Isolamento di lipoproteine ad alta densità per non codificante Piccolo RNA Quantificazione
Summary
This protocol describes the isolation and quantification of high-density lipoprotein small RNAs.
Abstract
La diversità dei piccoli RNA non codificanti (sRNA) è in rapida espansione e il loro ruolo nei processi biologici, tra cui regolazione genica, stanno emergendo. Più interessante, sRNAs si trovano anche al di fuori delle cellule e sono stabilmente presenti in tutti i liquidi biologici. Come tale, sRNAs extracellulari rappresentano una nuova classe di biomarcatori di malattia e sono probabilmente coinvolti nella segnalazione cellulare e reti di comunicazione intercellulare. Per valutare il loro potenziale come biomarcatori, sRNAs possono essere quantificati nel plasma, urine e altri fluidi. Tuttavia, per comprendere appieno l'impatto di sRNAs extracellulari come segnali endocrini, è importante determinare quali vettori trasportano e li protegge nei fluidi biologici (ad esempio, plasma) che cellule e tessuti contribuiscono alle piscine Srna extracellulari, e le cellule e tessuti capaci di accettare e utilizzare extracellulare sRNA. Per raggiungere questi obiettivi, è fondamentale per isolare le popolazioni altamente pure di vettori extracellulariper sRNA profilatura e la quantificazione. Abbiamo precedentemente dimostrato che le lipoproteine, in particolare lipoproteine ad alta densità (HDL), i trasporti microRNA (miRNA) funzionali tra le cellule e HDL-miRNA sono significativamente alterati nella malattia. Qui, abbiamo dettaglio un nuovo protocollo che utilizza tandem isolamento HDL con ultracentrifugazione in gradiente di densità (DGUC) e fast-proteina-cromatografia liquida (FPLC) per ottenere HDL altamente puro per la profilatura a valle e la quantificazione di tutti sRNAs, tra miRNA, utilizzando sia alta sequenziamento -throughput e real-time PCR approcci. Questo protocollo sarà una risorsa preziosa per l'indagine di sRNAs su HDL.
Introduction
Extracellulari non codificante piccoli RNA (sRNAs) rappresentano una nuova classe di biomarcatori di malattia e potenziali bersagli terapeutici e probabilmente facilitare la comunicazione 1 cella-a-cella. Il tipo più ampiamente studiato di sRNA sono microRNA (miRNA), che sono circa il 22 nti di lunghezza e vengono elaborati da forme precursori più lunghi e trascrizioni primari 2. miRNA hanno dimostrato di livello post-trascrizionale regolare l'espressione genica attraverso la soppressione della traduzione di proteine e induzione di mRNA degrado 2. Tuttavia, miRNA sono solo uno dei molti tipi di sRNAs; come sRNAs possono essere scissi dal tRNA controllanti (sRNAs tRNA-derivati, TDR), piccoli RNA nucleari (sRNAs sRNA-derivati, sndRNA), piccoli RNA nucleolari (sRNAs snoRNA-derivati, snRNA), RNA ribosomiale (sRNAs, RDR rRNA-derivati ), Y (RNA YDR), ed altri RNA vari 1. Alcuni esempi di questi nuovi sRNAs sono stati segnalati per funzione simile a miRNA; tuttavia, il fu biologicanctions di molti di questi sRNAs resta da stabilire, anche se i ruoli nella regolazione genica è probabile 3-6. Più interessante, miRNA e altri sRNAs sono stabilmente presenti nei fluidi extracellulari, tra cui la saliva, plasma, urine, e la bile. sRNAs extracellulari sono probabilmente protetti da RNasi attraverso la loro associazione con vescicole extracellulari (EV), lipoproteine, e / o complessi ribonucleoproteici extracellulari.
In precedenza, abbiamo riportato che lipoproteine, cioè lipoproteine ad alta densità (HDL), miRNA di trasporto nel plasma 7. In questo studio, HDL sono stati isolati utilizzando un metodo sequenziale di ultracentrifugazione in gradiente di densità (DGUC), fast-proteina cromatografia liquida (ad esclusione dimensionale gel filtrazione cromatografia FPLC), e cromatografia di affinità (anti-apolipoproteina AI (apoA-I) immunoprecipitazione ) 7. Usando entrambi gli array a bassa densità basati sulla PCR in tempo reale e analisi miRNA individuali, i livelli di miRNA sono stati quantificati sulla HDL isolati da guarirela tua e soggetti ipercolesterolemici 7. Usando questo approccio, siamo stati in grado al profilo miRNA e quantificare miRNA specifici preparati HDL elevata purezza. Dal 2011, abbiamo determinato che, sebbene cromatografia di affinità aumenta HDL purezza, la saturazione degli anticorpi limita fortemente il rendimento, e può essere un costo proibitivo. Attualmente, il nostro protocollo raccomanda un metodo tandem sequenziale in due fasi di DGUC seguito da FPLC, che produce anche i campioni di HDL di alta qualità per il down-stream isolamento RNA e sRNA quantificazione. A causa di recenti progressi nella high-throughput sequenziamento del sRNAs (sRNAseq), ad esempio, miRNA, e la maggiore consapevolezza delle altre classi non miRNA Srna, sRNAseq è l'attuale stato-of-the-art in miRNA e sRNA profiling. Come tale, il nostro protocollo raccomanda miRNA quantificare e altri sRNAs su campioni di HDL utilizzando sRNAseq. Tuttavia, l'RNA totale isolato da HDL può anche essere utilizzato per quantificare i singoli miRNA ed altri sRNAs o convalidare i risultati sRNAseq usando PCR in tempo reale unapproaches. Qui si descrive nel dettaglio un protocollo per la raccolta, la depurazione, la quantificazione, l'analisi dei dati, e la convalida di elevata purezza HDL-sRNAs.
L'obiettivo generale di questo lavoro è quello di dimostrare la fattibilità e il processo di sRNA quantificazione in HDL altamente puro isolato da plasma umano.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo è stato progettato per quantificare miRNA ed altri sRNAs da high-throughput sequencing o real-time PCR altamente puro HDL. Come con qualsiasi approccio, considerazioni speciali dovrebbero essere dati ad ogni fase del processo di purificazione HDL e RNA e quindi quantificare sRNAs. Questo protocollo è stato progettato per i progetti che iniziano con ≥ 2 ml di plasma. Tuttavia, le analisi di RNA di alta qualità possono essere completati con successo con HDL purificato da un minimo di 80 ml di plasma…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by awards from the National Institutes of Health, National Heart, Lung and Blood Institute to K.C.V. HL128996, HL113039, and HL116263. This work was also supported by awards from the American Heart Association to K.C.V. CSA2066001, D.L.M POST26630003, and R.M.A. POST25710170.
Materials
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A99839 | Optima XPN-80 |
| Ultracentrifuge Rotor | Beckman Coulter | 331362 | SW-41Ti |
| AKTA Pure FPLC System | GE Healthcare | 29018224 | |
| 3X FPLC Superdex 200 Increase Columns In-line | GE Healthcare | 28990944 | 10/300 gl |
| SynergyMx | BioTek Instruments | 7191000 | |
| Tabletop centrifuge | Thermo Scientific | 75004525 | Sorvall ST40R |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 22629867 | 5417R (purchased through USA Scientific) |
| Microfuge | USA Scientific | 2631-0006 | |
| PippenPrep | Sage Science | PIP0001 | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2938B | |
| High Sensitivity DNA Assay | Agilent | 5067-4626 | |
| Sequencing Library qPCR Quantification Kit | Illumina | SY-930-1010 | |
| ProFlex Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4484073 | |
| QuantStudio 12k Flex | Applied Biosystems | 4471134 | |
| EpMotion Robot | Eppendorf | 960000111 | 5070 |
| Ultra-clear centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344059 | |
| Potassium Bromide | Fisher Chemicals | P205-500 | |
| 15 mL conical tube | Thermo Scientific | 339650 | |
| Micro-centrifugal filters 0.45µm | Millipore | UFC30HV00 | |
| Micro-centrifugal filters 0.22µm | Millipore | UFC30GV00 | |
| miRNAEasy Total RNA Isolation Kits | Qiagen | 217004 | |
| Total Cholesterol colormetric kit | Cliniqa (Raichem) | R80035 | |
| 10,000 m.w. cut-off centrifugation filter | Amicon | UFC801024 | purchased through Millipore |
| PCR strip tubes | Axygen | PCR-0208-C | purchased through Fisher |
| microRNA RT kit | Life Technologies | 4366597 | For 1000 reactions |
| PCR master mix | Life Technologies | 4440041 | 50 mL bottle |
| Pierce BCA kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Clean and Concentrator Kit | Zymo | D4014 | |
| Dialysis tubing | Spectrum Labs | 132118 | purchased through Fisher |
| bcl2fastq2 | Illumina | n/a | Software |
| Cutadapt | https://github.com/marcelm/cutadapt | n/a | Software |
| NGSPERL | github.com/shengqh/ngsperl | n/a | Software |
| CQSTools | github.com/shengqh/CQS.Tools | n/a | Software |
| Bowtie 1.1.2 | http://bowtie-bio.sourceforge.net | n/a | Software |
| GeneSpringGX13.1.1 | Agilent | n/a | Software |
Riferimenti
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