F9 NADİR-LacZ Hücre tabanlı Muhabir Test kullanma E8.5 Embriyolar ve Neurosphere Kültürleri Bağıl Retinoik Asit Düzeylerinin Kantitatif Ölçümü

Tüm hayvan çalışmaları kabul Rutgers-RWJMS IACUC yöntemlere uygun olarak yapıldı. 1. Çözüm ve Medya Hazırlık . Tablo 1 gereğince stok ve tampon çözümleri hazırlayın Tablo 2'deki gibi çalışan çözümleri hazırlayın. 2. Kültür ve F9 NADİR-LacZ Hücrelerinin Bakım Çözülme Dondurulmuş Hücreler Tablo 2'de ayrıntılı olarak F9 NADİR-LacZ hücre kültür ortamı hazırlayın. Ceket 10 cm kültür tabaklarında% 0.2 jelatin 10 ml (işlemden hücre kültürü), oda sıcaklığında 30 dakika boyunca (Tablo 2 ye bakınız). damıtılmış su 10 ml iki durulama ile aşırı jelatin yıkayınız. Hemen kurutma jelatinin önlemek için şişeye F9 nadir LacZ hücre kültür ortamının 9 ilave edin. 3 dakika – 2 için bir 37 ° C su banyosu içinde, F9 nadir LacZ hücre 14 bir şişe çözülme. Kaplanmış bulaşık C içine plakası hücreleri (6 ila 10 x yaklaşık 1 hücre / ml)kültür ortamının 9 ml içeren gruptur. 37 ° C 'de kültür,% 5 CO2. Ertesi gün orta değiştirin. F9 NADİR-LacZ Hücrelerinin Bakım 1:10 oranında – 3 gün, her 2 düzenli geçit koruyun. Not: Hücreler bu onların farklılaşma neden olacaktır olarak confluency içine büyümesine izin vermeyin. % 80-90 bir confluency kültürleri Böl. Ortamı çıkarın ve 1X fosfat tamponlu tuz, 10 ml (PBS) hücreleri yıkamak. 5 dakika boyunca inkübe PBS çıkarın ve tripsin 1 ml. kültür ortamı, pipet 9 ml yukarı ve aşağı ve split hücreler 01:10 geçişi için ekle. F9 NADİR-LacZ Hücreleri Dondurucu Adım 2.2.2 detaylı olarak% 90 izdiham – 80 F9 NADİR-LacZ hücreleri içeren bir 10 cm'lik çanak Trypsinize. 5 dakika boyunca 200 x g'de 15 ml santrifüj borusu ve bir dönüş ayrışmış hücreleri aktarın. F9 NADİR-LacZ f 10 ml süpernatant ve tekrar süspansiyon hücre pelet çıkarınorta reezing (bakınız Tablo 2). Kısım dondurma kaplara etiketli cryovials ve transfer şişelere 1 mi. Ertesi gün, sıvı azot tanklarına -80 ° C dondurucu O / N ve transfer şişelere kap dondurma yerleştirin. E8.5 Embriyolar 3. Diseksiyon Çiftleşme Cage Set-up ve Tak Kontrol Set-up bir çiftleşme çifti içeren bir çiftleşme kafesi. Ertesi gün sabah, vajinal fiş olup olmadığını denetlemek ve bir fiş günde 0.5 23 olarak bulunmuştur gün belirleyin. günlük E8.5, hasat embriyolar. Embriyoların Diseksiyon Servikal dislokasyon ile baraj Kurban ve% 70 etanol ile karın bölgesi sprey (bakınız Tablo 2). cerrahi makas kullanarak karın üstündeki cilde kesilmiş bir çapraz yapın ve karın bölgesi ortaya çıkarmak için ayrı (anterior ve posterior) iki flep çekin. Benzer bir kesim olunperiton üzerinde karın ortaya çıkarmak. Uterus bulun ve fallop tüplerinin gelen uterus bırakın ve makas 23 bir çift kullanarak mesometrium. PBS aşırı yağ ve kan yıkamak için 1x 10 ml 6 cm çanak (tedavi olmayan hücre kültüründe) olarak uterus yerleştirin. PBS 1x taze 10 ml içeren başka 6 cm çanak aktarın. cerrahi makas kullanarak keserek bir embriyo içeren bir rahim ayrı. rahim ve desidua çıkarın ve hiçbir iki çift kullanarak embriyo içeren yumurta sarısı kesesi bırakın. 5 forseps 23. embriyo yumurta sarısı kese Ayrı ve genotip için kullanılmak üzere, genomik DNA izolasyonu için bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne sarısı kese aktarın. tripsin 10 ul içeren bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüp içine bütün embriyoyu transfer geniş çaplı bir ucu ile bir P20 pipet kullanın. buz üzerinde tüp yerleştirin. Tüm embriyolar disseke edilene kadar 3.2.4 – Tekrar 3.2.3 adımları. embriyo Ayrılma 5 dakika enzimatik ayrışma kolaylaştırmak için 37 ° C'de tripsin embriyolar içeren 1.5 ml tüpler inkübe edin. Öğütün yavaşça embriyo mekanik ayrışması için bir P20 pipet kullanılarak ve 96 oyuklu bir plaka içerisinde, F9 nadir LacZ hücrelerinden biri üzerinde iyi bir ayrışmış embriyolu tam 10 ul hacmi plaka (F9 nadir LacZ hücreleri kaplama adımını 5.1 96 çukurlu bir tablanın bir çukuru). Kültür O / N 37 ° C'de ve% 5 CO2. 4. Laminektomi, Diseksiyon Yetişkin Lomber Spinal Kord ve Neurosphere Kültür laminektomi servikal dislokasyon ile bir yetişkin (P60) fare Kurban. % 70 etanol ile dorsal yüzü sprey ve cerrahi makas kullanarak enine kesim yapmak. sırt ve omurga sütununu maruz ayrı hem kanatlara (anterior ve posterior) çekin. cerrahi makas kullanarak, omurga kapsayan kasları keserek.kaburga altında, omuriliğin bel bölgesini bulun. makas kullanarak, derin bir kesik omuriliği ortaya çıkarmak için bu noktada omurga koparmaya olun. Hiçbir ile omurganın bel bölgesini yukarı çekin. 5 forseps omurilik maruz kalan enine kesitinin deneyci bakacak şekilde. ince makas ipuçlarını kullanarak, maruz sonu 03:00 ve 09:00 pozisyonunda omur ve kas snip. forseps ile kesilmiş vertebra dorsal kapağını tutun. Lomber spinal kord uzunluğu maruz kadar kaudal bu kesim devam ediyor. hayır kullanarak omurlar arasından omurilik bırakın. 5 yanı sıra künt uçlu forseps. DMEM / F12 kültür ortamı 3 ml içeren 15 ml'lik bir tüpe omurilik aktarın. tüm lomber omurilik izole edilene kadar buz üzerinde tutun. Spinal Kord Diseksiyon 6 cm çanak içine omurilik ile kültür ortamı dökün (non-hücre kültürü tedavi). Bir stereomikroskop altında, hiçbir iki çift kullanarak ganglionlar ve kan damarlarını tutarak omurilik segmentinde etrafında dorsal kök ganglionlar ve kan damarlarını çıkarın. 5 forseps ve yavaşça omurilik uzak çekerek. Hiçbir orta ile 6 cm çanak omurilik segmenti aktarın ve ince bir neşter bıçak kullanarak doku kıyma. Neurosphere ayrışma ortamı 1 ml içeren 15 ml'lik bir tüpe transfer Kıyılmış doku (bakınız Tablo 2). Tüm omurilik işlendikten kadar 4.2.2 – 4.2.1 adımları buz ve tekrar tüpü koyun. 10 dakika boyunca 37 ° C 'de ayrışma ortamı içinde kıyılmış doku ihtiva eden tüpler inkübe karıştırmak için yan boru fiske ve daha sonra başka bir 10 dakika daha 37 ° C'de inkübe edin. Mekanik ayrışma için çapları azalan yangın cilalı pipetler ile enzimatik sindirim, çiğnemek sonra. Not: deneyler gerçekleştirmeden önce çapları azalan yangın cilalı pipetler hazırlayın. Bir bardak Pasteur alınpipet ve temiz pamuk ile geniş ucunu. bir alkol lambası kullanarak, yangın lehçe alev pipetler ipuçları Farklı çaplarda oluşturmak için: "Normal", "para cezası", ve "ekstra para cezası". "Normal" cilalı pipetler için, çapı (~ 1 mm) düşürmeden kenarları yuvarlak alevinde pipet ucunu burgu. "Iyi" (~> 1 mm ve> 5 mm çap) ve "ekstra para cezası" (~ 0.5 mm) cilalı pipetler oluşturmak için biraz daha uzun bir süre için alev pipet ucunu döndürün. 0.5 mm'den daha az çaptaki pipetler kullanmayın. neurosphere Kültür içeren aşağı Spin tüpler 10 dakika boyunca 200 xg'de omurilik dokusu ayrışmış. Neurosphere kültür ortamı, 1 ml supernatant ve tekrar süspansiyon hücre pelletini çıkarın (bakınız Tablo 2). ayrışma kolaylaştırmak için bir P200 pipet ardından P1,000 pipet ile toz haline getirin. Not: tanıtan kabarcıkları kaçının,hangi hücre canlılığı azalacaktır. Bir hemasitometre içine Transferi ayrışmış hücrelerin 10 ul ve hücre sayımı edinin. Neurosphere kültür ortamı, 10 ml bir T25 şişesi içinde 1×10 5/10 ml yoğunlukta plaka hücreleri. Neurospheres 24 görünene kadar 7 gün boyunca CO2 37 ° C'de inkübe edilir ve% 5. neurosphere Ayrılma neurosphere kültürünü toplayın ve 15 ml tüpler transfer. 10 dakika boyunca 200 xg'de Spin. geride 1 ml bırakarak süpernatant en çıkarmak. Hücre pelletini ve tek hücre içine neurospheres ayırmak için bir P1,000 pipet ile çiğnemek. Bir hemasitometre içine Transferi ayrışmış hücrelerin 10 ul ve hücre sayımı olsun. Levha 1 x 10 5, 96 oyuklu bir plaka (96 oyuklu bir plaka içerisinde, F9 nadir LacZ kaplama için bölüm 5.1) F9 nadir LacZ bir oyuk üzerinde neurosphere hücreleri kesilerek. Plaka çoğaltır olarak 3 kuyu. Kültür O / N 37 ° C'de ve% 5 CO2. E8.5 Embriyolar ve Omurilik Neurospheres 5. RA Deneyi 96 oyuklu bir plaka kaplama F9 nadir LacZ Bir gün hasat E8.5 embriyolar veya neurospheres ayrışmasından önce, kaplama, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca oyuk başına% 0.2 jelatin, 100 ul, 96 oyuklu bir plaka. Aspire ve jelatin distile su, 200 ul iki kez yıkayın. Adım 2.2.2 detaylı olarak Trypsinize F9 NADİR-LacZ hücreleri 10 cm yemekleri sürdürdü. Levha 1 x 10 5 hücre / kuyu F9-NADİR LacZ hücreleri, ama G418 olmadan kültür ortamı kullanılarak bu sefer. , Neurospheres (3 kuyu / genotip) yanı sıra, üç kopya halinde standart bir eğri (27 oyuk) – embriyo ko-kültür (altlık boyutuna bağlı olarak 20 ~ 12) için yeterli kuyu hazırlayın. F9 NADİR-LacZ ve E8.5 Embriyolar veya Omurilik Neurospheres Co-kültür F9 üstündeki bölüm 3.2 ve plaka ayrıntılı olarak hasat embriyolarbölüm 5.1 96-plaka NADİR-LacZ. Benzer bir şekilde, Aşama 4.4 ayrıntılı olarak açıklanan 96-çukurlu plaka içinde F9 nadir LacZ üstünde Neurospheres ve plaka ayrıştırmaları. Kültür O / N 37 ° C'de ve% 5 CO2. Bir standart eğri oluşturma 100 nM, 10 nM, 1 nM, at- seri seyreltme ile 100 pM, 10 pM, 13:00, 100 FM: bir standart eğri oluşturmak için aşağıdaki konsantrasyonlarına sahip çözeltiler (en-RA), tüm-trans RA hazırlanması F9 nADİR-LacZ kültür ortamı ile RA stok (bakınız Tablo 1). bölüm 5.1 F9 NADİR-LacZ hücrelerine konsantrasyonlarda-RA de bu farklı 100 ul ekleyin. Tedavi edilmemiş F9 NADİR-LacZ hücreleri negatif kontrol olarak içeren kuyu atayın. her RA konsantrasyonu ve negatif kontrol kuyuları triplicates hazırlayın. Kültür O / N 37 ° C'de ve% 5 CO2. Not: F9 nadir LacZ hücre-trans RA değişen konsantrasyonlarda bir doza bağlı doğrusal bir şekilde yanıt verir. RA Deneyi Standart eğriler ve ko-kültürler içeren 96 oyuklu plakanın O / N kültürden sonra, ortamını çıkarın ve% 2.5 glutaraldehid, 100 ul ekleyerek kültürleri çözmek, 15 dakika boyunca oda sıcaklığında (bakınız Tablo 2). Fiksatif çıkarın ve PBS 1X 200 ul, yıkama başına 10 dakika ile iki kez yıkanır. PBS çıkarın ve LacZ yıkama çözeltisi 200 ul ile üç kez yıkama, yıkama başına 10 dk (bakınız Tablo 2). Üçüncü yıkama sırasında folyo ile sarılmış bir 15 ml tüp içinde X-gal ile boyama solüsyon hazırlanır (bakınız Tablo 2). gerekli ne kadar boyama çözeltisi hesaplayın ve uygun bir miktar (200 ul / oyuk) hazırlanması. Not: X-gal boyama çözüm duyarlı ışıktır. hazırlandıktan sonra 15 dakika içinde boyama solüsyonu kullanın. 96 oyuklu bir plaka tutmak için yeterince büyük, bir plastik kap içine damıtılmış su ile nemlendirilmiş bir kağıt havlu yerleştirerek nemlendirilmiş bir odada hazırlayın. X 200 ul eklegal boyaması 96 oyuklu plakanın her bir kuyucuğu çözeltisi ve nemlendirilmiş bir odada plaka koyun. Mavi renkli çökelti gelişimine izin vermek için 37 ° C'de 96-çukurlu plaka ihtiva eden nemlendirilmiş bir odacıkta inkübe edin. (- 16 saat 12) E8.5 embriyoların plaka O / N kuluçkaya yatmaktadır. 8 saat – neurosphere kültürler için, 4 plaka inkübe edin. OD 610 ve Görüntüleme de Absorbans Okuma renk reaksiyonundan sonra, LacZ boyama çözüm kaldırmak ve PBS 1x 200 ul ile değiştirin. RA raportör yanıtını ölçmek için standart bir ELISA plaka okuyucusu kullanılarak 610 nm'de absorbansı ölçülür. Bir kamera ile donatılmış bir standart stereomikroskop kullanılarak görüntü bireysel kuyular. F9 NADİR-LacZ Hücreleri 6. Altklonlaması RA F9 NADİR-LacZ rResponse denetleme herhangi bir deney başlamadan önce, RA için F9 NADİR-LacZ hücrelerinin tepkisini test edin. Plaka F9 NADİR-LacZ c96 oyuklu bir plaka içerisinde arşın (bakınız bölüm 5.1) ve 1 nM All-trans retinoik asit (adım 5.3) ekleyin. 37 ° de CO / N nemlendirilmiş bir oda içinde inkübe edin. Bir mikroskop kullanılarak mavi renkli çökelti gelişimini gözünüzde canlandırın. Renk geliştirme gözdeki hücrelerin boyunca düzgün değilse, aşağıda ayrıntıları altklonlanmasıyla gerçekleştirmek (sol Şekil 1B, bakınız). F9 NADİR-LacZ Hücreleri Altklonlaması Adım 2.2.2 detaylı olarak 10 cm yemekleri kültüre F9 NADİR-LacZ hücreleri bölme. Bunun yerine 1:10 oranı, her bir koloni, tek bir F9 nadir LacZ hücre ortaya çıkar, öyle ki izole edilmiş koloni büyümesine izin vermek için 10 cm'lik bir tabak içinde, 1 x 10 5 hücre / 10 mi düşük bir tohum yoğunluğu plaka. İki gün sonra, kaplama, 30 dakika boyunca oyuk başına% 0.2 jelatin 500 ul, 24 oyuklu bir plaka. Jelatin çözeltisini çıkarın ve distile su, 500 ul kuyular iki kere yıkayın. F9 nadir LacZ hücre kültür ortamında 500 ul su ile değiştirin. iyi birine steril bir P10 pipet ve transfer kullanarak bir koloni seçin; 24 ayrı koloniler elde etmek için bu 24 kez yapmak. 4 gün – 37 ° C, 3% 5 CO 2 kültür. İki 24 oyuklu plakalar içinde ayrı ayrı koloniler Böl. kültür içinde 2 gün sonra bir 24 oyuklu plaka ve Kültür O / N her bir kuyu için RA 1 nm ekleyin. yüksek yanıt test etmek için bölüm 5.4 detaylı olarak LacZ boyama yapın. Güçlü ve muntazam müdahale belirlemek için iyi bir mikroskop altında her renk reaksiyonu gözünüzde canlandırın. Güçlü bir alt klon yanıtlayıcı belirlendikten sonra, diğer 24 plaka karşılık gelen kültür genişletin. Dahası, 10 cm'lik bir çanak o koloni genişletmek bölüm 2.3 detaylı olarak çeşitli şişeleri aşağı dondurmak ve diğer tüm sömürgeleri atın. Not: Orijinal kolonilerin dörtte biri yüksek yanıt neden Sadece yaklaşık. Tipik olarak, alt klonlama ilk turda üniforma LacZ boyanma yol açmaz ve alt klonlama bir sonraki tur için yapılması gerekenüniforma güçlü müdahale elde.