Isolierung von Lipoproteinen hoher Dichte für Non-coding Small RNA Quantification
Summary
This protocol describes the isolation and quantification of high-density lipoprotein small RNAs.
Abstract
Die Vielfalt der kleinen nicht-kodierenden RNAs (sRNA) ist schnell wachsenden und ihre Rollen in biologischen Prozessen, einschließlich der Genregulation, entstehen. Interessanterweise sRNAs werden auch außerhalb der Zellen und sind stabil in allen biologischen Flüssigkeiten gefunden. Als solche stellen extrazelluläre sRNAs eine neue Klasse von Krankheits Biomarkern und werden in Zellsignalisierung und interzellulare Kommunikationsnetze wahrscheinlich beteiligt. Ihr Potenzial als Biomarker beurteilen kann sRNAs im Plasma, Urin und anderen Flüssigkeiten quantitativ bestimmt werden. Dennoch vollständig die Wirkung von extrazellulärem sRNAs als endokrine Signale zu verstehen, ist es wichtig , zu bestimmen , welche Ladungsträger zu transportieren und sie in biologischen Flüssigkeiten (zB Plasma) zu schützen, das Zellen und Gewebe zu extrazellulärem sRNA Pools tragen und Zellen und Gewebe fähig des Annehmens und der extrazellulären sRNA verwendet. Um das zu erreichen, diese Ziele ist es entscheidend, hochreine Populationen von extrazellulären Träger zu isolierenfür sRNA Profilierung und Quantifizierung. Wir haben zuvor gezeigt, dass Lipoproteine, insbesondere Lipoproteine hoher Dichte (HDL), transportiert funktionelle mikroRNAs (miRNAs) zwischen Zellen und HDL-miRNAs sind Krankheit signifikant verändert. Hier Detail, das wir ein neues Protokoll, das Tandem-HDL-Isolierung mit Dichte-Ultrazentrifugation (DGUC) und Fast-Protein-Flüssigchromatographie (FPLC) verwendet zu erhalten hochreine HDL für Downstream-Profilierung und Quantifizierung aller sRNAs, einschließlich miRNAs, die beide hoch mit -throughput Sequenzierung und Real-Time-PCR-Ansätze. Dieses Protokoll wird eine wertvolle Ressource für die Untersuchung von sRNAs auf HDL sein.
Introduction
Die extrazelluläre nicht-kodierende kleine RNAs (sRNAs) stellen eine neue Klasse von Krankheit Biomarker und potentielle therapeutische Targets und wahrscheinlich erleichtern Zell-zu-Zell – Kommunikation 1. Die am häufigsten untersuchten Typ von sRNA sind Mikro – RNAs (miRNAs) , die etwa 22 nts lang sind und aus längeren Vorläuferformen und primären Transkripte 2 verarbeitet. miRNAs wurden posttranskriptionell demonstriert die Genexpression durch Unterdrückung der Proteintranslation und die Induktion von mRNA – Abbau 2 regulieren. Dennoch sind miRNAs nur eine von vielen Arten von sRNAs; wie sRNAs kann von den Eltern tRNAs (tRNA-derived sRNAs, TDR), small nuclear RNAs (sRNA-derived sRNAs, sndRNA), kleine nucleolar RNAs (snoRNA abgeleitete sRNAs, snRNA), ribosomale RNAs (rRNA-abgeleitete sRNAs gespalten werden, RDR ), Y RNAs (yDR) und verschiedene andere RNAs 1. Einige Beispiele dieser neuartigen sRNAs wurden berichtet miRNAs ähnlich zu funktionieren; jedoch die biologische funktionen vieler dieser bleibt sRNAs bestimmt werden, obwohl Rollen in Genregulation 3-6 wahrscheinlich sind. Interessanterweise sind miRNAs und andere sRNAs stabil in extrazellulären Flüssigkeiten, einschließlich Speichel, Plasma, Urin und Galle. Extrazellulärem sRNAs wahrscheinlich von RNasen durch ihre Assoziation mit extrazellulären Vesikeln (EV), Lipoproteine und / oder extrazellulären Ribonukleoprotein-Komplexe geschützt.
Zuvor haben wir berichtet , dass Lipoproteine, nämlich High-Density – Lipoproteine (HDL), Transport miRNAs in Plasma 7. In dieser Studie wurden HDL unter Verwendung einer sequenziellen Methode der Dichte-Gradienten-Ultrazentrifugation (DGUC) isoliert, schnell-Protein-Flüssigchromatographie (Grßenausschlußchromatographie Gelfiltration, FPLC) und Affinitätschromatographie (anti-Apolipoprotein AI (ApoA-I) Immunpräzipitation 7). Mit beiden real-time PCR-basierten Low-Density-Arrays und einzelne miRNA-Assays wurden miRNA Ebenen auf HDL quantifiziert isoliert von heilendeine und hypercholesterolemic Themen 7. Mit diesem Ansatz konnten wir miRNAs zu profilieren und spezifischen miRNAs in hochreiner HDL Vorbereitungen zu quantifizieren. Seit 2011 haben wir festgestellt, dass, obwohl die Affinitätschromatographie HDL Reinheit verbessert, Antikörpersättigung Ausbeute stark begrenzt und kann kostspielig sein. Derzeit empfiehlt unser Protokoll einen zweistufigen sequentiellen Tandemverfahren DGUC durch FPLC gefolgt, die auch hochwertige HDL Proben für Downstream-RNA-Isolierung und Quantifizierung sRNA erzeugt. Aufgrund der jüngsten Fortschritte in der Hochdurchsatz – Sequenzierung von sRNAs (sRNAseq), zB miRNAs, und das erhöhte Bewusstsein für andere nicht-miRNA sRNA Klassen ist sRNAseq die aktuellen State-of-the-art in miRNA und sRNA Profilierung. Als solches unser Protokoll empfiehlt miRNAs und andere sRNAs auf HDL-Proben unter Verwendung von sRNAseq zu quantifizieren. Dennoch kann Gesamt-RNA aus HDL isoliert auch einzelne miRNAs und andere sRNAs oder validieren sRNAseq Ergebnisse mit real-time PCR eine Quantifizierung verwendet werdenpproaches. Hier beschreiben wir ausführlich ein Protokoll für die Erfassung, Reinigung, Quantifizierung, Datenanalyse und Validierung von hochreinem HDL-sRNAs.
Das übergeordnete Ziel dieser Arbeit ist es, die Machbarkeit und den Prozess der sRNA Quantifizierung in hochreiner HDL aus menschlichem Plasma isoliert zu demonstrieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll wurde entwickelt miRNAs und andere sRNAs durch Hochdurchsatz-Sequenzierung oder Real-Time PCR auf hochreines HDL zu quantifizieren. Wie bei jedem Ansatz sollte besondere Überlegungen zu jedem Schritt in dem Verfahren zur Reinigung von HDL und RNA und dann sRNAs Quantifizieren gegeben werden. Dieses Protokoll wird für Projekte mit ≥ 2 ml Plasma gestartet wird. Dennoch können qualitativ hochwertige RNA Analysen erfolgreich mit HDL von so wenig wie 80 & mgr; l des menschlichen oder Maus-Plasma unt…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by awards from the National Institutes of Health, National Heart, Lung and Blood Institute to K.C.V. HL128996, HL113039, and HL116263. This work was also supported by awards from the American Heart Association to K.C.V. CSA2066001, D.L.M POST26630003, and R.M.A. POST25710170.
Materials
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A99839 | Optima XPN-80 |
| Ultracentrifuge Rotor | Beckman Coulter | 331362 | SW-41Ti |
| AKTA Pure FPLC System | GE Healthcare | 29018224 | |
| 3X FPLC Superdex 200 Increase Columns In-line | GE Healthcare | 28990944 | 10/300 gl |
| SynergyMx | BioTek Instruments | 7191000 | |
| Tabletop centrifuge | Thermo Scientific | 75004525 | Sorvall ST40R |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 22629867 | 5417R (purchased through USA Scientific) |
| Microfuge | USA Scientific | 2631-0006 | |
| PippenPrep | Sage Science | PIP0001 | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2938B | |
| High Sensitivity DNA Assay | Agilent | 5067-4626 | |
| Sequencing Library qPCR Quantification Kit | Illumina | SY-930-1010 | |
| ProFlex Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4484073 | |
| QuantStudio 12k Flex | Applied Biosystems | 4471134 | |
| EpMotion Robot | Eppendorf | 960000111 | 5070 |
| Ultra-clear centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344059 | |
| Potassium Bromide | Fisher Chemicals | P205-500 | |
| 15 mL conical tube | Thermo Scientific | 339650 | |
| Micro-centrifugal filters 0.45µm | Millipore | UFC30HV00 | |
| Micro-centrifugal filters 0.22µm | Millipore | UFC30GV00 | |
| miRNAEasy Total RNA Isolation Kits | Qiagen | 217004 | |
| Total Cholesterol colormetric kit | Cliniqa (Raichem) | R80035 | |
| 10,000 m.w. cut-off centrifugation filter | Amicon | UFC801024 | purchased through Millipore |
| PCR strip tubes | Axygen | PCR-0208-C | purchased through Fisher |
| microRNA RT kit | Life Technologies | 4366597 | For 1000 reactions |
| PCR master mix | Life Technologies | 4440041 | 50 mL bottle |
| Pierce BCA kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Clean and Concentrator Kit | Zymo | D4014 | |
| Dialysis tubing | Spectrum Labs | 132118 | purchased through Fisher |
| bcl2fastq2 | Illumina | n/a | Software |
| Cutadapt | https://github.com/marcelm/cutadapt | n/a | Software |
| NGSPERL | github.com/shengqh/ngsperl | n/a | Software |
| CQSTools | github.com/shengqh/CQS.Tools | n/a | Software |
| Bowtie 1.1.2 | http://bowtie-bio.sourceforge.net | n/a | Software |
| GeneSpringGX13.1.1 | Agilent | n/a | Software |
Riferimenti
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