JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscienze

Mesure quantitative des niveaux relatifs à l'acide rétinoïque E8.5 Embryons et Neurosphère Cultures Utilisation du F9 RARE-Lacz base de cellules Reporter Assay

Published: September 06, 2016
doi:
10.3791/54443
, , ,
1Center for Advanced Biotechnology and Medicine,Rutgers University, 2Department of Neuroscience and Cell Biology,Rutgers University

Summary

Methods to accurately measure retinoic acid (RA) levels in small amounts of tissue do not exist. This protocol describes the easy, quantitative measurement of relative RA levels in E8.5 embryos and neurospheres using an RA reporter cell line.

Abstract

Retinoic acid (RA) is an important developmental morphogen that coordinates anteroposterior and dorsoventral axis patterning, somitic differentiation, neurogenesis, patterning of the hindbrain and spinal cord, and the development of multiple organ systems. Due to its chemical nature as a small amphipathic lipid, direct detection and visualization of RA histologically remains technically impossible. Currently, methods used to infer the presence and localization of RA make use of reporter systems that detect the biological activity of RA. Most established reporter systems, both transgenic mice and cell lines, make use of the highly potent RA response element (RARE) upstream of the RAR-beta gene to drive RA-inducible expression of reporter genes, such as beta-galactosidase or luciferase. The transgenic RARE-LacZ mouse is useful in visualizing spatiotemporal changes in RA signaling especially during embryonic development. However, it does not directly measure overall RA levels. As a reporter system, the F9 RARE-LacZ cell line can be used in a variety of ways, from simple detection of RA to quantitative measurements of RA levels in tissue explants. Here we describe the quantitative determination of relative RA levels generated in embryos and neurosphere cultures using the F9 RARE-LacZ reporter cell line.

Introduction

L' acide rétinoïque (RA) est un dérivé d' un métabolite de la vitamine A ou rétinol et est produit par l'activité séquentielle de plusieurs déshydrogénases 1 cellulaires. En raison de sa nature amphipatique chimique, il traverse facilement les membranes lipidiques et peut agir comme un facteur morphogénétique 1 soluble. Il est essentiel d' une molécule qui régule de nombreux processus cellulaires de développement et des adultes , en agissant comme un ligand pour les récepteurs de rétinoïdes nucléaires et l' activation de l' expression du gène 10/2. Sans RA, ces récepteurs RA (RAR) de Rareş se lient à l'ADN et agissent comme répresseurs; RA se lier à ces récepteurs , les transforme en activateurs de transcription résultant de l'expression du gène cible 1,5,6.

Bien que la voie de signalisation de RA est bien caractérisée, la petite taille (~ 300 Da) et de la nature amphipathique des RA rend la visualisation directe histologique et la mesure de RA actuellement techniquement impossible 11. La seule méthode pour direct mesure des niveaux RA est l'isolement de la polyarthrite rhumatoïde à partir d' échantillons de tissus en utilisant la chromatographie liquide à haute performance (HPLC) 11. Cette méthode nécessite généralement de grandes quantités de tissu, facilitées par la mise en commun des échantillons différents 12. Par conséquent, cette technique est peu adaptée à la mesure des taux de PR dans les embryons individuels ou de petites quantités d'échantillon / tissu.

Afin d'étudier la fonction cellulaire de la polyarthrite rhumatoïde, plusieurs méthodes ont été développées pour déduire indirectement la présence de la polyarthrite rhumatoïde. Ces méthodes utilisent des systèmes rapporteurs contenant le RAR-beta très réactif RARE conduisant l'expression de la bêta-galactosidase ou la luciférase 11,13,14. La souris reporteur LacZ RARES transgénique généré par Rossant et al. 13 est un système idéal pour la visualisation de régions spatiotemporelles de signalisation RA in situ 11,13,15,16 mais ne convient pas pour des mesures quantitatives. La ligne F9 cellulaire RARE-LacZ 14, sur til d' autre part, est utile pour la détection de la PR et des mesures quantitatives de niveaux RA dans des explants de tissus 11,12,14,17,18.

Des cellules de tératocarcinome F9 expriment l' alpha endogène, bêta- et l' acide gamma-rétinoïque , les récepteurs 19, et initient la différenciation en endoderme pariétal après l' exposition à la PR 19-21. les cellules F9 ont longtemps été établi comme un modèle pour la différenciation cellulaire RA-induite, ce qui explique pourquoi il a été choisi comme une lignée cellulaire idéal pour un essai RA rapporteur. Le Sil-15 RA lignée cellulaire rapporteur F9 dérivé généré par Wagner et al. 14 contient un E. coli'LacZ gène en aval d'une copie de l'élément rétinoïque 64 pb réaction d'acide (rare) du récepteur de l' acide bêta-rétinoïque humain (RAR-bêta) , le gène. Afin de sélectionner et de maintenir des clones stables, le produit d' assemblage contient également le gène d' aminoglycoside phosphotransferase (neor) en tant que marqueur sélectionnable en présence de G418. Cette co constructionnfers expression inductible de la b-galactosidase en présence de la polyarthrite rhumatoïde, qui peut être visualisée par coloration de LacZ et de cette réaction peuvent ensuite être quantifié en utilisant des procédés colorimétriques 11,12,14,18.

Cette lignée cellulaire rapporteur extrêmement polyvalent a été largement utilisé dans la détection de la production endogène de RA par co-culture d'échantillons de tissus avec les cellules rapporteuses, telles que cochléaires et 17 explants embryonnaires plaque de plancher 14. En outre, cette ligne de journaliste a été utilisé pour la quantification des niveaux de PR dans la moelle épinière en développement par la culture de sections regroupées de la moelle épinière embryonnaire séparément et en ajoutant des milieux conditionnés à partir de ces cultures à cellules RARE-LacZ F9 18. Quantification a été réalisée après coloration LacZ par la lecture colorimétrique en utilisant un lecteur de plaque ELISA standard 11,12,18. Enfin, cette lignée cellulaire rapporteur a été utilisée dans la détection de la présence de la polyarthrite rhumatoïde par les enzymes du métabolisme monitoring changements dans les niveaux RA 12,18.

Nous rapportons ici que la sensibilité de cette lignée cellulaire rapporteur permet également pour la mesure des niveaux RA générés par E8.5 individuels embryons co-cultivés. Ce qui permet la comparaison entre des embryons individuels de différents génotypes. Comme exemple spécifique, Gpr161 est un GPCR orphelin qui réglemente neurulation en partie par la voie de signalisation de RA 22, et nous rendre compte en utilisant cette lignée cellulaire rapporteur pour étudier l'effet d'une mutation récessive dans Gpr161 (Gpr161 vl) sur les niveaux de RA globaux dans le embryon. En plus de cela, la polyvalence et la facilité d'utilisation de ce système permet de reporter la liberté de mesurer et de comparer les niveaux de RA dans des échantillons de tissus différents, même dans les cultures de neurosphères obtenues à partir de cellules souches de la moelle épinière adulte. Nous décrivons ici la détermination quantitative des niveaux relatifs de PR dans les embryons et les cultures de neurosphères par co-culture directe avec le F9 RARE-LacZ RA replignée cellulaire orter.

Protocol

Tous les travaux de l'animal a été fait selon les méthodes Rutgers-RWJMS IACUC approuvés. 1. Solution et préparation des médias Préparer stocks tampons et solutions selon le tableau 1. Préparer des solutions de travail selon le tableau 2. 2. Culture et entretien des cellules F9 RARE-LacZ Les cellules congelées Dégel Préparer un milieu de culture de cellules F9 RARE-LacZ comme indiqué dans le tableau 2. Manteau 10 cm boîtes de culture (culture de cellules traitées) avec 10 ml de gélatine à 0,2% (voir le tableau 2) pendant 30 min à température ambiante. Laver l'excès de gélatine avec deux rinçages de 10 ml d'eau distillée. ajouter immédiatement 9 ml de milieu de culture de cellules F9 RARE-LacZ dans la fiole pour empêcher la gélatine de séchage. Décongeler une fiole de cellules RARE-LacZ F9 14 dans un bain à 37 ° de l' eau pour 2 – 3 min. Cellules en plaques (environ 1 x 10 6 cellules / ml) dans le plat enduit contenant 9 ml de milieu de culture. La culture à 37 ° C, 5% de CO 2. Changer le moyen le lendemain. Maintien de F9 cellules RARE-LacZ Maintenir un passage régulier tous les 2 – 3 jours à un rapport de 1:10. Remarque: Ne laissez pas les cellules croissent en confluence que cela se traduira par leur différenciation. Diviser les cultures à une confluence de 80-90%. Retirez les médias et laver les cellules avec 10 ml de 1x tampon phosphate salin (PBS). Retirez le PBS et ajouter 1 ml de trypsine, incuber pendant 5 min. Ajouter 9 ml de milieu de culture, une pipette de haut en bas et de diviser les cellules 1h10 pour le passage. Congélation F9 cellules RARE-LacZ Trypsiniser un plat de 10 cm contenant des cellules RARE-LacZ F9 à 80 – 90% de confluence comme détaillé dans l'étape 2.2.2. Transférer les cellules dissociées dans un tube et un essorage centrifuge 15 ml à 200 xg pendant 5 min. Retirer le surnageant et le culot de cellules remise en suspension dans 10 ml de F9 RARE-LacZ freezing moyen (voir le tableau 2). Aliquoter 1 ml en cryotubes étiquetés et flacons de transfert dans des récipients de congélation. Placer le gel récipient dans -80 ° C congélateur O / N et de transfert des flacons à réservoirs d'azote liquide le lendemain. 3. Dissection de E8.5 Embryons Accouplement Cage Set-up et Plug Check Mise en place d'une cage d'accouplement contenant une paire d'accouplement. Le matin du jour suivant, vérifier la présence d'un bouchon vaginal et de désigner le jour un bouchon se trouve que le jour 0,5 23. A E8.5 jour, les embryons de récolte. Dissection de Embryons Sacrifiez le barrage par dislocation cervicale et pulvériser la zone abdominale avec 70% d' éthanol (voir le tableau 2). Faire une coupe transversale à la peau au-dessus de l'abdomen à l'aide des ciseaux chirurgicaux et tirez les deux volets de l'autre (antérieur et postérieur) pour exposer la région abdominale. Faire une coupe similairesur le péritoine pour exposer l'abdomen. Repérez le col et la libération de l' utérus des trompes de Fallope et mésomètre en utilisant une paire de ciseaux 23. Placez le col dans une boîte de 6 cm (culture non-cellule traitée) avec 10 ml PBS 1x pour laver l'excès de graisse et de sang. Transfert à un autre plat de 6 cm contenant 10 ml frais 1x PBS. Séparée d'un utérus contenant un embryon en le coupant avec des ciseaux chirurgicaux. Retirer l'utérus et decidua et libérer le sac de jaune contenant l'embryon en utilisant deux paires de pas. 5 pince 23. Séparer le vitellus de l'embryon, et le transfert du sac vitellin d'un microtube de 1,5 ml pour l'extraction d'ADN génomique à être utilisé pour le génotypage. Utiliser une pipette P20 avec une pointe de gros calibre, transférer l'embryon entier dans un tube de 1,5 ml contenant 10 pi de trypsine. Placer le tube sur la glace. Répétez les étapes 3.2.3 – 3.2.4 jusqu'à ce que tous les embryons ont été disséqués. Embryo dissociation Incuber les tubes de 1,5 ml contenant des embryons à la trypsine à 37 ° C pendant 5 minutes pour faciliter la dissociation enzymatique. Triturer doucement à l'aide d'une pipette P20 pour la dissociation mécanique de l'embryon, et l'assiette du volume total de 10 ul contenant un embryon dissocié sur un puits de cellules RARE-LacZ F9 dans une plaque à 96 puits (voir étape 5.1 pour le placage des cellules F9 RARE-LacZ dans une plaque de 96 puits). La culture O / N à 37 ° C et 5% de CO 2. 4. laminectomie, Dissection des adultes de la moelle épinière lombaire et Neurosphère Culture laminectomie Sacrifiez un adulte (P60) la souris par dislocation cervicale. Pulvériser la face dorsale avec 70% d'éthanol et faire une coupe transversale en utilisant des ciseaux chirurgicaux. Tirez sur les deux volets (antérieur et postérieur) en dehors pour exposer le dos et la colonne vertébrale. Avec des ciseaux chirurgicaux, couper les muscles couvrant la colonne vertébrale.Localiser la région lombaire de la moelle épinière, au-dessous des nervures. À l'aide des ciseaux, faire une coupe profonde de rompre la colonne vertébrale à ce stade pour exposer la moelle épinière. Tirez la région lombaire de la colonne vertébrale sans. 5 forceps de telle sorte que la section transversale exposée de la moelle épinière, fait face à l'expérimentateur. En utilisant les conseils de ciseaux fins, coupez la vertèbre et de muscle au niveau des positions 3 et 9 heures de l'extrémité exposée. Saisissez le volet dorsale de la vertèbre coupé avec une pince. Continuer jusqu'à ce que ces coupures caudale la longueur de la moelle épinière lombaire est exposée. Relâchez la moelle épinière des vertèbres en utilisant pas. 5 ainsi que des pinces à bouts francs. Transférer la moelle épinière à un tube de 15 ml contenant 3 ml de milieu DMEM / F12 de culture. Gardez sur la glace jusqu'à ce que tous les cordons de la colonne vertébrale lombaire ont été isolés. Spinal Cord Dissection Verser le milieu de culture avec de la moelle épinière dans une boîte de 6 cm (culture non traitée cellulaire). En vertu d'un stéréomicroscope, enlever les ganglions de la racine dorsale et les vaisseaux sanguins autour du segment de la moelle épinière en saisissant les ganglions et les vaisseaux sanguins en utilisant deux paires de pas. 5 pinces et en les tirant doucement de la moelle épinière. Transférer le segment de la moelle épinière dans une boîte de 6 cm sans support et hacher finement le tissu à l'aide d'une lame de scalpel. Transfert tissu haché à tube de 15 ml contenant 1 ml de milieu Neurosphère de dissociation (voir le tableau 2). Déposer le tube sur la glace et répétez les étapes 4.2.1 – 4.2.2 jusqu'à ce que tous les cordons de la colonne vertébrale ont été traitées. Incuber les tubes contenant du tissu haché dans un milieu de dissociation à 37 ° C pendant 10 min, effleurer le tube sur le côté pour mélanger et incuber à 37 ° C pendant encore 10 min. Après digestion enzymatique, trituré avec des pipettes polies au feu de diamètres décroissants pour la dissociation mécanique. Note: Préparer pipettes poli-feu de diamètres décroissants avant d'effectuer des expériences. Prendre un verre Pasteurpipette et branchez l'extrémité large avec du coton propre. L'utilisation d'une lampe à alcool, le feu polish les pointes des pipettes dans la flamme pour créer différents diamètres: "régulière", "fine" et "extra fin". Pour pipettes polies «réguliers», virevolter la fin de la pipette dans la flamme au tour des bords sans diminuer le diamètre (~ 1 mm). Faites pivoter l'extrémité de la pipette dans la flamme pour un peu plus longtemps pour créer "fine" (~> 1 mm et> 5 mm de diamètre) et "extra fin" (~ 0,5 mm) pipettes polies. Ne pas utiliser pipettes avec des diamètres inférieurs à 0,5 mm. neurosphère Culture Isoler des tubes contenant dissociées du tissu de la moelle épinière à 200 xg pendant 10 min. Retirer le surnageant et le culot de cellules remettre en suspension dans 1 ml de milieux de culture de neurosphères (voir le tableau 2). Triturer avec une pipette P1,000 suivie d'une pipette P200 pour faciliter la dissociation. Remarque: évitez les bulles d'introduction,ce qui diminuerait la viabilité cellulaire. Transfert de 10 ul de cellules dissociées dans un hémocytomètre et d'obtenir une numération cellulaire. Des cellules en plaques à une densité de 1×10 5/10 ml dans un flacon T25 avec 10 ml de milieux de culture de neurosphères. Incuber à 37 ° C et 5% de CO 2 pendant 7 jours jusqu'à ce que neurosphères 24 apparaissent. neurosphère dissociation Recueillir la culture Neurosphère et transfert à tubes de 15 ml. Spin à 200 xg pendant 10 min. Retirer la plupart du surnageant en laissant 1 ml derrière. Triturer avec une pipette P1,000 pour remettre en suspension le culot de cellules et de se dissocier neurosphères dans des cellules individuelles. Transfert 10 pi de cellules dissociées dans un hémocytomètre et d'obtenir un nombre de cellules. Planche 1 x 10 5 dissociées cellules de neurosphères sur un puits de F9 RARE-LacZ dans une plaque à 96 puits (voir rubrique 5.1 pour placage F9 RARE-LacZ en plaque de 96 puits). Plaque 3 puits comme répétitions. La culture O / N à 37 ° C et 5% de CO 2. 5. RA Dosage de E8.5 Embryons et la moelle épinière Neurosphères Placage F9 RARE-LacZ en plaque de 96 puits Un jour avant la récolte des embryons E8.5 ou dissociation de neurosphères, enduire une plaque de 96 puits avec 100 ul de 0,2% de gélatine par puits pendant 30 min à température ambiante. Aspirer la gélatine et rincer deux fois avec 200 pi d'eau distillée. Trypsiniser F9 cellules RARE-LacZ maintenus en boîtes de 10 cm comme indiqué à l'étape 2.2.2. Planche 1 x 10 5 cellules / puits de cellules LacZ F9-RARE, mais cette fois en utilisant un milieu de culture sans G418. Préparer suffisamment de puits pour la co-culture d'embryons (~ 12-20, selon la taille de la litière), neurosphères (3 puits / génotype), ainsi que pour une courbe standard en triple (27 puits). Co-culture de F9 RARE-LacZ et E8.5 Embryons ou la moelle épinière Neurosphères embryons de récolte comme détaillé dans la section 3.2 et la plaque sur le dessus de F9RARE-LacZ dans la plaque de 96 puits de la section 5.1. D'une manière similaire, dissocier neurosphères et plaque sur le dessus de F9 RARE-LacZ dans la plaque 96 ainsi que détaillée à l'étape 4.4. La culture O / N à 37 ° C et 5% de CO 2. Génération d' une courbe standard Pour générer une courbe standard, préparer tout-trans RA (au-RA) des solutions avec les concentrations suivantes: 100 nM, 10 nM, 1 nM, 100 pM, 22:00, 13:00, 100 fM, par dilution en série de l'at- RA stock (voir le tableau 1) avec un milieu de culture RARE-LacZ F9. Ajouter 100 pi de ces différentes au-RA concentrations aux cellules RARE-LacZ F9 de la section 5.1. Attribuer des puits contenant des cellules RARE-LacZ F9 non traitée comme contrôle négatif. Préparer triplicats de chaque concentration de la polyarthrite rhumatoïde et les puits témoins négatifs. La culture O / N à 37 ° C et 5% de CO 2. Remarque: Les cellules rares LacZ-F9 réagissent d'une manière linéaire, dose-dépendante à des concentrations variables de la polyarthrite rhumatoïde tout-trans. RA Assay Après O / N culture de la plaque de 96 puits contenant les courbes standard et co-cultures, retirez le support et fixer les cultures en ajoutant 100 pi de glutaraldéhyde à 2,5% (voir le tableau 2) pendant 15 min, RT. Retirer le fixateur et laver deux fois avec 200 pi de PBS 1x, 10 min par lavage. Retirer le PBS et laver trois fois avec 200 pi de la solution de lavage de LacZ (voir le tableau 2), 10 min par lavage. Au cours du troisième lavage, préparer la solution de coloration de X-gal dans un tube de 15 ml enveloppé dans une feuille (voir le tableau 2). Calculez combien de solution de coloration est nécessaire et préparer la quantité appropriée (200 pl / puits). Remarque: solution coloration X-gal est sensible à la lumière. Utiliser la solution de coloration dans les 15 minutes après la préparation. Préparer une chambre humidifiée en plaçant une serviette en papier imbibé d'eau distillée dans un récipient en plastique assez grand pour contenir une plaque de 96 puits. Ajouter 200 ul de Xsolution de coloration par gal puits de la plaque à 96 puits et placer la plaque dans une chambre humidifiée. Incuber chambre humidifiée contenant la plaque de 96 puits à 37 ° C pour permettre le développement d'un précipité de couleur bleue. Pour les embryons de E8.5, incuber la plaque O / N (12-16 h). Pour neurosphères cultures, incuber la plaque pendant 4-8 heures. Lecture Absorbance à OD 610 et Imagerie Après la réaction de couleur, éliminer la solution LacZ de coloration et le remplacer par 200 ul PBS 1x. Mesurer l'absorbance à 610 nm en utilisant un lecteur de plaque ELISA standard pour quantifier la réponse du rapporteur à la PR. Image puits individuels en utilisant un stéréomicroscope standard équipé d'une caméra. 6. Sous-clonage de cellules F9 RARE-LacZ Vérification F9 RARE-LacZ rResponse à RA Avant de commencer toute expérience, tester la réponse des cellules RARE-LacZ F9 à RA. Plaque F9 RARE-LacZ caunes en plaque de 96 puits (voir section 5.1), et ajouter 1 nM tous les trans-acide rétinoïque (voir étape 5.3). Incuber dans une chambre humidifiée à 37 ° CO / N. Visualisez le développement de précipité de couleur bleue à l'aide d'un microscope. Si le développement de la couleur est pas uniforme dans les cellules dans le puits (voir la figure 1B, à gauche), effectuer le sous – clonage détaillé ci – dessous. Sous – clonage de cellules F9 RARE-LacZ Fractionner les cellules RARE-LacZ F9 cultivées en boîtes de 10 cm comme indiqué à l'étape 2.2.2. Au lieu d'un rapport de 1:10, une plaque à faible densité d'ensemencement de 1 x 10 5 cellules / 10 ml dans une boîte de 10 cm pour permettre la croissance de colonies isolées , de telle sorte que chaque colonie provient d'une seule cellule F9 RARE-LacZ. Au bout de deux jours, une couche de plaque à 24 puits avec 500 ul de gélatine à 0,2% dans chaque puits pendant 30 min. Retirer la solution de gélatine et rincer les puits deux fois avec 500 pi d'eau distillée. Remplacer l'eau avec 500 pi de milieu de culture de cellules F9 RARE-LacZ. Choisissez une colonie en utilisant une pointe de pipette stérile P10 et le transfert dans un puits; faire cela 24 fois pour obtenir 24 colonies individuelles. La culture à 37 ° C, 5% de CO2 pendant 3 – 4 jours. Diviser les colonies individuelles en deux plaques à 24 puits. Après 2 jours de culture, ajouter 1 nM de RA à chaque puits d'une plaque et de la culture de 24 puits O / N. Effectuer LacZ coloration comme détaillé dans la section 5.4 pour tester forts répondeurs. Visualisez la réaction de couleur de chaque puits sous un microscope pour déterminer les intervenants forts et uniformes. Une fois que le répondeur sous-clone solide est déterminé, développer la culture correspondante de l'autre plaque de 24 puits. élargir cette colonie dans un plat de 10 cm, le gel jusqu'à plusieurs flacons comme indiqué dans la section 2.3, et jeter toutes les autres colonies. Remarque: Seulement environ un quart des colonies d'origine résultat en haute répondeurs. En règle générale, le premier tour des sous-clonage ne se traduit pas par une coloration LacZ uniforme et une ronde ultérieure de sous-clonage doit être fait pourobtenir des intervenants solides uniformes.

Representative Results

Le F9 RARE-LacZ reporter est une lignée de cellules de carcinome embryonnaire adhérentes cultivées sur une surface revêtu de gélatine. Le produit de construction rapporteur permet aux cellules de répondre quantitativement à la PR avec une induction proportionnelle de la bêta-galactosidase. 11,12,14,18. Ces cellules présentent une morphologie epitheliale (figure 1A). En raison de leur taux de doublement élevé, il est recommandé que ces cellules soient divisées tous les 2 – 3 jours à un rapport de 1:10. Au cours de notre travail avec cette lignée cellulaire rapporteur, nous avons observé que , même avec l'ajout de G418 dans le milieu de culture, la réponse de ces cellules à RA affaiblit après plusieurs passages (figure 1B, à gauche), et cela peut affecter la capacité de reporter de cette lignée cellulaire. Cette perte de réactivité peut être due à une perte partielle du transgène dans les passages ultérieurs. A ce titre, le sous – clonage périodique est nécessaire pour s'assurer répondeurs solides et uniformes pour la PR (figure1B, à droite). Bien que diverses utilisations de cette lignée cellulaire a été publié précédemment 12,14-18, rapportée ici est l'utilisation de cette lignée cellulaire pour mesurer les niveaux de RA endogènes à partir d' embryons E8.5 individuels avec différents génotypes. Les résultats Gpr161 vl / vl de mutation dans diminué RA embryonnaire de signalisation 22. Comme le montre la co-culture d'embryons dissociées avec des cellules RARE-LacZ F9, ces Gpr161 vl / vl embryons ont réduit endogène RA par rapport à la même portée de type sauvage (figure 2A). En raison de la polyvalence de cette lignée cellulaire rapporteur, a également signalé ici est une nouvelle utilisation de ces cellules pour détecter des niveaux RA produits par des cultures de neurosphères obtenues à partir d' adultes Gpr161 souris poids / poids (figure 2B). Cette lignée cellulaire rapporteur a pu démontrer que les cultures de neurosphères à partir de cellules souches de la moelle épinière adulte produit RA endogène. La grande différence en intensité de la coloration indique une réponse cellulaire rapporteur supérieure à neurosphères de la moelle épinière par rapport aux embryons E8.5. Cela peut être dû à beaucoup de niveaux plus élevés de PR générés par les neurosphères au fil du temps par rapport aux embryons E8.5, qui pourrait être dû au fait que neurosphères cultures sont plus homogènes que les embryons E8.5 et contiennent donc plus de cellules RA-producteurs. L'addition de différentes concentrations de résultats au-RA dans une réponse des cellules rapporteuses linéaire dose-dépendante. Cette réponse peut être mesurée par colorimétrie en lisant l'absorbance à 610 nm. La courbe standard générée peut alors être utilisé pour quantifier les niveaux de RA dans des échantillons, tels que des cultures de type sauvage neurosphères (figure 3A) ou des embryons E8.5 (figure 3B). Figure 1. MaintENANCE et Subcloning de F9 cellules RARE-LacZ. (A) Une image à contraste de phase de cellules RARE-LacZ F9 est affiché. Ces cellules ont un temps de doublement d'environ 10 heures et doivent être transmis tous les 3 jours. (Environ 70 – 80% de confluence) à un rapport de 1:10 (B) test périodique des cultures avec addition de 1 nM à-RA et LacZ ultérieure coloration doit être fait pour assurer les cultures restent intervenants forts et uniformes pour RA (à droite). En cas de mauvais répondeurs et non-uniformes (à gauche), le sous-clonage doit être effectuée. Echelle barres 100 um. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure. Les échantillons Figure 2. LacZ Coloration de Co-culture (dissociées E8.5 Embryons / Neurosphères) et F9 cellules RARE-LacZ (A) embryon E8.5 de la souris. s de différents génotypes ont été dissociés et plaqué sur le dessus de F9 cellules RARE-LacZ. LacZ coloration 24 heures permet plus tard la visualisation de la réponse des cellules F9 RARE-LacZ à endogène RA produites par des échantillons de co-culture. Les résultats Le Gpr161 de mutation dans la PR endogène diminué visualisées par la diminution de la réponse des cellules rapporteur. (B) gauche. Une image à contraste de phase de neurosphères cultivées à partir de cellules souches adultes de neurones de la moelle épinière est montré. Droite. Neurosphères dérivés d'adultes Gpr161 moelle épinière en poids / poids ont été dissociées et plaquées sur le dessus de F9 cellules RARE-LacZ. La présence de précipité bleu après coloration LacZ indiquent la présence de RA endogène dans ces neurosphères. La différence d'intensité de coloration entre les neurosphères et E8.5 embryons co-cultures indiquent des niveaux plus élevés de RA présente dans neurosphères que les embryons E8.5. Echelle barres 100 um.target = "_ blank"> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 3. Courbe standard et colorimétriques Quantification des niveaux RA. La réponse du RARE LacZ ligne F9 cellulaire rapporteur peut être mesurée à 610 nm en utilisant un lecteur standard de plaque ELISA. (A) courbe standard représentatif utilisé pour quantifier les niveaux relatifs RA de type sauvage culture neurosphère s. (B) Quantification des niveaux relatifs RA de E8.5 embryons de co-culture. N = 3; * P <0,05, test t de l'étudiant. Les barres d'erreur SEM. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. StoTampons ck / Solutions Composants Conditions de stockage 10% de désoxycholate de sodium monohydraté (C 24 H 39 NaO 4 · H 2 O) 10 ml de dH 2 O de 100 4 ºC 1 M de chlorure de magnésium (MgCl 2) RT 100x ferrocyanure de potassium (K 4 [Fe (CN) 6] · 3H 6 O) 2,12 g dans 10 ml de dH2Û RT dans l'obscurité 100x ferricyanure de potassium (K 3 [Fe (CN) 6]) 1,64 g dans 10 ml de dH2Û RT dans l'obscurité 20 mg / ml de X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) ajouter 5 ml de diméthyle formamide pour faire 20 mg / ml solution mère -20 ºC 10 mM de (3 mg / ml) tout-trans l'acide rétinoïque Dissoudre 50 mg dans 16,67 ml d'éthanol absolu. Préparer 1 ml aliquotes. -80 ºC dans l'obscurité, dans 1,5 ml tubes ambre microtubes Papain dissoudre un flacon dans 7 ml de HBSS 4 ºC Tableau 1. Tampons et Compositions Solution. Travailler Buffers / Solutions Composants Conditions de stockage RARE-LacZ milieu de culture de cellules F9 50 ml de sérum bovin fœtal (FBS) (concentration finale de 10%) Filtre-stériliser. 5 ml 100x Pénicilline streptomycine (finale conc 1X) Conserver à 4 ° C. 4ml 50 mg / ml de G418 (Conc 0,4 mg / ml) à 500 ml de DMEM / F-12 (avec L-glutamine et HEPES) 0,2% de gélatine 25 ml de 2,0% de gélatine Conserver à 4 ° C. 80 ml d'eau distillée, Bien mélanger 70% d'éthanol 30 ml d'éthanol à 95% Placez dans une bouteille de pulvérisation. 70 ml d'eau distillée, Magasin à la température ambiante milieu de dissociation Neurosphère 1 ml de papaïne 20U préparer fraîche chaque fois 100 ul de 13 mg / ml de trypsine 100 pi 7 mg / ml d'acide hyaluronique 28 ul de 10 mg / ml de DNasel 50 ul 4mg / ml d'acide kynurénique milieu de culture Neurosphère DMEM / F-12 (avec L-glutamine et HEPES) préparer fraîche chaque fois 2% de supplément B-27 20 ml de facteur ng / de croissance des fibroblastes (FGF) 20 ng de facteur de croissance épidermique (EGF) 2,5% de glutaraldéhyde 250 ul de glutaraldéhyde à 50% préparer fraîche chaque fois 4750 pl de PBS 1x solution de lavage LacZ 0,5 ml de 10% de désoxycholate (concentration finale 0,1%) Conserver à 4 ° C. 1,0 ml de 100% NP-40 (dernière conc 0,2%) 50 ml de PBS 10X l'eau distillée à 500 ml une solution de coloration au X-gal 1x ferrocyanure de potassium préparer fraîche chaque fois 1x ferricyanure de potassium 1 mg / ml de X-gal au volume approprié en utilisant la solution de lavage LacZ F9 RARE-LacZ milieu de congélation F9 milieu de culture RARE-LacZ + 5% de DMSO préparer fraîche chaque fois Tableau 2. Tampons de travail et compositions Solution.

Discussion

La lignée cellulaire RARE-LacZ F9 14 est un système puissant qui peut être utilisé pour la détection de la polyarthrite rhumatoïde produite par des explants de tissu 12,14,17,18. Il est sensible à des concentrations aussi faibles que RA 100 fM, aucune réponse non spécifique détecté dans les cellules non traitées avec la polyarthrite rhumatoïde 12,14,18. En outre, les cellules reporteurs réagissent à tout-trans RA de manière linéaire à l' intérieur d' une plage spécifique de la concentration, ce qui permet ainsi la réaction LacZ à quantifier et utilisé pour déterminer l'ampleur des niveaux 12,14,18 RA. L'essai RA reporter rapide et facile présentée ici utilise la lignée cellulaire rapporteur F9 RARE-LacZ pour la visualisation (Figure 2) et la mesure quantitative relative (Figure 3) des embryons et des cellules souches neurales adultes cultivés. Ce système rapporteur permet la comparaison des niveaux de PR endogène entre les différents échantillons, comme le montre la figure 2. Il est assez sensible pour être capable de détecter RAproduite par les embryons E8.5 individuels (figure 2A), ainsi que la PR produites par neurosphères cultivées (figure 2B). La réponse dose-dépendante de cette lignée de cellules à des concentrations de RA variable permet la quantification des niveaux de RA (figure 3A) dans les échantillons, ainsi que la comparaison des niveaux relatifs entre les échantillons de PR (figure 3B). Il est important de noter que la lignée cellulaire rapporteur RARE F9 mesure la quantité totale de la polyarthrite rhumatoïde produite par les échantillons de tissus au cours du temps d'incubation. Ceci est équivalent au solde net de la synthèse de RA et le catabolisme.

Alors que le système rapporteur de cellules F9 RARE-LacZ est très sensible et polyvalent, il y a plusieurs étapes de dépannage critiques que nous avons incorporés afin d'assurer la fiabilité de ce système. D' abord, comme le montre la figure 1, il est important de maintenir la santé de ces cellules par des passages réguliers , sans les laisser gla rangée jusqu'à la confluence. Deuxièmement, nous avons observé plus tard passages ont tendance à entraîner des réponses incohérentes RA, même si les cultures sont constamment maintenues sous sélection avec G418. Pour résoudre cela, il est recommandé d'éliminer les cultures après 20 passages et décongeler un nouveau flacon. En outre, des contrôles réguliers doivent être effectués pour veiller à ce que les cellules rapporteurs sont encore forts répondeurs à la présence de RA dans les médias. Troisièmement, si les premiers passages présentent une réponse faible ou non uniforme à RA (figure 1B, à gauche), une ou plusieurs séries de sous – clonage peut être nécessaire jusqu'à ce que les intervenants forts sont obtenus (Figure 1B, righ t). Enfin, avant la co-culture, il est recommandé que des échantillons de tissus tels que des embryons et des neurosphères sont dissociés à des cellules individuelles. Nous avons observé que la dissociation des résultats des échantillons de mesures colorimétriques plus cohérentes. Cela peut être dû à une distribution plus uniforme de la PR dans les puits de culture, les cellules dissociées sont en uniformulaire de contact avec les cellules rapporteurs.

Plusieurs modifications ont également été apportées au protocole 14 d' origine. Tout d' abord, la réponse RA des cellules RARE-LacZ F9 ont été quantifiés en fixant directement les cellules et mesurer l' absorbance à 610 nm au lieu de recueillir et d' analyser les cellules lysat pour l' activité b-galactosidase 14. Une autre modification est la co-culture directe d'échantillons dissociées avec F9 RARE-LacZ avant la quantification de la réponse RA. Les méthodes précédentes ont rapporté la culture des échantillons séparément et en ajoutant seulement les médias de ces cultures à F9 RARE-LacZ 16,18.

En dépit de son être un puissant système, le test F9 rapporteur RARE-LacZ a plusieurs limites. Une limitation de cette lignée cellulaire rapporteur est que même si elle réagit fortement à la présence de tout-trans RA, il répond également aux autres isomères de l'acide rétinoïque, y compris 9-cis-RA et 13-cis-RA; cependant, ils sont 100 fois plus sensible à tout-trans compa RArouge pour les autres isomères 18. Une autre limitation de ce système est que la réponse dépend de la dose linéaire se situe seulement entre 10 -13 M à 10 -7 M à-RA 14,18; ainsi, si l'on compare les niveaux de PR en dehors de ces limites, il pourrait être nécessaire d'effectuer une dilution en série de l'échantillon jusqu'à ce que les mesures se situent dans la plage linéaire. Enfin, étant donné que cela est principalement un essai colorimétrique, le point final de développement de la couleur varie entre les échantillons et les expériences. Par conséquent, il est important qu'une courbe standard toujours être plaqué en parallèle pour chaque expérience unique afin de l'utiliser pour la quantification de la réponse cellulaire rapporteur.

En conclusion, nous avons signalé l'utilisation de la lignée cellulaire rapporteur RARE-LacZ RA F9 pour mesurer les niveaux de PR quantitativement dans des embryons de E8.5 et non déclarés antérieurement en neurosphères. La polyvalence de ce système rapporteur peut permettre la quantification des niveaux de RA dans pratiquement n'importe quel type de cellule ou de tissu, et may entraîner le développement d'applications variées dans l'avenir.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We would like to acknowledge Dr. Michael Wagner (SUNY Downstate Medical Center) and Ben Thiede (Dr. Jeff Corwin lab, University of Virginia) for providing us with the F9 RARE-LacZ cells and technical support. This study is funded by the New Jersey Commission on Spinal Cord Research (NJCSCR) (Grantnumber:10-3092-SCR-E-0) and the New Jersey Commission on Brain Injury Research (NJCBIR) (Grant number: CBIR13FEL006).

Materials

C3H/HeSn-Gpr161vl/J mouse strain Jackson Laboratory 000316
F9 RARE-LacZ reporter cell line from Dr. Michael Wagner (SUNY Downstate Medical Center) and Ben Thiede (Dr. Jeff Corwin lab, University of Virginia)
DMEM/F-12 (with L-glutamine and HEPES) ThermoFisher Scientific 11330-057
Fetal Bovine Serum (FBS), qualified ThermoFisher Scientific 26140-079 Store at -20 °C in 10-ml aliquots to avoid repeated freeze-thaw; warm in 37 C for media preparation
Penicillin/Streptomycin ThermoFisher Scientific 15140-122 Store at -20 °C in 10-ml aliquots to avoid repeated freeze-thaw; light-sensitive
G418 ThermoFisher Scientific 10131-027 Store at 4 °C; light-sensitive
2% Gelatin Sigma Aldrich G1393 Store at 4 °C
B-27 supplement (2 % stock solution) ThermoFisher Scientific 17504-044 Store at -20 °C in 1-ml aliquots to avoid repeated freeze-thaw; warm at room temperature for media preparation
Murine Epidermal Growth Factor (EGF) PeproTech 315-09 Prepare 100 μg/ml stock solution in 0.1% bovine serum albumin (BSA) in 1X PBS; prepare working concentrations by diluting with 1X PBS; store at -20 °C
Murine Fibroblast Growth Factor (FGF)-basic PeproTech 450-33 Prepare 100 μg/ml stock solution in 0.1% bovine serum albumin (BSA) in 1X PBS; prepare working concentrations by diluting with 1X PBS; store at -20 °C
50% glutaraldehyde Amresco M155 Store at 4 C
Sodium deoxycholate monohydrate (C24H39NaO4 · H2O) Sigma Aldrich D5670 Store at room temperature
potassium ferrocyanide (K₄[Fe(CN)₆] · 3H₂O) Sigma Aldrich P-9387 Store at room temperature
potassium ferricyanide (K₃[Fe(CN)₆]) Sigma Aldrich P-8131 Store at room temperature
X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-galactopyranoside) Promega V3941 Store stock at -20 °C 
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma Aldrich 41639 Store at room temperature
all-trans Retinoic Acid (at-RA) Sigma Aldrich R-2625 Store 1 ml aliquots of stock in -80 °C; extremely sensitive to light
TrypLE Express ThermoFisher Scientific 12605-010 Store at room temperature
0.25% trypsin-EDTA ThermoFisher Scientific 25200-056 alternative to TrypLE Express; aliquot and store at -20 C
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) ThermoFisher Scientific 14170-112 Store at 4 C
10X phosphate buffered solution (PBS) ThermoFisher Scientific 10010-023 Store at 4 C
Papain Worthington LK003176 Store at 4 °C. 
Trypsin Worthington LS003703 Store in 1 ml aliquots at -20 °C.
Hyaluronic acid  Calbiochem 385908 Store 200 μl aliquots at -20 °C. 
DNaseI Worthington LS002139 Store in 200 μl aliquots at -20 C
Kynurenic acid Sigma Aldrich K3375 Store in 200 μl aliquots at -20 C
95% ethanol
Mr. Frosty Freezing container ThermoFisher Scientific 5100-0001
10 cm culture dish (non-cell culture treated)
10 cm culture dish (cell culture treated)
6 cm culture dish (non-cell culture treated)
96-well cell culture plates
1.5 ml microcentrifuge tubes
1.5 ml amber microcentrifuge tubes
1.5 ml cryovials
37 °C water bath
surgical scissors
fine surgical scissors
no. 5 forceps
blunt-ended forceps
scalpel blade
glass pasteur pipettes
cotton
alcohol lamp
ELISA plate reader
stereomicroscope
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Vilhais-Neto, G. C., Pourquie, O. Retinoic acid. Curr Biol. 18 (5), R191-R192 (2008).
  2. Drager, U. C. Retinoic acid signaling in the functioning brain. Science Signalling. 324, 1-3 (2006).
  3. Lane, M. A., Bailey, S. J. Role of retinoid signalling in the adult brain. Prog Neurobiol. 75 (4), 275-293 (2005).
  4. Maden, M. Retinoid signalling in the development of the central nervous system. Nat Rev Neurosci. 3 (11), 843-853 (2002).
  5. Maden, M. Retinoids and spinal cord development. J Neurobiol. 66 (7), 726-738 (2006).
  6. Rhinn, M., Dolle, P. Retinoic acid signalling during development. Development. 139 (5), 843-858 (2012).
  7. Ang, H. L., Deltour, L., Hayamizu, T. F., Zgombic-Knight, M., Duester, G. Retinoic acid synthesis in mouse embryos during gastrulation and craniofacial development linked to class IV alcohol dehydrogenase gene expression. J Biol Chem. 271 (16), 9526-9534 (1996).
  8. Ang, H. L., Duester, G. Stimulation of premature retinoic acid synthesis in Xenopus embryos following premature expression of aldehyde dehydrogenase ALDH1. Eur J Biochem. 260, 227-234 (1999).
  9. Bastien, J., Rochette-Egly, C. Nuclear retinoid receptors and the transcription of retinoid-target genes. Gene. 328, 1-16 (2004).
  10. Chatzi, C., Cunningham, T. J., Duester, G. Investigation of retinoic acid function during embryonic brain development using retinaldehyde-rescued Rdh10 knockout mice. Dev Dyn. 242 (9), 1056-1065 (2013).
  11. Sakai, Y., Drager, U. C. Detection of retinoic acid catabolism with reporter systems and by in situ hybridization for CYP26 enzymes. Methods Mol Biol. 652, 277-294 (2010).
  12. Yamamoto, M., Drager, U. C., McCaffery, P. A novel assay for retinoic acid catabolic enzymes shows high expression in the developing hindbrain. Dev Biol Res. 107, 103-111 (1998).
  13. Rossant, J., Zirngibl, R., Cado, D., Shago, M., Giguere, V. Expression of a retinoic acid response element-hsplacZ transgene defines specific domains of transcriptional activity during mouse embryogenesis. Genes & Dev. 5, 1333-1344 (1991).
  14. Wagner, M., Han, B., Jessel, T. M. Regional differences in retinoid release from embryonic neural tissue detected by an in vitro reporter assay. Development. 116, 55-66 (1992).
  15. Luo, T., Wagner, E., Crandall, J. E., Drager, U. C. A retinoic-acid critical period in the early postnatal mouse brain. Biol Psychiatry. 56 (12), 971-980 (2004).
  16. Luo, T., Wagner, E., Grun, F., Drager, U. C. Retinoic acid signaling in the brain marks formation of optic projections, maturation of the dorsal telencephalon, and function of limbic sites. J Comp Neurol. 470 (3), 297-316 (2004).
  17. Kelley, M. W., Xu, X. M., Wagner, M. A., Warchol, M. E., Corwin, J. T. The developing organ of Corti contains retinoic acid and forms supernumerary hair cells in response to exogenous retinoic acid in culture. Development. 119, 1041-1053 (1993).
  18. McCaffery, P., Drager, U. C. Hot spots of retinoic acid synthesis in the developing spinal cord. Proc Natl Acad Sci. 91, 7194-7197 (1994).
  19. Hu, L., Gudas, L. J. Cyclic AMP analogs and retinoic acid influence the expression of retinoic acid receptor alpha, beta, and gamma mRNAs in F9 teratocarcinoma cells. Mol Cell Biol. 10 (1), 391-396 (1990).
  20. Martin, G. R. Teratocarcinomas and mammalian embryogenesis. Science. 209 (4458), 768-776 (1980).
  21. Strickland, S., Mahdavi, V. The induction of differentiation in teratocarcinoma stem cells by retinoic acid. Cell. 15 (2), 393-403 (1978).
  22. Li, B. I., et al. The orphan GPCR, Gpr161, regulates the retinoic acid and canonical Wnt pathways during neurulation. Dev Biol. 402 (1), 17-31 (2015).
  23. Hogan, B., Constantini, F., Lacy, E. . Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , (1986).
  24. Deleyrolle, L. P., Reynolds, B. A. Isolation, expansion, and differentiation of adult Mammalian neural stem and progenitor cells using the neurosphere assay. Methods Mol Biol. 549, 91-101 (2009).

Tags

Quantitative MeasurementRelative Retinoic Acid LevelsE8.5 EmbryosNeurosphere CulturesF9 RARE-LacZ Cell-based Reporter AssayRA Signaling PathwayRA Metabolic EnzymesRA ConcentrationLacZ StainingGelatin-coated PlatesCell CultureColony SelectionCell Expansion

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Ababon, M. R., Li, B. I., Matteson, P. G., Millonig, J. H. Quantitative Measurement of Relative Retinoic Acid Levels in E8.5 Embryos and Neurosphere Cultures Using the F9 RARE-Lacz Cell-based Reporter Assay. J. Vis. Exp. (115), e54443, doi:10.3791/54443 (2016).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image