Ertelenmiş Büyüme İnhibisyon Tahlili Rekabet Bakteri kaynaklı Antimikrobiyal Etkisi belirlememize
Summary
The deferred growth inhibition assay can be used to assess the competition effect by one bacterial isolate on another. Inhibition is quantified by measuring the zone of clearing around the inhibitor-producing isolate, or qualitatively assessed by determining the visible extent of inhibition.
Abstract
Competitive exclusion can occur in microbial communities when, for example, an inhibitor-producing strain outcompetes its competitor for an essential nutrient or produces antimicrobial compounds that its competitor is not resistant to. Here we describe a deferred growth inhibition assay, a method for assessing the ability of one bacterium to inhibit the growth of another through the production of antimicrobial compounds or through competition for nutrients. This technique has been used to investigate the correlation of nasal isolates with the exclusion of particular species from a community. This technique can also be used to screen for lantibiotic producers or potentially novel antimicrobials. The assay is performed by first culturing the test inhibitor-producing strain overnight on an agar plate, then spraying over the test competitor strain and incubating again. After incubation, the extent of inhibition can be measured quantitatively, through the size of the zone of clearing around the inhibitor-producing strain, and qualitatively, by assessing the clarity of the inhibition zone. Here we present the protocol for the deferred inhibition assay, describe ways to minimize variation between experiments, and define a clarity scale that can be used to qualitatively assess the degree of inhibition.
Introduction
Bacteria living in communities compete at the interspecific and intraspecific level for space and nutrients 6. Competition between microbes can often lead to exclusion of particular species or strains within a community. Exclusion can be due to competition for a particular receptor or nutrient, or the production of an antimicrobial compound by a member of the community 6.
Studies investigating competitive exclusion frequently examine the presence and absence of species using 16S rRNA sequencing 3,4,13. However, intraspecific trait variation, for example the presence or absence of antimicrobial peptide production, can hugely impact the ability of one species to inhibit another 1. Since 16S rRNA sequencing cannot distinguish between strains of the same species, intraspecific trait variation cannot be assessed. The technique described here can be used to assess the potential of individual strains to exclude other bacteria. This method has previously been used to show a positive correlation between the presence of Staphylococcus aureus inhibitory bacteria and the absence of S. aureus in a nasal community 7.
The deferred growth inhibition (competition) assay can identify production of antimicrobial compounds or nutrient competition by the inhibitor strain. It can also detect positive interactions, whereby the presence of the inhibitor strain actually improves the growth of the competitor strain. This assay can be used to create quantitative data (zone of clearing size) and qualitative data (degree of inhibition), both of which can be overlaid onto data of the presence or absence of a species within a community to find correlations between phenotype (trait) and competitive exclusion 7.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diğerlerinden ayıran, bu bakteri türleri rekabet protokolünün kritik bir safha, inhibitörün bir gece boyunca inkübasyon rakip izolatı eklenmesinden önce izole olduğu. Önleyicisi soyu önleyici bileşikleri üretmek için bu büyüme dönemi gerektirir. rakip suşu aynı ortamda üstüne bindirilmiş gibi, bu yöntem tam potansiyelini gözlemlemek için araştırmacı izin verir önleyicisi soyunun rakip suşunun büyüme müdahale etmek. Bunun bir sonucu olarak, bu deney, doğa ile ne yansıtmaktadır; bir izole tamamen niş yılında kurulmuş, ve diğer başarılı niş işgal edebilmek için herhangi bir inhibitör değişkenleri karşı gerekir.
Yanlış yapıldığı takdirde hatalı sonuçlara neden büyük olasılıkla bu protokol iki bölümü vardır. Birincisi, buharlaştırıcı şişe eksik sterilizasyon tahlil içine bakteri kirlenmesine neden tanıtabilirsiniz. incusteril bir kap içinde aşama 3.6 buharlaştırıcı şişe yıkamak için kullanılan broth Bation tamamen sterilize edildi şişe teyit etmek için kullanılabilir. Ek sterilizasyon gerekli ise, örneğin, Virkon® dezenfekte edici çözeltiler Ek yıkama, aşama 3.2'de tanımlanan yüzey etkili temizleme maddesinin yıkama, önce kullanılabilir.
hatalı sonuçlara neden olabilir ikinci aşama rakip suşu (adım 6.1) seyreltme olduğunu. Seyreltme uygun değilse, inhibisyon net ölçümler kolayca tespit edilemez. Bu deney, önleyici üreten S. karşı Gram-pozitif ve Gram-negatif türler geniş bir yelpazesinde suşları gibi çeşitli nazal izolatları kullanılarak optimize edildi rakip suşu 7,8 olarak aureus SH1000. Bu daha sonra rakip ve inhibitörü üreten suşlar gibi çeşitli-koagülaz negatif ve koagulaz pozitif stafilokok kullanılarak test edilmiştir. rakip olarak yukarıda tarif edilenler dışındaki cins test ederkensuşu, inokulum için seyreltme bazı optimizasyon gerekli olabilir.
berraklık puanları tekrarlar arasında anlamlı farklılık varsa, belirli bir optik yoğunluk olarak ayarlayarak rakip gerilme inokulum standardize etmek gerekli olabilir. Bununla birlikte, bu deney ayarlamak için gereken ve deney için işlem mümkündür suşları sayısının azaltılması olası zaman artar. Görme hızlı bir alternatif sağlayabilir bir McFarland standardı kullanılarak uygun bir OD kültürünü ayarlayarak.
Bu tekniğin bir sınırlama sadece kültürlenebilir bakterilerin uygulanabilir bunun olmasıdır. Birçok çalışmada rekabet dışlama etkileşimleri 3,4,13 tahmin 16S rRNA sıralamasını kullanmak nedeni budur. Ancak, genetik ve metagenomic teknikler sadece tür düzeyinde topluluk üyelerini ayırt edebilir ve / veya belirli bir tür içi özellik varyasyonu için hesaba katmıyor. Bir özelde, dernek taranması mümkünBir bakteri türlerinin 5 varlığında ya da yokluğunda bir özelliği kodlamaktadır ar geni, ancak bu tür hariç ile bağlantılı olması muhtemel bir genin ön bilgi gerektirir.
Bu tekniğin bir güvenlik dikkate bakterilerin aerosol üretimi nedeniyle, sadece bir seviye 2 güvenlik kabini ile laboratuarlarda kullanılan ya da benzer güvenlik önlemleri ile olabilir olmasıdır. intraspecific özellik değişimi için hesap ve bakteri aerosollerin üretemeyen izolatlar arasındaki rekabet test etmek için alternatif teknikler vardır. Böyle bir yöntem, aynı anda antagonizma deney 2 'dir. Bu yöntemde, bir izolatın, bir aşı, bir agar plakası üzerine yayılır, ve birinci kuruduktan sonra, ikinci bir izole aşı En lekeli veya yaralanmıştır. Bu, hem inhibitör bileşikler üretirler ve ilk besin temizlemek için yarışan, suşlar doğrudan rekabet (eşzamanlı antagonizma) olarak bir ortam üretecektir. advantageşzamanlı antagonizma tahlil üzerinden ertelenmiş büyüme inhibisyonu testinin e inhibitörü izolatı her zaman tam rakip izolatı işgalinden önce kurulmakta olan rekabet avantajına sahip olmasıdır. Başka bir suş yerine iki izolat aynı anda 8 ilave olmaktan çok, ilave edilmeden önce, bir izolatın kurulacak çoğu niş olarak bu, çevrede ne olacağını daha yansıtıcı olduğunu.
Başka bir alternatif döktü ziyade önleyici izolatı üzerinde püskürtülür olabilir üst agar izole rakibi eklemek olacaktır bakterilerin aerosol oluşumunu engellemek için. Bununla birlikte, üst agar eklenmiş hacmi plaka da kapsama sağlamak için yaklaşık olarak 3 ml olması gerekir. Bu hacim içinde, rakip izolat inhibitörü izolatı aynı ortam üzerinde büyüyen olmaz, bu yüzden azalmış besin muzdarip olmaz. Yarışmacı, aynı zamanda UNT bir önleyici bileşikler ile doğrudan temas halinde olmazil onlar üst agar içine yayılmış. Böyle bir deney, ertelenmiş inhibisyonu veya aynı anda antagonizmi olarak tarif edilememiştir.
Benzer bir yöntem, daha önce klinik S. arasında basitrasin direnci düzeylerini değerlendirmek için kullanılmıştır aureus 10 ayırır. 10 tarif burada tarif edilen protokol ve arasındaki temel fark, duyarlı (0 puan inhibisyon netlik tamamlamak) ya da dirençli ikinci sadece gizli rakip suşları (hiçbir inhibisyon netlik kısmi skor 1-5). Ertelenmiş bir büyüme önleme deneyi Bu yüzden, aynı zamanda, çok ilaca dirençli patojenlere karşı aktif yeni antimikrobiyal aramak için daha özel bir antimikrobiyal, veya üretici direnç seviyeleri taranması için kullanılabilir.
Ev sahibi mikroflora bakteriyel eden 9 istenmeyen temsilcilerinin ortadan kaldırmak için manipüle edilebilir olduğu ileri sürülmüştür. Corynebacterium türü ya Staph Uygulamaylococcus epidermidis önce S. ortadan kaldırmak için gösterilmiştir Nüfusun 11,12 önemli bir oranda burun içinde aureus kolonizasyonu. rekabetçi, burada anlatılan gibi teknikler vasıtasıyla ev sahibi bitki istenmeyen temsilcilerinin, dahil belirli suşlarından içine çalışmalar bu nedenle gelecekteki terapötik yol olabilir.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JCM Unilever Plc (BB / L023040 / 1) ile BBSRC-IPA ödülü tarafından finanse edilmektedir. YY Yükseköğretim Doktora öğrencilik bir Suudi Arabistan Bakanlığı tarafından finanse edilmektedir.
Materials
| Brain heart infusion broth | Lab M | lab049 | rich general purpose media |
| agar-agar | Merck Milipore | 101614 | |
| petri dishes | Sarstedt | 82.1473.001 | |
| plastic perfume vaporizer | not known | – | 10 cm high with 3.5 cm diameter clear plastic spray bottle with lid, purchased from the travel section of a supermarket |
| Universal bottles | no longer in production, alternative SLS BOT5006 | 28 ml glass cylindrical bottle (approx 280 mm diameter, 850 mm height), flat bottomed with plastic screw cap | |
| Decon 90 | Decon | surface active cleaning agent |
Riferimenti
- Bolnick, D. I., et al. Why intraspecific trait variation matters in community ecology. Trends Ecol Evol. 26 (4), 183-192 (2011).
- Christensen, G. J. M., et al. Antagonism between Staphylococcus epidermidis and Propionibacterium acnes and its genomic basis. BMC Genomics. 17 (152), (2016).
- Faust, K., et al. Microbial co-occurrence relationships in the human microbiome. PloS Comput Biol. 8 (7), (2012).
- Frank, D. N., Feazel, L. M., Bessesen, M. T., Price, C. S., Janoff, E. N., Pace, N. R. The Human nasal microbiota and Staphylococcus aureus carriage. PLoS One. 5 (5), e10598 (2010).
- Fredheim, E. G., Flaegstad, T., Askarian, F., Klingenberg, C. Colonisation and interaction between S. epidermidis and S. aureus in the nose and throat of healthy adolescents. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 34, 123-129 (2015).
- Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle. Nat Rev Microbiol. 8, 15-25 (2010).
- Libberton, B., Coates, R. E., Brockhurst, M. A., Horsburgh, M. J. Evidence that intraspecific trait variation among nasal bacteria shapes the distribution of Staphylococcus aureus. Infect Immun. 82 (9), 3811-3815 (2014).
- Libberton, B., Horsburgh, M. J., Brockhurst, M. A. The effects of spatial structure, frequency dependence and resistance evolution on the dynamics of toxin-mediated microbial invasions. Evol appl. 8, 738-750 (2015).
- Liu, C. M., et al. Staphylococcus aureus and the ecology of the nasal microbiome. Sci Adv. 1, e1400216 (2015).
- Nascimento, J. S., Ceotto, H., Nascimento, S. B., Giambiagi-deMarval, M., Santos, K. R., Bastos, M. C. Bacteriocins are alternative agents for control of multiresistant staphylococcal strains. Lett Appl Microbiol. 42, 215-221 (2006).
- Park, B., Iwase, T., Liu, G. Y. Intranasal application of S. epidermidis prevents colonization by methicillin-resistant Staphylococcus aureus in mice. PLoS One. 6 (10), e25880 (2011).
- Uehara, Y., et al. Bacterial interference among nasal inhabitants: eradication of Staphylococcus aureus from nasal cavities by artificial implantation of Corynebacterium sp. J Hosp Infect. 44, 127-133 (2000).
- Wos-Oxley, M. L., et al. A poke into the diversity and associations within human anterior nare microbial communities. ISME J. 4, 839-851 (2010).
