Transplantation Dans le tapis de souris ovarien Fat

Tout le travail in vivo décrit est approuvé par le Comité institutionnel de protection et de l'utilisation des animaux de l'Université Cornell. 1. Exemples de préparation pour l'ovaire Fat Pad Assays Isolement et culture de primaire Tubal épithélium (TE) Cellules Euthanasier donneur de 6 à 8 semaines d'âge vierge β-actine-Enhanced Green Fluorescent Protein (EFGP) ou Red Fluorescent Protein (DsRed) souris β actine-Discosoma par CO 2 l' administration suivie par dislocation cervicale. Vérifier l'euthanasie réussie par un pincement de l'orteil. Placez une souris individuelle sur un drap absorbant, ventrale vers le haut, puis essuyez l'abdomen avec 70% d'éthanol. Ouvrir la peau par une incision latérale au niveau de la ligne médiane du corps et du bout des doigts tirer la peau au-dessus et au-dessous de l'incision en direction de la tête et la queue de la souris. Tenir le péritoine en utilisant une pince contondants et faire une coupe avec des ciseaux fins pour ouvrir la cavité du corps. Poussez doucement la bobine de l'intestine de côté et localiser les organes reproducteurs. Avec une pince fine ramasser une corne utérine et couper 0,5 cm au-dessus du point où les cornes utérines séparent. Tout en maintenant la corne utérine, disséquer le tissu conjonctif attaché à la corne de l'utérus, trompe utérine, coussinet adipeux de l'ovaire et de l'ovaire. Placer l'appareil reproducteur disséquée dans un plat avec 6 ml stérile saline tamponnée au phosphate (PBS). Procéder à la deuxième appareil reproducteur. Transférer le plat à une armoire de biosécurité et laver les tissus 3 fois dans 6 ml de PBS stérile. Poursuivre le travail sous un microscope de dissection situé dans l'armoire de biosécurité. Prenez la corne de l'utérus avec une pince fine et déconnecter la corne utérine de la trompe utérine en coupant à la jonction utéro-tubaire. Découpez la bourse ovarienne entourant l'ovaire à l'aide d'une aiguille 25 G. Remarque: Après la bourse ovarienne a été supprimé, la dissection est terminée et le tube individuel de l'utérus reste dans la solution PBS. Transférer un single tube de l'utérus dans une goutte de 50 pi de PBS à un plat de 3,5 cm et émincer en morceaux de 0,1 mm en utilisant 28 aiguilles de calibre. Transfert à 200 pi de tampon de digestion 1 (Modified Medium (DMEM) F12 de Eagle de Dulbecco () du milieu de Ham additionné de 300 unités ml – 1 collagénase et de 100 unités ml – 1 hyaluronidase) et incuber pendant 1 heure à 37 ° C dans 5% de CO 2 incubateur. Après l'incubation, ajouter 1 ml de 0,25% trypsine-Ethylenediaminetetraacetic acide (EDTA) et de suspendre la solution à l'aide d'une pointe de pipette 1 ml (aka pointe bleue) 20 fois pendant 3 minutes. Ajouter 5 ml + 4 ° C DMEM / F12 de milieu (Ham) contenant 2% de sérum de foetus de bovin. Collecter des tissus par centrifugation (600 fcr, 5 minutes, température ambiante (TA)) et ajouter un tampon de digestion de 1 ml 2 (DMEM F12 () du milieu de Ham additionné de 7 mg ml -1 dispase II et 10 pg ml – 1 de la désoxyribonucléase I ( désoxyribonucléase I)). Suspendre pastille de tissu 20 fois avec l'aide d'une pipette de 1 ml tip. Ajouter un milieu complet gratuit 5 ml de sérum de croissance souris épithélium tubaire (M-TE-GM, le tableau 1). Recueillir les cellules par centrifugation (600 rcf, 5 min, RT). Ajouter 1 ml M-TE-GM, suspendre et compter les cellules par hémocytomètre. Seed 1 x 10 5 cellules dans 1 ml par puits dans une plaque de fixation 24 puits à faible et incuber dans M-TE-GM à 37 ° C dans un incubateur à CO 2 de 5% pendant 4 jours. Changer le milieu tous les jours. Préparer des suspensions de cellules uniques de cellules cultivées en suspension primaire TE à partir de souris ß-actine-EGFP ou β-actine DsRed. Recueillir des cultures en suspension TE de 24 puits de plaques de fixation faibles. Centrifugeuse (600 fcr, 5 min, RT) et suspendent les culots cellulaires avec 1 ml de 0,25% de trypsine-EDTA. Incuber pendant 10 min à 37 ° C dans un incubateur à CO2 à 5%. Arrêter l'activité de la trypsine en ajoutant 5 ml de DMEM / F12 de moyenne (Ham) contenant 5% de sérum bovin foetal. Recueillir les culots cellulaires par centrifugation (600 fcr, 5 min, RT). culots cellulaires Laver deux fois avec 4 ml de PBS froid (4 ° C), ajouter 1 ml de PBS par culot cellulaire, et suspendre. Compter les cellules par hémocytomètre et transférer 1,7 ml tubes de centrifugation. Travailler sur la glace, ajouter 1 x 10 5 cellules à 10 pi de PBS, puis ajouter 10 ul matrice de membrane basale. Suspendre et transporter sur de la glace à la salle des animaux. Remarque: Effectuer toutes dissection et tissus travaux de culture dans une armoire de biosécurité dans des conditions stériles. Préparation de Immortalisé Human Cell Line Cultiver séparément lentivirus EGFP et -mCherry marqué immortalisée surface de l' ovaire lineHIO118 de cellules de l' épithélium humain jusqu'à 80-90% de confluence sur les boîtes de 10 cm à 37 ° C dans un incubateur à CO2 à 5%. Laver la vaisselle à deux reprises avec 10 ml de PBS, ajouter 1 ml de 0,25% de trypsine-EDTA par boîte et on incube pendant 10 min à 37 ° C dans un incubateur à CO2 à 5%. Arrêter la réaction en ajoutant 10 ml de DMEM / F12 de moyenne (Ham) contenant 5% de sérum bovin foetal. Collecteculots cellulaires par centrifugation (600 RCF, 5 min, RT). culots cellulaires Laver deux fois avec 10 ml de PBS froid (4 ° C), ajouter 1 ml de PBS par culot cellulaire, et suspendre. Compter les cellules par hémocytomètre et transférer 1,7 ml tubes de centrifugation. Travailler sur la glace, ajouter 1,0 x 10 6 cellules Lenti-mCherry marqués + 1,0 x 10 6 Lenti-EGFP étiquetés cellules à 10 ul de PBS. Ajouter 10 ul de la matrice de membrane basale. Suspendre et transporter sur de la glace à la salle des animaux. Préparation de la trompe utérine Disséquer tubes utérins individuels de 6 à 8 semaines vieilles souris vierges β-actine-DsRed dans PBS comme décrit dans les étapes 1.1.1-1.1.5. Transférer les trompes utérines uniques dans une goutte 200 ul de PBS sous un microscope de dissection. dérouler doucement trompes utérines à l'aide d'une pince à épiler et 28 des aiguilles de calibre en retirant la mésosalpinx, une partie du ligament large qui supporte les segments de la trompe utérine. Placez trompes utérines spiralées simples dans une goutte de 2PBS 00 ul glacée jusqu'à ovarien coussinet adipeux du destinataire est exposée et prête à recevoir la greffe. 2. ovarien Fat Pad Transplantation Note: Désinfecter instruments entre chaque chirurgie animale. Préparer et organiser tout le matériel à l'avance. transplantations dorsaux à droite coussinet adipeux de l'ovaire sont préférentiel car cela évite la rate. Cependant, les bénéficiaires peuvent avoir des greffes dans les deux coussinets adipeux ovariens. Utiliser des souris syngéniques ou déficit immunitaire combiné sévère (SCID / RNC) souris en tant que bénéficiaires de cellules primaires. Pour les cellules humaines, telles que HIO118 cellules / SCID / gamma souris utilisation Nod (NSG) ou des souris SCID. Anesthésier souris receveuse avec une seule injection intra-péritonéale de 2,2,2-tribromoéthanol à une dose de 0,15 ml / 10 poids corporel g. Placez l'animal sur un coussin chauffant, dans la hotte des animaux et confirmer anesthetization appropriée par la perte de la pédale réflexe (pincement de l'orteil). Appliquer vétérinaire pommade sur les yeux pour prévenir la sécheresse alors que leanimal est sous anesthésie. Injecter la voie sous-cutanée de l'animal avec le kétoprofène analgésique à une dose de 4 mg / g de poids corporel pour traiter la douleur post-chirurgicale. Remarque: Comme alternative, utilisez isoflurane pour l'anesthésie. Placer l'animal dans la chambre d'admission et d'ajuster le débitmètre d'oxygène de 0,8 à 1,5 l / min et le vaporisateur isoflurane à 2-3%. Retirer l'animal anesthésié de la chambre, laissez-le respirer isoflurane à partir d'un masque et régler le débitmètre d'oxygène à 0,4-0,8 L / min et le vaporisateur isoflurane à 1,5%, puis commencer à la chirurgie. Rasez la zone chirurgicale avec # 40 coupe; enlever les poils d'une zone 2 fois la surface chirurgicale, préparer la peau rasée avec trois gommages antiseptiques de povidone-iode, suivie par 70% d'éthanol, et couvrir d'un drap stérile. Déplacer l'animal sous un microscope de dissection situé dans une armoire de biosécurité. Exposer l'appareil reproducteur par une incision dans la position dorso directement au-dessus du coussinet adipeux de l'ovaire. Remarque: Critétape ical: Precise incision cutanée facilite la cicatrisation des plaies, l'utilisation d'un scalpel est recommandé à l'étape 2.4. Utiliser une pince fine contondants tirer le coussinet adipeux ovarien soigneusement à travers l'incision vers la ligne médiane, minimisant les dommages aux nerfs et les vaisseaux sanguins principaux. Etape critique: En cas de saignement, arrêter la chirurgie et envisager la transplantation d'un animal hôte différent. Sous le contrôle du microscope de dissection avec l'aide d'une aiguille biseautée de calibre 28 faire un 2-4 mm incision profonde dans le coussinet adipeux de l'ovaire, 3-4 mm au-dessus de l'ovaire. étape critique: Assurez-vous que l'incision va seulement à travers la moitié du coussinet adipeux; poinçonnement tout le long de la face inférieure provoque des fuites. Soyez rapide et procéder sans délai après cette étape. Pour les greffes de cellules, remplir une seringue (aiguille de calibre 30) avec 10-20 ul de la cellule-membrane basale matrice du mélange et injecter dans le pad incision graisse. Pour trompe utérine transplantation, ramasser l'esprit du tube utérinh pince fine et dans 10 – 20 ul matrice de membrane basale conservés dans la glace. L'utilisation d'un pl 0,1-10 / 20 XL diplômé pointe de filtre (raccourci de 3 mm) ramasser le tissu et la membrane basale matrice suspension et la libération dans l'incision de coussinet adipeux. Attendre 5 minutes pour la matrice de la membrane basale de se solidifier et placer l'appareil reproducteur de retour dans le péritoine. Fermez les muscles avec 2 stiches de suture chirurgicale et la peau avec deux clips de petites plaies ou suture chirurgicale. Répétez les étapes 2,4-2,8 transplanter une membrane PBS-sol matrice-mélange dans le coussinet adipeux contre-latéral de l'animal qui servira de contrôle. étape critique: Après la chirurgie placer l'animal sur un coussin chauffant, parce que la perte de chaleur est rapide chez les souris anesthésiés. Laissez l'animal récupérer sur un coussin chauffant dans la cage native et d'observer l'animal jusqu'à complètement réveillé de l'anesthésie. Ne pas laisser un animal sans surveillance jusqu'à ce qu'il ait repris connaissance suffisante pour maintenir sternal décubitus. Ne retournez pas un animal qui a subi une intervention chirurgicale à la compagnie d'autres animaux jusqu'à guérison complète. Placez une poignée de boulettes de nourriture pré-humides à l'intérieur de la cage, en plus de la nourriture sèche sur la cage après la chirurgie. Appliquer les analgésiques post-chirurgicales en cas de besoin pour les prochains jours et examiner la plaie quotidienne. Appliquer des antibiotiques selon le protocole animal approuvé si l'infection des plaies se produit. Retirer des agrafes 10 jours après la chirurgie lorsque la plaie est complètement fermée. 3. histologie et Image Acquisition Graft Collection et conservation Préparer une solution de paraformaldehyde à 4% en mélangeant 26 ml ddH 2 O avec 4 ml de PBS et 10 fois une solution de paraformaldehyde 10 ml de 16%. Disséquer dans un seul bloc, le tampon entée ovarien de graisse, de l'ovaire, trompe utérine, 0,5 cm utérus comme décrit dans les étapes 1.1.1-1.1.4. Placer immédiatement dans 2 ml 4% de paraformaldéhyde et fixer pendant 2 heures, à la température ambiante. À partir du même animal, disséquer le non grefféecontrolatéral système de coussinet adipeux ovariens transplantés avec le mélange de matrice de la membrane PBS-sous-sol comme un contrôle (voir étape 2.9). Fix et le processus de la même manière. Après lavage de fixation des tissus trois fois avec du PBS pendant 5 min et incuber pendant la nuit dans du PBS à 4 ° C. Pour l'ensemble de montage imagerie du coussinet adipeux ovarien passez à l'étape 3.2.1. Remarque: Une fois les tissus d'acquisition d'image peuvent être congelés (3.3.1) ou transformés pour l'inclusion en paraffine (3.3.2). incubation d'une nuit dans 30% de saccharose dans du PBS à 4 ° C améliore la qualité des tissus congelés. Acquisition d'image Placez l'ensemble du montage des systèmes de coussinet adipeux ovariens dans les plats et image à l'aide d'un microscope inversé PBS rempli équipées de fixation epi-fluorescence et haute définition caméra couleur, avec 4, 10x objectifs, et un stéréomicroscope équipé d'un accessoire de fluorescence, caméra couleur et plan Apo 1xWD70, objectifs plan d'ED 1.5xWD45. Histologie Suivanttoute-mount acquisition d'image (3.2.1) placer une goutte 200-500 pi de milieu d'inclusion pour les spécimens de tissus congelés sur un morceau de film de laboratoire et en utilisant une pince 2 x 1 cm, transférer le tissu à la baisse. Décrochez le film à un bord et transférer la chute de tissu-milieu à un ml flacon cryogénique 1.8. Fermez le flacon et plonger dans l'azote liquide. Stocker les tissus congelés à -80 ° C. Vous pouvez également procéder à l'enrobage de paraffine standard. Utilisez 20-40 volumes de volume de tissu pour chaque étape. Immergez tissus une fois dans 65% d'éthanol pendant 30 minutes, en secouant doucement à la température ambiante. Immergez tissus une fois dans 70% d'éthanol pendant 30 minutes, en secouant doucement à la température ambiante. A ce stade, les échantillons peuvent être conservés pendant plusieurs mois à température ambiante. Immergez tissus une fois dans 90% d'éthanol pendant 30 minutes, en secouant doucement à la température ambiante. Immergez tissus une fois dans 95% d'éthanol pendant 30 minutes, en secouant doucement à la température ambiante. Immergez tissus à deux reprises dans l'éthanol absolu (200 preuve) pendant 30 min, en secouant doucement à la température ambiante. <li> Immerger les tissus à deux reprises dans le chloroforme pendant 30 minutes, en secouant doucement à la température ambiante. Immergez tissus une fois dans de la paraffine pendant 30 minutes, en agitant doucement à 58 ° C. Immergez tissus une fois dans de la paraffine pendant 12 heures, en secouant doucement à 58 ° C. Immergez tissus une fois dans de la paraffine pendant 3 heures, à 58 ° C. Placez les tissus dans des moules d'histologie métalliques et remplir les moules avec 58 ° C de la paraffine. Ajouter une cassette d'histologie plastique sur le dessus de la paraffine et refroidir la paraffine à +4 ° C. Extraire le bloc de paraffine tissus et conserver à la température ambiante. Note: la température de la paraffine ne doit pas dépasser 58 ° C pour une conservation optimale du tissu approprié pour la coloration immunohistochimique. Vous pouvez également préparer à la Embedding Paraffine avec Gel de traitement des échantillons. Aspirer le PBS et transférer les tissus entiers monture à 70% d'éthanol. Incuber à température ambiante pendant 2 h. Dans un bain d'eau, spécimen de préchauffage traitement gel à 60 ° C. Pipette 200 ul du gel de traitement des échantillons sur une boîte de Pétri laboratoire film doublé. Utilisation de fines pinces à dissection transférer l'ensemble de montage système de tissu à la chute de gel de traitement des échantillons. Laisser le bouchon de gel de traitement des échantillons se solidifier à la température ambiante, ou solidifier le bouchon pendant 10 min à 4 ° C. Placer le gel de traitement des échantillons de tissu incorporé dans des cassettes de tissus histologiques sandwich entre coussins en mousse de biopsie. Incluez dans de la paraffine comme dans les étapes 3.3.2-3.3.2.10. Remarque: Spécimen traitement plongement de gel empêche la perte et permet la conservation des petits échantillons de tissus fragiles. Note: Les tissus conservés par congélation ou de la paraffine plongement conviennent pour la coloration immunohistochimique 14,15.