Hazırlık ve Seri Femtosecond Kristalografi için lipidik Cubic Faz Protein mikro kristallerinin teslimi
Summary
We describe procedures for the preparation and delivery of membrane protein microcrystals in lipidic cubic phase for serial crystallography at X-ray free-electron lasers and synchrotron sources. These protocols can also be applied for incorporation and delivery of soluble protein microcrystals, leading to substantially reduced sample consumption compared to liquid injection.
Abstract
Membran proteinleri (milletvekilleri) hücre zarının ve primer ilaç hedefleri temel bileşenleridir. Akılcı ilaç tasarımı tipik kristalografisi ile elde edilen kesin yapısal bilgilere dayanır; Ancak MP'ler kristalize zordur. MP yapısal belirlenmesinde son gelişmeler Sinkrotron kaynaklarına geleneksel kristalografik veri toplama sırasında radyasyon hasarı muzdarip genellikle iyi kırıcı verim lipidik kübik faz (LCP) kristalizasyon yöntemleri, ama genellikle küçük kristallerin gelişimi büyük ölçüde yararlanmıştır. Yeni nesil X-ışını serbest elektron lazeri (XFEL) son derece parlak femtosaniye darbeleri üreten kaynakların geliştirilmesi ya da hiç ihmal edilebilir radyasyon hasarı olan mikro kristalleri gelen oda sıcaklığı veri toplama sağladı. Seri femtosaniye kristalografisi (LCP-SFX) LCP teknolojiyi birleştirerek Bizim son çalışmalar W, çeşitli insan G proteini ile birleştirilmiş alıcıların yüksek çözünürlüklü yapıları sonuçlanmıştırhich yapı tayini için oldukça zordur hedef temsil etmektedir. LCP SFX teknikte, LCP kristalografik bir veri toplama XFEL demetiyle enjektör akımının kesişme MP mikro hem büyüme ve dağıtımı için bir matris olarak işe. Sadece alt 10 mikron kristalleri mevcut olduğunda LCP SFX büyük ölçüde veya, kırınım çözünürlüğünü artırabilir gösterilmiştir, oda sıcaklığında küçük kristalleri kullanılması bu kusurlar birikimi gibi daha büyük cryocooled kristaller ile ilişkili çeşitli problemlerin üstesinden varken, yüksek mosaicity ve cryocooling eserler. X-ışını kaynakları ve dedektör teknolojileri gelecekteki gelişmeler XFELs değil, aynı zamanda daha erişilebilir sinkrotron ışın demetleri değil sadece uygulama için seri kristalografisi son derece çekici ve uygulanabilir yapmalıdır. Burada seri kristalografi deneyler için LCP hazırlık, karakterizasyonu ve mikro kristallerin teslimat için detaylı görsel protokoller sunuyoruz.Bu protokoller, şırıngalar içinde kristalleşme deneylerini tespit ve kristal örnekleri karakterize, kristal yoğunluğu optimize enjektör cihazın içine mikro kristal yüklü LCP yükleme ve veri toplama için kiriş numunenin teslim yöntemlerini içerir.
Introduction
X-ışını kristalografisi membran proteinleri (milletvekilleri) atom çözünürlüklü yapılarını çözmek için bugüne kadar en başarılı tekniktir. Veya, mezo kristalleşme de lipidik kübik faz (LCP) olarak bilinen lipidik Mezofazların, kristalizasyon gibi G protein-eşli reseptörler gibi zorlu hedeflerin yüksek çözünürlüklü yapı tespitine sağladı MP kristalografisi önemli gelişmelerden birini (GPCR'ler temsil ) 1. LCP araçları ve teknolojileri ile ilgili son gelişmeler, dünya çapında 2 yapısal biyologlar büyük bir topluluk için kullanılabilir bu tekniği yaptık. Ancak, birçok durumda LCP formu MP kristalleri yüksek çözünürlükte yeterli sinyal 3 elde edilebilir önce numuneler şiddetli radyasyon hasar ve bozulmalara muzdarip bile en gelişmiş Mikrofokus Sinkrotron ışın demetleri, kullanılmak üzere çok küçüktür.
kristalografik veri toplama için yeni bir yaklaşımİlk X-ışını serbest elektron lazeri (XFEL) devreye ile sağlanmıştır. Yöntemi "yıkımından önce kırınım" ilkesi, ilk teorik 4 tanıtıldı ve ardından Linac Tutarlı Işık Kaynağı (LCLs'in) 3, sert XFELs dünyanın öncü biyolojik örnekler üzerinde deneysel olarak doğrulandı dayanmaktadır. Bir XFEL protein atomları radyasyon hasarına yanıt olarak hareket edebilir önce bozulmamış kristalden yaymak femtosaniye süreli birkaç on içinde yüksek parlaklık X-ışını darbeleri üretir. İlk deneylerde, mikro sürekli bir sıvı enjektörü 5 tarafından üretilen bir sıvı akım içinde XFEL ışını ile kesiştiği için temin edilmiştir. Bu deney düzeneği seri femtosaniye kristalografisi (SFX) olarak bilinir. SFX'e için sıvı enjektörler ile temel dezavantaj bunun sonucu olarak tam bir veri seti toplanması için saflaştırılmış protein miligramı On ila yüzlerce gerektirir yüksek akış hızı vardır. emp tarafındanönemli ölçüde azaltılmış protein ile, 9 – jel benzeri LCP örnekleri işleyebilir bir özel enjektörü (LCP microextrusion enjektör) 6 loying, başarılı bir LCP matris içinde yetiştirilen çeşitli insan GPCRs mikro kristalleri teslim ve yüksek çözünürlüklü yapıları 6 elde veri kümesi başına 0.3 altında mg tüketimi. Enjektör kadar 20, 40 ya da 100 bir kristal yüklü LCP ul ve örnek (10,000 kadar bir yüksek basınç uygulanması ile ekstrüde edilen ile dar bir kapiler tüp (çapı 10-50 um) sahip bir hazne oluşur HPLC (yüksek performanslı sıvı kromatografisi) pompadan bir sıvı ile tahrik edilen basınç güçlendirilmiş aşaması ile, bir hidrolik pistonun, pSI). Kılcal memeden çıkan LCP akımı, reaktif olmayan gaz (tipik olarak helyum ya da azot) paralel bir akış ile stabilize edilir.
Burada biz hazırlamak ve örnekleri karakterize için gerekli adımların görsel gösteriler sağlamakBir LCP-SFX deney için. Ek ayrıntılar yayınlanan protokolleri 10 bulunabilir. Bir örnek olarak, SFX yaklaşımı kullanan bir X-ışını veri toplama için LCP bu protein kristaller adenozın A2A reseptör 11 kullanımı ve hazırlayacaktır. Bizim protokoller XFEL ve sinkrotron kaynaklarında seri kristalografisi veri toplama LCP akışı yeteneğine sahip herhangi bir enjektör ile uyumlu olmasına karşın, illüstrasyon amaçları için, biz Ref açıklanan LCP enjektörü kullanacaktır. LCP yüksek yoğunluklu mikro kristalleri üretmek 6. Optimize Yağışlı koşulları yüksek verimli kristalleşme bu protokol geçmeden önce 12,13 tarama ile tespit edilmelidir. Bu protokol için tipik bir akış şemasıdır, Şekil 1 'de gösterilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada açıklanan protokoller bir LCP enjektör ile standart LCP-SFX deney için numune hazırlama prosedürünün bir genel hatlarıyla sağlar. Mikro kristal boyutuna bağlı olarak; bizim deneyime dayalı, tam bir veri kümesi toplama için gerekli nihai mikro-yüklü LCP örneğin toplam miktarı tipik olarak 50-100 ul (ilk protein yüklü LCP örneği 25-50 ul Tablo 1) , kalite ve yoğunluk. Her 100 ul gaz geçirmez bir cam şırınga uygun ve LCP olarak çökeltme çözeltisi da yayılmasını sağlamak için tam olarak uzatılmış bir ip halindeki LCP 7 ul yerleştirilebildiğinden, şırıngalar, en az 4-7 numuneleri hazırlanmalıdır her LCP-SFX deneyi.
çapı, kılcal dar 20-50 um ile ekstrüze edildiği için, numune içinde herhangi bir partikül madde önlemek için çok önemlidir. bazen LCP tanıtılan olabilir tozlar ve liflerörnek veya Yağışlı çözümleri enjektör kılcal tıkayabilir ve deney sırasında aşağı süresini uzatabilir. Bu nedenle, numune hazırlama önce 5 um gözenekli filtreden lipid ve bütün solüsyonlar filtre önemlidir. İsteğe bağlı olarak, temiz bir oda ya da taşınabilir bir temiz oda kapağı numune hazırlama için kullanılabilir.
Bu protokoller MP kristalleşme için ev sahibi lipid olarak 9.9 MAG (monoolein) kullanılarak dayanmaktadır. Bununla birlikte, 9.9 MAG sınırlı değildir ve kolay bir şekilde dikkate lipit fazı davranış farklılıkları aldıktan sonra başka bir LCP ana lipidler veya lipid karışımları uyarlanabilir. LCP içinde kristalize milletvekillerinin yapıların çoğu 9.9 MAG şimdiye kadar 15 en başarılı temsilcisi olan, mag birini kullanarak elde edilen bulundu. SFX'e 9.9 MAG kullanmanın dezavantajı veri toplama vakumla gerçekleştirilir sık sık oluşan, 18 ° C'nin altında soğutulduktan sonra katmanlı bir kristal faza olan geçiştir. titrati7.9 MAG bu protokolün Bölüm 5'te açıklanan ile bu soruna iyi bir çözüm sağlar. Bizim tecrübelerimize göre, kristaller herhangi bir olumsuz etkisi olmadan böyle bir titrasyon dayanabilir. Bununla birlikte, 7.9 MAG veya başka bir kısa-zincirli MAG eklenmesi arzu edilmez ise, titrasyon 9.9 MAG ile gerçekleştirilebilir. Bu durumda, vakum içinde enjeksiyon sırasında LCP akışını stabilize gaz daha az stabil numune akışını sahip pahasına, en örneklerde kristalli lipit fazının oluşumunu önleyebilir, azot, helyum arasından açık olmalıdır.
Modern XFEL ve sinkrotron kaynakları, seri kristalografi veri toplama için müsait geniş bir dizi kristal akış hızı, ayarlanmasını sağlar çünkü LCP jel benzeri kıvama bir kristal taşıyıcı ortam olarak kullanım için büyük bir avantaja sahiptir. kadir c emriyle kristal tüketiminin dramatik azalma XFEL darbe tekrarlama oranı sonuçları ile kristal debisini EşleştirmeSıvı enjeksiyon ompared. LCP değil, aynı zamanda, çözünür proteinler 21 kristalleri için, sadece içinde yetiştirilen MP kristallerinin verilmesi için uygun bir taşıyıcı ortam. Seri kristalografi deneyler için araçlar ve reaktif bir cephanelik uzanan 24 – Çeşitli alternatif viskoz kristal taşıyıcı basında son zamanlarda 22 girmiştir. Ayrıca, kristal dağıtım ortamı olarak LCP seri kristalografi en az iyi kırılma kristaller 24,25, geleneksel sinkrotron kaynaklarına gösterilmiştir. detektör teknolojileri X-ışını büyüklüğe göre yoğunluğunu yanı sıra iyileştirmeler artırmak sinkrotron kaynaklarının gelecek yükseltmeleri, seri kristalografi yapı tayini için daha erişilebilir ve çekici bir yöntem yapacaktır.
LCP-SFX MP yapısal tespiti için onun kudret göstermiştir. nerede l (örneğin GPCRs veya makromoleküler kompleksleri gibi) zorlu biyolojik sistemler içinsadece, uygun bir seçenek atom çözünürlüklü yapısını çözmek için eğer arge, kırınım kaliteli kristalleri büyür zordur, LCP-SFX, çekici sağlayabilir. Tüm avantajları, yani, MP kristalleşme ve kristal doğum, düşük protein tüketimi, radyasyon hasarı olmaması, oda sıcaklığı veri toplama, zamana bağımlı çalışmaların 26,27 olanakları ve hiçbir kristal hasat gereksinimi, LCP- için matris olarak LCP kullanarak SFX yapısal biyoloji gelecekte önemli bir rol oynamalıdır.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma R01 GM108635 ve U54 GM094618, Mayo Clinic-ASU İşbirlikçi Tohum Hibe Ödülü ve NSF STC ödülü 1231306. Biz yazının hazırlanmasında yardım için A. Walker teşekkür Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından hibe desteklenmiştir.
Materials
| LCP host lipid monoolein (9.9 MAG) | Nu Chek Prep | M239 | Hosting lipid for the protein to be crystallized |
| LCP host lipid monoolein (9.9 MAG) | Sigma | M7765 | Hosting lipid for the protein to be crystallized |
| LCP host lipid monopalmitolein (9.7 MAG) | Nu Chek Prep | M219 | Hosting lipid for the protein to be crystallized |
| LCP host lipid 7.9 MAG | Avanti Polar Lipids | 850534 | Hosting lipid for tiration to avoid lamellar crystal phase (Lc) formation during sample injection |
| Purified protein solution concentrated to 20-50 mg/mL | Target protein | ||
| Chloroform | Fisher Scientific | C606-1 | Used to dissolve lipids |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 179337-500ML | Used to wash syringes |
| Eleven 100 mL Hamilton gas-tight syringes without needles | Hamilton | 7656-01 | For LCP preparation |
| Eight syringe couplers | Hamilton | SKU 209526 | For LCP preparation |
| Removable flat-tipped needle | Hamilton | 7804-01 | For LCP dispensing |
| Parafilm | Parafilm | M', 250' x 2" | Used for syringe sealing |
| Lint free lens cleaning tissues | Fisher | NC9592151 | |
| Centrifugal filter tubes, Ultrafree-MC, 0.5 mL, Durapore 5 µm | Millipore | UFC3 0SV 00 | Used for filtering of precipitant solutions and lipids |
| Microscope slides, 1 inch x 3 inch | GoldSeal | 3010 | |
| Two wash bottles with fine tips. One filled with milli-Q or distilled water, the other with methanol | VWR | 89094-640 | These are used to clean the syringes, needles and coupler. Methanol is used first, then water. |
| Gloves | Microflex | XC-310-L | For blow drying syringes, needles, ferrules, and couplers |
| Safety glasses | |||
| Pressurized air cans | Office Depot (Dust-Off) | 527494 | For syringe cleaning |
| Dry block heater with a digital temperature controller | Fisher | 11-720-10BQ | Used for thawing lipids |
| Benchtop Centrifuge | Fisher | 05-413-340 | Spinning down solutions |
| Clean Room Mini – 12 inch Portable Positive Pressure Hood with HEPA filter | Sentry Air Systems, Inc. | SS-112-PCR | Cleaning sample preparation |
| Stereo zoom microscope equipped with a linear polarizer and rotating analyzer | Nikon | SMZ1500 | Crystal density check |
| UV microscope | JAN Scientific | UVEX-P | Optional, for crystal imaging purposes |
| SHG imager | Formulatrix | SONICC | Optional, for crystal imaging purposes |
Riferimenti
- Cherezov, V., et al. High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor. Science. 318 (5854), 1258-1265 (2007).
- Cherezov, V. Lipidic cubic phase technologies for membrane protein structural studies. Curr Opin Struc Biol. 21 (4), 559-566 (2011).
- Chapman, H. N., et al. Femtosecond X-ray protein nanocrystallography. Nature. 470 (7332), 73-77 (2011).
- Neutze, R., Wouts, R., van der Spoel, D., Weckert, E., Hajdu, J. Potential for biomolecular imaging with femtosecond X-ray pulses. Nature. 406 (6797), 752-757 (2000).
- DePonte, D. P., et al. Gas dynamic virtual nozzle for generation of microscopic droplet streams. J Phys D Appl Phys. 41 (19), 195505 (2008).
- Weierstall, U., et al. Lipidic cubic phase injector facilitates membrane protein serial femtosecond crystallography. Nat Commun. 5, 3309 (2014).
- Fenalti, G., et al. Structural basis for bifunctional peptide recognition at human δ-opioid receptor. Nat Strcut Mol Biol. 22 (3), 265-268 (2015).
- Liu, W., et al. Serial femtosecond crystallography of G protein-coupled receptors. Science. 342 (6165), 1521-1524 (2013).
- Zhang, H., et al. Structure of the Angiotensin Receptor Revealed by Serial Femtosecond Crystallography. Cell. 161 (4), 833-844 (2015).
- Liu, W., Ishchenko, A., Cherezov, V. Preparation of microcrystals in lipidic cubic phase for serial femtosecond crystallography. Nat Protoc. 9 (9), 2123-2134 (2014).
- Liu, W., et al. Structural basis for allosteric regulation of GPCRs by sodium ions. Science. 337 (6091), 232-236 (2012).
- Caffrey, M., Cherezov, V. Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases. Nat Protoc. 4 (5), 706-731 (2009).
- Liu, W., Cherezov, V. Crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases. J Vis Exp. (49), (2011).
- Li, D., Shah, S. T. A., Caffrey, M. Host Lipid and Temperature as Important Screening Variables for Crystallizing Integral Membrane Proteins in Lipidic Mesophases. Trials with Diacylglycerol Kinase. Cryst Growth Des. 13 (7), 2846-2857 (2013).
- Caffrey, M., Lyons, J., Smyth, T., Hart, D. J. Monoacylglycerols: The Workhorse Lipids for Crystallizing Membrane Proteins in Mesophases. Current Topics in Membranes. 63, (2009).
- Kulkarni, C. V., Wachter, W., Iglesias-Salto, G., Engelskirchen, S., Ahualli, S. Monoolein: a magic lipid?. Phys Chem Chem Phys. 13 (8), 3004-3021 (2011).
- Kissick, D. J., Gualtieri, E. J., Simpson, G. J., Cherezov, V. Nonlinear optical imaging of integral membrane protein crystals in lipidic mesophases. Anal Chem. 82 (2), 491-497 (2010).
- James, D. . Injection Methods and Instrumentation for Serial X-ray Free Electron Laser Experiments. , 1-126 (2015).
- Kang, Y., et al. Crystal structure of rhodopsin bound to arrestin by femtosecond X-ray laser. Nature. 523 (7562), 561-567 (2015).
- Rasmussen, S. G. F., et al. Crystal structure of the β2 adrenergic receptor-Gs protein complex. Nature. 477 (7366), 549-555 (2011).
- Fromme, R., et al. Serial femtosecond crystallography of soluble proteins in lipidic cubic phase. IUCrJ. 2 (Pt 5), 545-551 (2015).
- Sugahara, M., et al. Grease matrix as a versatile carrier of proteins for serial crystallography. Nat Meth. 12 (1), 61-63 (2014).
- Conrad, C. E., et al. A novel inert crystal delivery medium for serial femtosecond crystallography. IUCrJ. 2 (Pt 4), 421-430 (2015).
- Botha, S., et al. Room-temperature serial crystallography at synchrotron X-ray sources using slowly flowing free-standing high-viscosity microstreams. Acta Crystallogr Sct D. 71 (Pt 2), 387-397 (2015).
- Nogly, P., et al. Lipidic cubic phase serial millisecond crystallography using synchrotron radiation. IUCrJ. 2, 168-176 (2015).
- Tenboer, J., et al. Time-resolved serial crystallography captures high-resolution intermediates of photoactive yellow protein. Science. 346 (6214), 1242-1246 (2014).
- Kupitz, C., Basu, S., Grotjohann, I., Fromme, R. Serial time-resolved crystallography of photosystem II using a femtosecond X-ray laser. Nature. 513, 261-265 (2014).
