Verfahren für Adaptive Labor Entwicklung von Mikroorganismen Mit einem Chemostat
Summary
mit Chemostatkultur Hier präsentieren wir ein Protokoll adaptive gerichtete Evolution von Mikroorganismen unter Bedingungen zu erhalten. Auch genomische Analyse des entwickelten Stamm wird diskutiert.
Abstract
Natural evolution involves genetic diversity such as environmental change and a selection between small populations. Adaptive laboratory evolution (ALE) refers to the experimental situation in which evolution is observed using living organisms under controlled conditions and stressors; organisms are thereby artificially forced to make evolutionary changes. Microorganisms are subject to a variety of stressors in the environment and are capable of regulating certain stress-inducible proteins to increase their chances of survival. Naturally occurring spontaneous mutations bring about changes in a microorganism’s genome that affect its chances of survival. Long-term exposure to chemostat culture provokes an accumulation of spontaneous mutations and renders the most adaptable strain dominant. Compared to the colony transfer and serial transfer methods, chemostat culture entails the highest number of cell divisions and, therefore, the highest number of diverse populations. Although chemostat culture for ALE requires more complicated culture devices, it is less labor intensive once the operation begins. Comparative genomic and transcriptome analyses of the adapted strain provide evolutionary clues as to how the stressors contribute to mutations that overcome the stress. The goal of the current paper is to bring about accelerated evolution of microorganisms under controlled laboratory conditions.
Introduction
Mikroorganismen können auf unterschiedliche Umgebungen überleben und sich anzupassen. Unter starkem Stress, Anpassung kann 1-3 über Erwerb von positiven Phänotypen durch statistische genomische Mutationen und anschließende positive Selektion auftreten. Daher kann mikrobiellen Zellen anzupassen durch metabolische oder regulatorische Netzwerke für ein optimales Wachstum zu ändern, die "adaptive Evolution" bezeichnet wird. Vor kurzem sind wichtige mikrobielle Tendenzen, wie Ausbrüche von Superbugs und dem Auftreten von robusten mikrobielle Stämme, sind sehr eng miteinander verbunden Evolution unter Stressbedingungen zu adaptiv. Unter definierten Laborbedingungen, sind wir die Mechanismen der molekularen Evolution zu studieren können und sogar die Richtung der mikrobiellen Evolution für verschiedene Anwendungen zu steuern. Im Gegensatz zu mehrzelligen Organismen sind einzellige Organismen gut geeignet, um adaptive Labor Entwicklung (ALE) aus den folgenden Gründen: sie regenerieren schnell, sie pflegen große Populationen, und es ist leicht hom zu erstellen und zu pflegenogeneous Umgebungen. In Kombination mit den jüngsten Fortschritten in der DNA-Sequenzierungstechniken und Hochdurchsatz-Technologien, ermöglicht ALE für die direkte Beobachtung von genomischen Veränderungen, die zu einer systemischen regulatorischen Veränderungen führen. Mutations Dynamik und Vielfalt der Bevölkerung sind auch zu beobachten. Die Gentechnik – Strategien können aus der Analyse der ALE – Stämme 4,5 bestimmt werden.
Chemostatkultur ist eine Methode verwendet Steady-State – Zellen zu erhalten und die Produktivität bei Fermentationsprozessen 6 erhöhen. Frisches Medium wird zugesetzt und Kulturbrühe wird während des Verfahrens geerntet (letzteres enthält Medium und Biomasse). Langzeit Chemostat – Kultur, ändert jedoch den steady-state Produktivität der Kultur und bewirkt die Anhäufung von spontanen Mutationen und Selektion während der Kultivierung (Abbildung 1a). Unter verschiedenen Selektionsdruck (Stressoren), wird die Akkumulation von Mutationen verbessert. Eine allmähliche Zunahme der Spannung in einem langfristigen Chemostat sorgt für eine kontinuierliche Auswahl von Mutationen , die gegen den gegebenen Stressoren arbeiten, wie beispielsweise Temperatur, pH, osmotischer Druck, Nährstoffmangel, Oxidation, toxische Endprodukte usw. Colony Übertragung von einem festen Medium und serielle Übertragung aus einem flüssigen Medium (wiederholte Batch – Kultur) erlauben auch Forscher entwickelten Mikroorganismen (Abbildung 1b und 1c) zu erhalten. Obwohl Chemostatkultur komplizierte Methoden erfordert, ist der Pool der Vielfalt (Anzahl der Replikationen und Populationsgröße) höher als die durch Kolonie-Transfer und serielle Übertragungstechniken erhalten. Die stabile Stressbelastung auf einzelne Zellen und verringerte Veränderung der zellulären Zustand während Chemostatkultur (Steady State) sind weitere Vorteile von ALE im Vergleich zu Batch-Kultur-basierte Techniken. Stress-induzierten ALE von Escherichia coli zu hoher Succinat Bedingungen unterworfen wird in diesem Artikel eingeführt.
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Abbildung 1: Methoden der adaptiven Labor Evolution (A) Chemostat;. (B) eine serielle Übertragung; (C) Kolonie übertragen. Die Top – Zahlen das Konzept der Methoden für das ALE illustrieren, und die unteren Zahlen die Anzahl der Zellen darstellen , die während ALE wuchs. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mikroorganismen sind in der Lage aufgrund ihrer schnellen Wachstumsrate und der genetischen Vielfalt zu fast allen Umgebungen anzupassen. Adaptive Laborentwicklung ermöglicht Mikroorganismen unter Bedingungen entwickelt, zu entwickeln, die eine Möglichkeit der Auswahl der einzelnen Organismen beherbergt spontane Mutationen bereit, die unter den gegebenen Bedingungen von Vorteil sind.
Die chemostat Technik ist robuster für den folgenden Gründen künstlich angetrieben Evolution als Übertr…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was financially supported by the Korean Ministry of Science, ICT and Future Planning (Intelligent Synthetic Biology Center program 2012M3A6A8054887). P. Kim was supported by a fellowship from the Catholic University of Korea (2015).
Materials
| Mini-chemostat fermentor | Biotron Inc. | – | manufactured by special order |
| silicon tubing | Cole-Parmer | Masterflex L/S 13 | tubing size can be varied depending on the dilution rate and the size of fermentor jar. |
| reservoir jar | Bellco | Media storage bottle | 20 L |
| chemicals | Sigma-Aldrich | – | reagent grade |
| glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | ACS reagent |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 | for molecular biology, suitable for cell culture, ≥99.5% |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 746398 | ACS reagent, ≥99% |
| Na2HPO4·2H2O | Sigma-Aldrich | 4272 | 98.5-101% |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 795488 | ACS reagent, ≥99% |
| MgSO4·7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | ACS reagent, ≥98% |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 793639 | ACS reagent, ≥96% |
| thiamine·HCl | Sigma-Aldrich | T4625 | reagent grade, ≥99% |
| Na2·succinate·6H2O | Sigma-Aldrich | S2378 | ReagentPlus, ≥99% |
Riferimenti
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