größeren Gauge-Nadel am Auslass helfen Probleme im Zusammenhang mit Extrudability in diesen Systemen zu überwinden.

Microscale Hydrogele über reaktive Mikrofluidik
Der wichtigste Schritt der Mikrofluidik-Ansatz für Gel Mikropartikel Herstellung zugeordnet ist die Grundierung der Mikrofluidik-Chip mit zwei reaktive Polymere. Wenn die Polymere mit verschiedenen drücken oder mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten in den Chip geliefert werden, kann der Differenzdruck den Rückfluss der Polymerlösung ein Vorläufer in den Vorratsbehälter fahren (oder zumindest in Richtung Stausee) des anderen Vorläufer Polymers. Dies führt zu Gelierung stromaufwärts von Partikelbildung, effektiv blockiert und erfordern somit Chip zur Verfügung. Die qualvolle Weg zwischen einzelnen Vorratsbehälter und die Mischstelle eingeprägt schafft einen erheblichen Widerstand gegen Rückfluss; sogar ein geschultes Bedienpersonal wird jedoch gelegentlich einen Chip gel, bevor eine stabile Abflussregime erreicht wird. Basierend auf unserer Erfahrung, ist zwischen 1 – 2 min. in der Regel erforderlich, um zu stabilisieren die Bewegungen nach der Einleitung der Tropfenbildung (über die Zeit relativ Polydisperse Gel Mikropartikel hergestellt werden); Wenn keine Probleme innerhalb der ersten 5-10 Minuten beobachtet werden, ist es wahrscheinlich, dass mehrere Stunden kontinuierliche Monodisperse Partikel Produktion erreicht werden können. Die Verwendung von Vorläufer Polymere mit relativ gut abgestimmte Viskositäten sowie nicht sofortige Gelierung Zeiten (mindestens > 15 s vorzuziehen) stark hilft bei der Vermeidung von solchen Problemen und fördern die Bildung von stabilen fließt.

Beachten Sie, dass verschiedene Sätze von 0,01-0,1 bis hin fließen mL/h in der wässrigen Phase und 1.1-5,5 mL/h in der Ölphase wurde getestet mit diesem Chip-Design, führt zur Herstellung von Partikeln im Größenbereich von ~ 25-100 µm nach die Scherung angewendet bei der Flow-Fokussierung Verzweigung; schnellere Flussraten auf höhere Scherkräfte gleichzusetzen und somit kleinere Teilchen³¹^,³². Variation der Öldurchsatz unter Beibehaltung der wässrigen Gesamtdurchsatz Rate niedrig (~0.03 mL/h, zitiert nach dem Protokoll) gefunden wurde, effizienteste, Gel Mikropartikel Größe zu kontrollieren, ohne entweder Monodispersity oder die Lebensdauer des Gerätes, wurden die beobachtet, um deutlich am oberen Ende der zitierten wässrigen Gesamtdurchsatz Raten zu verringern. Größeren Öl-Fördermengen (> 5,5 mL/h) erstelle ich kleinere Partikel sind möglich, aber erhöht das Risiko von Chip Delamination (eine gemeinsame Beschränkung begegnet mit Plasma-gebundenen PDMS mikrofluidischen Chips). Kleben die Chips mit einer anderen Methode können schneller Durchflussmengen und somit kleinere Gel Mikropartikel Produktion, eine Strategie, die wir derzeit untersuchen. Verringerung der Größe der Düse kann auch helfen, reduzieren Sie die Größe der Mikropartikel, die produziert werden könnte, wenn auch mit einem erhöhten Risiko der vorzeitigen Gelierung vor Partikelbildung. Langsamer Durchfluss tendenziell führen zu Instabilitäten und damit höhere Polydispersitäten und ein erhöhtes Risiko für Chip Gelierung fließen; Diese Einschränkung könnte durch eine Mehrkanal-mikrofluidischen Fluss Steuersystem, die höhere Stabilität und eine höhere Auflösung als die standard Spritzenpumpen, die in diesem Protokoll verwendeten hat überwunden werden.

Die Wahl des Öls war entscheidend für den Erfolg dieses Protokolls als schwerere Öle (günstig bei der Verhütung von Gel Mikropartikel Agglomeration nach der Entnahme) führte zu viel weniger konsequent Partikelbildung an der Düse als das leichte Silikonöl in gemeldet das Protokoll. Wir vermuten dies reduziert Reproduzierbarkeit ist eine Folge der niedrigeren Konsistenz der Spritze Pumpen schwerere Öle, führt zu mehr Variable Scherung bei der Mischstelle. Vermeidung von Gel Mikropartikel Aggregation in die sammelflasche war auch eine Herausforderung, besonders unmittelbar bei der Ausfahrt aus der mikrofluidischen Gerät, an welcher Stelle in Situ Gelierung nicht vollständig und große Zahlen der verfügbaren reaktive funktionelle Gruppen wurden Form Brücken zwischen zusammenstoßenden Teilchen in der Sammlung Badewanne zur Verfügung. Diese Herausforderung richtet sich durch: Erhöhung der Länge des Kanals Ausfahrt auf dem Mikrofluidik-Chip selbst, die Aufrechterhaltung der Gel-Mikropartikel in Laminar-Flow für längere Zeit zu fördern mehr vollständig Gelierung; die seitlichen Kanäle hinzufügen nach der Düse zugeführt mehr Öl der Chip und damit besser Separate Gel Mikropartikel in diesem Post-Mix Kanal ohne Auswirkungen auf die scher Felder an der Düse selbst oder die Partikel Produktionsrate; und gel-Mikropartikel Sedimentation und pflegen eine größere durchschnittliche Trennung zwischen benachbarten Teilchen der sammelflasche zu vermeiden einen magnetische Mischer hinzufügen. Während sehr langsam gelierende Polymere würde wahrscheinlich Gerät Stabilität verbessern und Probleme mit Grundierung minimieren, wurden solche Systeme auch beobachtet, um das Gel Mikropartikel Aggregation, als eine größere Anzahl von reaktiven funktionellen Gruppen deutlich erhöhen bleibt nicht umgesetztes (und somit in der Lage, Form Inter Partikel Brücken) über einen längeren Zeitraum hinweg. Als solche erscheinen Gelierung Zeiten in der Größenordnung von 15-60 s optimal für diese Technik: langsam genug, um die Grundierung, sondern schnell genug reaktivste Funktionsgruppen ermöglichen vor dem Verlassen des Laminar-Flow-Kanals in Gel-Mikropartikel verbraucht werden die sammelflasche.

Schließlich ist das Template Getriebeöl wichtig, sicherzustellen, dass die entstehenden Partikel zu erhalten, dass die intelligente Eigenschaften erwartet aufgrund der Zusammensetzung der Pre-Polymere hinzugefügt und Verwendung dieser Partikel in einem biomedizinischen Umfeld zu ermöglichen. Das Pentan Waschverfahren beschrieben war sehr effektiv in diesem Zusammenhang für allgemeine Gel Mikropartikel Produktion. Jedoch würde die Anwendung dieser Technik in einem direkten biomedizinischen Kontext (z.B. auf dem Chip Zelle Kapselung) Neubewertung dieses Protokolls erforderlich. Wir haben auch die Verwendung von Olivenöl, schlug vor, dass eine mehr inerte Öl im Rahmen der Kontaktaufnahme mit³⁶, als das Dispersionsmittel Zellen untersucht. Während Partikelbildung möglich war, lebten die Gel Mikropartikel deutlich mehr Polydisperse als mit Mineralöl, zumindest mit dem aktuellen Chipdesign erreicht werden könnte. So, während der Chip an synthetischen Polymer und natürliches Polymer Gel Mikropartikel Bildung³¹angepasst werden können scheint, eine Sonderanfertigung erforderlich, diese Technik ganz allgemein über alle möglichen Materialkombinationen zu nutzen sein.

Nanoskalige Hydrogele über reaktive Selbstmontage
Nanogels sind gebildet worden, mit einem sehr breiten Spektrum der Verarbeitungsbedingungen, einschließlich unterschiedliche Konzentrationen von saatpolymerisat (0,5-2 Gew.-%), unterschiedliche Verhältnisse der Crosslinking:seed Polymer (0,05-0,2), unterschiedliche Temperaturen (40-80 ° C), verschiedene mischen Geschwindigkeiten ( 200-800 u/min), und andere Heizung Zeiten nach der Zugabe der Vernetzer Polymer (2-60 min)²⁸. In Bezug auf die Konzentrationen sind in der Regel als vorhergesagt werden würde, da höhere Konzentrationen von saatpolymerisat zu größeren Nanogels führen und höhere Verhältnisse der Crosslinker:seed Polymer zu Nanogels mit höheren Crosslink dichten führen und somit geringere beobachteten trends Thermoresponsivities. Es sollte betont werden, erhöhen das saatpolymerisat die Konzentration zu hoch führt letztlich um zu bulk-Aggregation im Gegensatz zu Nanoaggregation, entsprechen, was bei der herkömmlichen radikalische Niederschlag bilden beobachtet wird Thermoresponsive Nanogels³. Kürzere Aufheizzeiten fand man auch günstig für die Bildung kleiner und mehr Monodisperse Partikel sein. Wir stellen die Hypothese auf, dass hält die Nanoaggregate auf längere Zeit bei einer Temperatur über die LCST eine oder beide der Vorläufer Polymere erhöht die Wahrscheinlichkeit der Aggregation bei einer Nanogel Kollision mit erhöhten Hydrophobie der Hydrazone Anleihe gegenüber entweder die Vorläufer Aldehyd oder hydrazid Funktionsgruppen machen diese Aggregation eher wie der Grad der Vernetzung erreicht erhöht ist. Letztlich sind kürzere Aufheizzeiten günstig aus Sicht des Prozesses, wie eine Monodisperse Nanogel Bevölkerung in weniger als 2 min nach Vernetzer Polymer Zugabe gebildet werden kann; 10 min erwies sich die längste Zeit, die konsequent Monodisperse Nanogels produzieren könnte, wobei auch für die Herstellung von hoch vernetzte Nanogels. Interessanterweise ist die Methode erstaunlich unempfindlich gegen mischen, mit nahezu identischen Partikelgrößen und partikelgrößenverteilungen durch Mischen mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten oder sogar Skalierung des Prozess um größere Mengen. Während zunächst von diesem Ergebnis überrascht, spricht es wahrscheinlich auf die primäre Rolle der Thermodynamik bei der Regulierung der Nanogel Produktion.

Um niedrige Polydispersitäten zu erreichen, scheinen die kolloidale Stabilität und dem Grad der Feuchtigkeit von der Nanoaggregate die Schlüsselvariablen. Z. B. führen Nanoaggregates zubereitet, die mehr hydrophile hydrazid funktionalisiert Polymere als Samen im Gegensatz zu weniger hydrophil Aldehyd funktionalisiert Polymere zu Nanogels mit deutlich niedrigeren Polydispersitäten. Der Unterschied zwischen der experimentellen Einbautemperatur und die LCST das saatpolymerisat ist auch entscheidend. Bei einer Temperatur knapp über das saatpolymerisat LCST ((T-LCST) < 5 ° C) bietet die höchste Wahrscheinlichkeit der Monodisperse Nanogel Bildung; Betrieb auch über die LCST schafft mehr hydrophobe und reduzierten Nanoaggregates, die eher zu aggregieren und weniger wahrscheinlich zu vernetzen, während des Betriebs unter der LCST resultiert eine relativ nicht-kompakte saatpolymerisat, die effektiv sein kann oder reproduzierbar vernetzt. Für die beste Vorhersage der Partikel Monodispersity, empfehlen wir zuerst einen UV/Vis-Scan, um den Ausbruch LCST das saatpolymerisat Messen durchführen und anschließend die Selbstmontage Prozess durchführen, bei einer Temperatur 1 bis 2 ° C über dieser LCST.

Beachten Sie, dass Nanogels hergestellt, mit dieser Methode konnte lyophilisiert und ohne irgendeine Änderung in kolloidale Stabilität, oft nicht möglich, für selbst-zusammengebauten Strukturen und aus unserer Sicht auf unsere Vernetzung Stabilisierungsmethode zurückzuführen dispergiert. Wir erwarten außerdem, dass nur das saatpolymerisat Thermoresponsive für diese Methode funktioniert muss; Verwendung der Vernetzung von Polymeren, die entweder nicht mehr reagiert oder reagieren auf andere Reize kann die ultimative Anwendbarkeit dieser Technik weiter auszubauen. Schließlich, da das Mischen der zwei reaktive Vorläufer Polymere ist ist in diesem Fall passiv im Gegensatz zu aktiven, Gelierung Zeit viel weniger wichtig im Hinblick auf die Prozess-Steuerung im Vergleich zu den anderen Fertigung Strategien beschrieben. Aber auch bei dieser Technik, halten die totale Vernetzung Zeit < 30 min ist zur Minimierung des Risikos der Partikel Aggregation wünschenswert.

Nanofibrous Hydrogele über reaktive Elektrospinnen
Controlling die Gelierung Zeit der Pre-reaktive Polymere ist wieder entscheidend für den Erfolg der Gel Nanofaser Produktion. Insbesondere etwa ensprechen die Verweilzeit der Vorläufer Polymere in den statischen Mischer (gesteuert durch eine Änderung des Durchfluss der Lösung aus der Doppel-Fass-Spritze sowie der Länge und schlängelung des statischen Mischers) Bulk Gelierung die Vorläufer-Polymere ist wesentlich sowohl für spinnbarkeit zu bewahren sowie die effektive Vernetzung der gesponnenen Fasern zwischen der Nadel und der Sammler zu gewährleisten. Schneller Gelierung führt zu ineffektiv Taylor Kegel Entwicklung und somit schlechte spinnbarkeit, während langsamere Gelierung Ergebnisse in einer wässrigen Lösung anstelle eines Gels schlagen den Sammler, was bei der Verbreitung und die ultimative Bildung aus einer dünnen Schicht gel statt Nanofasern. Arbeitszeit bei Verweilzeiten leicht unter die Masse Gelierung wurde auch effektiv (und in der Tat besser zur Verringerung des Risikos der Nadel verstopfen) gefunden da Wasserverdunstung wie die Lösung effektiv gesponnen wird konzentriert sich die Vorläufer-Polymere in der streamen und somit beschleunigt die Gelierung Kinetik während des Spinnprozesses. In diesem Sinne, bei größeren Nadel-Sammler Entfernungen (> 10 cm) ist im allgemeinen vorteilhaft in diesem Prozeß wie kürzere Distanzen die verfügbare Zeit für Wasserverdunstung verringern und erfordern daher eine strengere Kontrolle über die Beziehung zwischen Verweilzeit und Gelierung Zeit um ein Nanofibrous Produkt zu erhalten.

Beachten Sie, dass die Verwendung von PEO (oder ein anderes hohes Molekulargewicht und leicht Electrospun Polymer) ist wichtig in diesem Protokoll Nanofaser Bildung zu fördern, wie kurz und stark verzweigten POEGMA Oligomere nicht allein ein angemessenes Maß der Verschränkung erreichen induzieren Elektrospinnen; Stattdessen Prozessbedingungen Elektrospray Ergebnisse überhaupt getestet für POEGMA nur Formulierungen (obwohl dies auch für die Herstellung von abbaubaren Gel Teilchen mit dieser gleichen Chemie haben kann). Eine minimale PEO-Konzentration von 1 Gew.-% (1 MDa Molekulargewicht) ist erforderlich, um eine voll Nanofibrous Morphologie zu pflegen. Beachten Sie, dass die Menschen aus den Fasern, die nach einem einfachen durchnässten Verfahren (deionisiertes Wasser, 24 h) ohne Beeinträchtigung der Integrität des Nanofibrous Netzwerks entfernt werden kann; auf diese Weise wirkt Menschen mehr als eine vorübergehende Elektrospinnen Hilfe als ein wesentlicher Bestandteil des endgültigen Nanofibrous Produkts. Beachten Sie auch, dass verschiedene Arten von Kollektoren, einschließlich einfache Aluminium-Folie (zu dünne Schicht Hydrogele, die delaminieren können aus dem Kollektor nach Einweichen) sowie einer rotierenden Aluminium-Scheibe (um dickere Gerüste erstellen) in Verbindung mit dieser gleichen verwendet werden kann Technik, sofern die anderen Prozessvariablen controlling die Rate der Gelierung, die Rate der Elektrospinnen und die Rate von Wasserverdampfung während Elektrospinnen bleiben unverändert.

Interessanterweise sind abhängig von der Methode verwendet, um die verschiedenen Morphologien vorbereiten, erhebliche Unterschiede in den Abbau-Zeiten der Hydrogele vorbereitet aus der gleichen Hydrogel-Vorstufen beobachtet worden. Z. B. verschlechtern POEGMA Nanofibrous Hydrogele langsamer als Schüttgut POEGMA Hydrogele mit der gleichen Zusammensetzung trotz ihrer deutlich höheren Fläche und somit Zugang zu Wasser für die Hydrazone Anleihen hydrolyseneigung. Wir beziehen diese Unterschiede auf die inhärenten Gegensätze zwischen den beschriebenen Protokollen in Bezug auf die Geometrie des Mischens der Vorläufer-Polymeren, die zur internen Gel Homogenitäts führen können und/oder Morphologien, die sich deutlich unterscheiden und/oder in Situ Konzentration der polymervorläufer auf der gleichen Zeitskala als Gelierung, insbesondere in Elektrospinnen aufgrund der gleichzeitigen Wasserverdunstung und Vernetzung in diesem Prozess beobachtet. Während dies die Wahl der Vorläufer Polymere etwas erschweren kann, wenn ein Polymer für den Einsatz in jedem Protokoll ausgerichtet ist, kann es auch eine technische Möglichkeit im Hinblick auf die Hydrogele mit einer chemischen Zusammensetzung, aber sehr unterschiedlichen physikalischen Eigenschaften anbieten.

Insgesamt bieten die beschriebenen Methoden eine Strategie für die Herstellung von abbaubaren (oder zumindest renally verrechenbar) Analoga von Thermoresponsive Polymeren auf mehreren Längenskalen (Bulk, Mikro und Nano) und mit mehreren Arten von internen Strukturen (Partikel oder Fasern). Solche Protokolle behandeln die wichtigsten Hindernisse für eine erfolgreiche Übersetzung des synthetischen Thermoresponsive konventionell zubereitet Materials im biomedizinischen Bereich: Injectability und Abbaubarkeit. Wir sind weiterhin die Anwendung solcher Materialien in Drug Delivery und Gewebetechnik Anwendungen reichen von der physischen Ausrichtung der Krebsarten, den Transport von Drogen über die Blut – Hirn-Schranke, die therapeutische Lieferung von Proteinen bei erkunden der Rückseite des Auges, gerichtetes Wachstum von Gewebe, und die Thermoreversible Adhäsion und Differenzierung von Zellen, unter anderen Anwendungen.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Finanzierung von naturwissenschaftlich-technische Forschung Rat von Kanada (NSERC), NSERC erstellen-IDEM (Integrated Design der extrazellulären Matrizen) programmieren, 20/20: NSERC ophthalmologischen Biomaterials Research Network und der Ontario Ministerium für Forschung und Innovation der frühen Forscher Auszeichnungsprogramm wird anerkannt.

Materials

Chemicals
2,2 – azobisisobutryic acid dimethyl ester	Wako Chemicals	101138
Di(ethylene glycol) methyl ether methacrylate (M(EO)2MA)	Sigma Aldrich	447927	188.2 g/mol, n=2 ethylene oxide repeat units
Oligo (ethylene glycol) methyl ether methacrylate (OEGMA475)	Sigma Aldrich	447943	475 g/mol, n=8-9 ethylene oxide repeat units
Acrylic acid (AA), 99%	Sigma Aldrich	147230
Thioglycolic acid (TGA), 98%	Sigma Aldrich	T3758
Dioxane, 99%	Caledon Labs	360481
Nitrogen, UHP grade	Air Liquide	Alphagaz1 765A-44
Adipic acid dihydrazide (ADH), 98%	Alfa Aesar	A15119
N'-ethyl-N-(3- dimethylaminopropyl)-carbodiimide (EDC, x%)	Carbosynth	FD05800
Hydrochloric acid (HCl), 37%	Sigma Aldrich	320331
Sodium hydroxide (NaOH), 97%	Sigma Aldrich	221465
Aminoacetyl aldehyde dimethyl acetal, 99%	Sigma Aldrich	121967
4-Hydroxy-TEMPO, 97%	Sigma Aldrich	176141
Methacryloyl chloride,97x%	Sigma Aldrich	523216
Petroleum ether, 95%	Sigma Aldrich	32047
Magnesium sulfate, 99.5%	Sigma Aldrich	M7506
tert-Butyl methyl ether, >99.0%	Sigma Aldrich	443808
Phosphate buffered saline	BioShop	PBS405.1	1x, pH 7.3-7.5
N-isopropylacrylamide, 99%	J&K Scientific	258717	Recrystallized from 60% hexanes/40% toluene
Ethanol, anhydrous	Commerical Alchols	P016EAAN
Span 80	Sigma Aldrich	S6760
Heavy paraffin oil	Caledon Labs	1326197
Pentane, reagent grade	Caledon Labs	1/10/7800
Poly (ethylene oxide) average Mv 600,000	Sigma Aldrich	182028
Supplies essential for synthesis and hydrogel fabrication
Rotary evaporator	Heidolph	G3
Dialysis tubing (3500 Da molecular weight cut-off)	Spectrum Labs	28170-166	Vol/length= 6.4mL/cm
Double barrel syringe	Medmix	L series	L series, 2.5 mL, 1:1 volume ratio
Static mixer	Medmix	L series	L series, 2.5 mL, 1:1 volume ratio, 1.5" length
Silicone rubber sheet, 1/16" thickness	McMaster-Carr	9010K12, 30A Durometer (Super Soft)
Syringe pump	KD Scientific	KDS Legato 200	Infuse Only Dual Syringe Pump
High voltage power supply	Spellman	230-20R	0 to 20 kV
Microfluidic Chip Fabrication
Silicon wafer	University Wafer	2080	D = 76.2 mm; 380 µm thickness; P-doped; <100> orientation
SU-8 100	MicroChem	Y131273
SU-8 Developer	MicroChem	Y020100
Custom 2.5" spincoater	Built in-house	N/A
Mask Aligner	KARL SUSS	MJB3 UV400 (with a 276 W lamp)
Masterflex L/S 13 Silicone Tubing	Cole Parmer	OF-96400-13	Peroxide-cured
Dow Corning Sygard 184 Silicone Elastomer Base	Ellsworth Adhesives	4019862
Dow Corning Sygard 184 Silicone Elastomer Curing Agent	Ellsworth Adhesives	4019862
High Power Plasma Cleaner	Harrick	PDC-002-HP
Characterization Instruments
Mach 1 micromechanical tester	Biomomentum	LB007-EN
Cellstar tissue culture 12 well plate	Greiner Bio-one	665 180
Cell culture insert for 12 well plate	Corning	08-771-12	8 µm pore size
Optical microscope	Olympus BX51 optical microscope	BX51
Temperature-controlled microscope stage	Linkam Scientific	THMS600
Gel permeation chromatograph (GPC)	Waters	590 HPLC Pump	Waters Styragel columns (HR2, HR3, HR4; 30 cm x 7.8 mm (ID); 5 mm particles), Waters 410 refractive index detector
Dynamic light scattering (DLS)	Brookhaven	90Plus Particle Size Analyzer
Transmission electron microscopy (TEM)	TEMSCAN	JEOL 1200EX	Accelerating voltage 100 kV
Scanning electron microscopy (SEM)	Tescan	Vega II LSU	Accelerating voltage 10 kV
Microsquisher	CellScale Biomaterials Testing	MS-50M-01

Riferimenti

Heskins, M., Guillet, J. E. Solution Properties of Poly(N-isopropylacrylamide). J. Macromol. Sci. A. 2 (8), 1441-1455 (1968).
Lutz, J. -. F., Akdemir, &. #. 2. 1. 4. ;., Hoth, A. Point by Point Comparison of Two Thermosensitive Polymers Exhibiting a Similar LCST: Is the Age of Poly(NIPAM) Over. J. Am. Chem. Soc. 128 (40), 13046-13047 (2006).
Pelton, R. H., Chibante, P. Preparation of Aqueous Lattices with N-Isopropylacrylamide. Colloids Surf. 20 (3), 247-256 (1986).
Palasis, M., Gehrke, S. H. Permeability of Responsive Poly(N-Isopropylacrylamide) Gel to Solutes. J. Controlled Release. 18 (1), 1-11 (1992).
Kawaguchi, H., Fujimoto, K., Mizuhara, Y. Hydrogel Microspheres .3. Temperature-Dependent Adsorption of Proteins on Poly-N-Isopropylacrylamide Hydrogel Microspheres. Colloid Polym. Sci. 270 (1), 53-57 (1992).
Okuyama, Y., Yoshida, R., Sakai, K., Okano, T., Sakurai, Y. Swelling Controlled Zero-Order and Sigmoidal Drug-Release from Thermoresponsive Poly(N-Isopropylacrylamide-Co-Butyl Methacrylate) Hydrogel. J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 4 (5), 545-556 (1993).
Snowden, M. J. The Use of Poly(N-Isopropylacrylamide) Lattices as Novel Release Systems. J. Chem. Soc. – Chem. Comm. (11), 803-804 (1992).
Haraguchi, K., Takehisa, T., Ebato, M. Control of cell cultivation and cell sheet detachment on the surface of polymer/clay nanocomposite hydrogels. Biomacromolecules. 7 (11), 3267-3275 (2006).
Lee, B., et al. Initiated chemical vapor deposition of thermoresponsive poly(N-vinylcaprolactam) thin films for cell sheet engineering. Acta Biomater. 9 (8), 7691-7698 (2013).
Cole, M. A., Voelcker, N. H., Thissen, H., Griesser, H. J. Stimuli-responsive interfaces and systems for the control of protein-surface and cell-surface interactions. Biomaterials. 30 (9), 1827-1850 (2009).
Feil, H., Bae, Y. H., Feijen, J., Kim, S. W. Molecular Separation by Thermosensitive Hydrogel Membranes. J. Membrane Sci. 64 (3), 283-294 (1991).
Kim, J., Park, K. Smart hydrogels for bioseparation. Bioseparation. 7 (4-5), 177-184 (1998).
Yamashita, K., Nishimura, T., Nango, M. Preparation of IPN-type stimuli responsive heavy-metal-ion adsorbent gel. Polym. Adv. Tech. 14 (3-5), 189-194 (2003).
Ziolkowski, B., Czugala, M., Diamond, D. Integrating stimulus responsive materials and microfluidics: The key to next-generation chemical sensors. J. Intelligent Mater. Syst. Struct. 24 (18), 2221-2238 (2013).
Zhang, Y., Kato, S., Anazawa, T. A flap-type hydrogel actuator with fast responses to temperature. Smart Mater. Struct. 16 (6), 2175-2182 (2007).
Suzuki, D., Taniguchi, H., Yoshida, R. Autonomously Oscillating Viscosity in Microgel Dispersions. J. Am. Chem. Soc. 131 (34), 12058-12059 (2009).
Schild, H. G. Poly(N-isopropylacrylamide): Experiment, Theory and Application. Prog. Polym. Sci. 17, 163-249 (1992).
Oh, J. K., Min, K., Matyjaszewski, K. Preparation of poly (oligo (ethylene glycol) monomethyl ether methacrylate) by homogeneous aqueous AGET ATRP. Macromolecules. 39 (9), 3161-3167 (2006).
Vihola, H., Laukkanen, A., Tenhu, H., Hirvonen, J. Drug Release Characteristics of Physically Cross-Linked Thermosensitive Poly(N-vinylcaprolactam) Hydrogel Particles. J. Pharm. Sci. 97 (11), 4783-4793 (2008).
Zhang, L. F., Liang, Y., Meng, L. Z. Thermo-sensitive amphiphilic poly(N-vinylcaprolactam) copolymers: synthesis and solution properties. Polym. Adv. Tech. 21 (10), 720-725 (2010).
Smeets, N. M. B., Bakaic, E., Patenaude, M., Hoare, T. Injectable and tunable poly(ethylene glycol) analogue hydrogels based on poly(oligoethylene glycol methacrylate). Chem. Comm. 50 (25), 3306-3309 (2014).
Lutz, J. -. F. Polymerization of oligo (ethylene glycol)(meth) acrylates: toward new generations of smart biocompatible materials. J. Polym. Sci. A. 46 (11), 3459-3470 (2008).
Lutz, J. -. F., Hoth, A. Preparation of Ideal PEG Analogues with a Tunable Thermosensitivity by Controlled Radical Copolymerization of 2-(2-Methoxyethoxy)ethyl Methacrylate and Oligo(ethylene glycol) Methacrylate. Macromolecules. 39 (2), 893-896 (2006).
Patenaude, M., Campbell, S., Kinio, D., Hoare, T. Tuning Gelation Time and Morphology of Injectable Hydrogels Using Ketone-Hydrazide Cross-Linking. Biomacromolecules. 15 (3), 781-790 (2014).
Patenaude, M., Hoare, T. Injectable, Degradable Thermoresponsive Poly(N-isopropylacrylamide) Hydrogels. ACS Macro Lett. 1 (3), 409-413 (2012).
Patenaude, M., Hoare, T. Injectable, Mixed Natural-Synthetic Polymer Hydrogels with Modular Properties. Biomacromolecules. 13 (2), 369-378 (2012).
Smeets, N. M. B., Bakaic, E., Patenaude, M., Hoare, T. Injectable poly(oligoethylene glycol methacrylate)-based hydrogels with tunable phase transition behaviours: Physicochemical and biological responses. Acta Biomater. 10 (10), 4143-4155 (2014).
Sivakumaran, D., Mueller, E., Hoare, T. Temperature-Induced Assembly of Monodisperse, Covalently Cross-Linked, and Degradable Poly(N-isopropylacrylamide) Microgels Based on Oligomeric Precursors. Langmuir. 31, 5767-5778 (2015).
Bakaic, E., Smeets, N. M. B., Dorrington, H., Hoare, T. “Off-the-shelf” thermoresponsive hydrogel design: tuning hydrogel properties by mixing precursor polymers with different lower-critical solution temperatures. RSC Adv. 5 (42), 33364-33376 (2015).
Bulpitt, P., Aeschlimann, D. New strategy for chemical modification of hyaluronic acid: Preparation of functionalized derivatives and their use in the formation of novel biocompatible hydrogels. J. Biomed. Mater. Res. 47 (2), 152-169 (1999).
Kesselman, L. R. B., Shinwary, S., Selvaganapathy, P. R., Hoare, T. Synthesis of Monodisperse, Covalently Cross-Linked, Degradable “Smart” Microgels Using Microfluidics. Small. 8 (7), 1092-1098 (2012).
Sivakumaran, D., Mueller, E., Hoare, T. Microfluidic production of degradable thermoresponsive microgels based on poly(N-isopropylacrylamide). Soft Matter. , (2016).
Xu, F., Sheardown, H., Hoare, T. Reactive Electrospinning of Degradable Poly(oligoethylene glycol methacrylate)-Based Nanofibrous Hydrogel Networks. Chem. Comm. 52 (7), 1451-1454 (2016).
Troll, K., et al. The collapse transition of poly(styrene-b-(N-isopropyl acrylamide)) diblock copolymers in aqueous solution and in thin films. Colloid Polym. Sci. 286 (8), 1079-1092 (2008).
Patenaude, M., Campbell, S., Kinio, D., Hoare, T. Tuning Gelation Time and Morphology of Injectable Hydrogels Using Ketone-Hydrazide Cross-Linking. Biomacromolecules. 15 (3), 781-790 (2014).
Kelly, T. A., Felder, M. S., Ollar, R. A. Inducing Apoptosis in a Mammalian Cell by Contacting with Paraffin or Agar. US Patent. , (2001).

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Citazione di questo articolo

Sivakumaran, D., Bakaic, E., Campbell, S. B., Xu, F., Mueller, E., Hoare, T. Fabricating Degradable Thermoresponsive Hydrogels on Multiple Length Scales via Reactive Extrusion, Microfluidics, Self-assembly, and Electrospinning. J. Vis. Exp. (134), e54502, doi:10.3791/54502 (2018).