Crecimiento diferida Ensayo de inhibición para cuantificar el efecto de antimicrobianos de bacterias derivadas de la Competencia
Summary
The deferred growth inhibition assay can be used to assess the competition effect by one bacterial isolate on another. Inhibition is quantified by measuring the zone of clearing around the inhibitor-producing isolate, or qualitatively assessed by determining the visible extent of inhibition.
Abstract
Competitive exclusion can occur in microbial communities when, for example, an inhibitor-producing strain outcompetes its competitor for an essential nutrient or produces antimicrobial compounds that its competitor is not resistant to. Here we describe a deferred growth inhibition assay, a method for assessing the ability of one bacterium to inhibit the growth of another through the production of antimicrobial compounds or through competition for nutrients. This technique has been used to investigate the correlation of nasal isolates with the exclusion of particular species from a community. This technique can also be used to screen for lantibiotic producers or potentially novel antimicrobials. The assay is performed by first culturing the test inhibitor-producing strain overnight on an agar plate, then spraying over the test competitor strain and incubating again. After incubation, the extent of inhibition can be measured quantitatively, through the size of the zone of clearing around the inhibitor-producing strain, and qualitatively, by assessing the clarity of the inhibition zone. Here we present the protocol for the deferred inhibition assay, describe ways to minimize variation between experiments, and define a clarity scale that can be used to qualitatively assess the degree of inhibition.
Introduction
Bacteria living in communities compete at the interspecific and intraspecific level for space and nutrients 6. Competition between microbes can often lead to exclusion of particular species or strains within a community. Exclusion can be due to competition for a particular receptor or nutrient, or the production of an antimicrobial compound by a member of the community 6.
Studies investigating competitive exclusion frequently examine the presence and absence of species using 16S rRNA sequencing 3,4,13. However, intraspecific trait variation, for example the presence or absence of antimicrobial peptide production, can hugely impact the ability of one species to inhibit another 1. Since 16S rRNA sequencing cannot distinguish between strains of the same species, intraspecific trait variation cannot be assessed. The technique described here can be used to assess the potential of individual strains to exclude other bacteria. This method has previously been used to show a positive correlation between the presence of Staphylococcus aureus inhibitory bacteria and the absence of S. aureus in a nasal community 7.
The deferred growth inhibition (competition) assay can identify production of antimicrobial compounds or nutrient competition by the inhibitor strain. It can also detect positive interactions, whereby the presence of the inhibitor strain actually improves the growth of the competitor strain. This assay can be used to create quantitative data (zone of clearing size) and qualitative data (degree of inhibition), both of which can be overlaid onto data of the presence or absence of a species within a community to find correlations between phenotype (trait) and competitive exclusion 7.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un paso crítico de este protocolo la competencia de especies bacterianas que lo diferencia de los demás, es la incubación durante la noche del inhibidor de aislar antes de la adición del aislado competidor. La cepa inhibidor requiere este período de crecimiento para producir compuestos inhibidores. Como la cepa competidor se superpone en la parte superior del mismo medio, este método permite al investigador observar el potencial de la cepa inhibidor para interferir con el crecimiento de la cepa competidor. Como resultado, este ensayo refleja lo que sucede con la naturaleza; un aislado está plenamente establecido en un nicho, y el otro debe ser capaz de contrarrestar cualquier variable de inhibidores para ser capaces de invadir con éxito el nicho.
Hay dos partes en el presente Protocolo que son más susceptibles de causar resultados erróneos si se realiza de forma incorrecta. En primer lugar, la esterilización incompleta de las botellas vaporizador puede introducir bacterias contaminantes en el ensayo. Incubación del caldo utilizado para enjuagar la botella vaporizador en el paso 3.6 en un recipiente estéril se puede utilizar para confirmar botellas fueron completamente esterilizado. lavados adicionales en soluciones desinfectantes, tales como Virkon, se pueden utilizar antes de la colada en agente de limpieza de superficie activa, que se describe en el paso 3.2, si se requiere esterilización adicional.
Un segundo paso que puede causar resultados erróneos es la dilución de la cepa competidora (paso 6.1). Si la dilución no es óptima, las mediciones claras de inhibición no se pueden determinar fácilmente. Este ensayo se optimizó el uso de diversos aislados nasales como inhibidor de cepas productoras través de una amplia gama de especies Gram-positivas y Gram-negativas frente a S. SH1000 aureus como el 7,8 cepa competidor. Posteriormente, se ha probado el uso de varios estafilococos coagulasa-negativos y coagulasa positivos como competidor y cepas productoras de inhibidor. Al probar géneros distintos de los descritos anteriormente como el competidorcepa, cierta optimización de la dilución para el inóculo puede ser necesario.
Si las puntuaciones de claridad varían significativamente entre las repeticiones, podría ser necesario estandarizar el inóculo cepa competidor estableciéndola en una densidad óptica específica. Sin embargo, esto aumentará el tiempo de ensayo necesario para configurar, y es probable que reduzca el número de cepas es posible procesar en cada experimento. ajustar visualmente la cultura a un OD apropiada utilizando un estándar de McFarland puede proporcionar una alternativa rápida.
Una limitación de esta técnica es que sólo se puede aplicar a bacterias cultivables. Por ello, muchos estudios utilizan la secuenciación del 16S rRNA para predecir las interacciones de exclusión competitiva 3,4,13. Sin embargo, las técnicas genéticas y metagenomic sólo pueden distinguir a los miembros de la comunidad a nivel de especie, y / o no tienen en cuenta en particular rasgo variación intraespecífica. Es posible detectar la asociación de un particulgen ar que codifica un rasgo con la presencia o ausencia de una especie bacteriana 5, sin embargo, esto requiere conocimiento previo de un gen probable que esté asociado con la exclusión de una especie.
Una consideración de seguridad de esta técnica es que, debido a la generación de aerosoles de bacterias, sólo puede ser utilizado en los laboratorios con una cabina de seguridad de nivel 2, o con las precauciones de seguridad similares. Existen técnicas alternativas para la prueba de la competencia entre los aislados que dan cuenta de la variación intraespecífica rasgo y no generan aerosoles de bacterias. Uno de tales métodos es el ensayo de antagonismo simultánea 2. En este método, un inóculo de un aislado se extiende sobre una placa de agar, y un segundo inóculo aislado presenta puntos o acuchillado en la parte superior una vez que el primero se haya secado. Esto produciría un ambiente donde las cepas están en competencia directa (antagonismo simultánea), ambos compitiendo para producir compuestos inhibidores y compactar los nutrientes en primer lugar. el advantage del ensayo de inhibición del crecimiento diferido durante el ensayo de antagonismo simultánea es que el aislado inhibidor siempre debe tener la ventaja competitiva de ser plenamente establecida antes de la invasión del aislado competidor. Esto es más un reflejo de lo que sucedería en el medio ambiente, como en la mayoría de los nichos, se establecerá un aislado antes de añadir otra cepa, en lugar de dos aislamientos que se agregan al mismo tiempo 8.
Otra alternativa para evitar la generación de aerosoles de bacterias sería añadir el competidor aislar en agar superior, lo que podría ser vertido en lugar de pulverizar sobre el aislado de inhibidor. Sin embargo, el volumen de agar superior añadido tendría que ser de aproximadamente 3 ml para asegurar una cobertura uniforme de la placa. Dentro de este volumen, el aislado competidor no sería cada vez mayor en los mismos medios de comunicación como el aislado de inhibidor, por lo que no sufriría de nutrientes reducidos. El competidor tampoco estaría en contacto directo con los compuestos inhibidores de la UNTil se difunde en el agar superior. Tal ensayo no puede ser descrito como la inhibición o el antagonismo diferido simultánea.
Un método similar se ha utilizado anteriormente para evaluar los niveles de resistencia a la bacitracina entre S. clínica aureus 10. La principal diferencia entre el protocolo descrito aquí y que se describe en un 10, es las últimas cepas competidor solamente clasificados como sensibles (completar la claridad inhibition- marcó el 0) o resistentes (parciales o ninguna claridad inhibition- anotar 1-5). El ensayo de inhibición de crecimiento diferido, por tanto, podría también ser utilizado para la detección de niveles de resistencia a los productores de determinados antimicrobianos, o incluso para buscar nuevos antibióticos activos contra los patógenos resistentes a múltiples fármacos.
Se ha sugerido que la microflora huésped podrían ser manipuladas para eliminar los miembros no deseados de la comunidad bacteriana 9. Aplicación de corinebacterias o estafilococoylococcus epidermidis ya se ha demostrado para eliminar S. colonización aureus en las fosas nasales en una proporción significativa de la población 11,12. Los estudios sobre cepas específicas que pueden excluir competitivamente miembros indeseables de la flora de acogida, a través de técnicas como la descrita aquí, por lo tanto, pueden dar lugar a futuras terapias.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JCM es financiado por un premio BBSRC-IPA con Unilever Plc (BB / L023040 / 1). AST es financiado por un árabe Ministerio de Educación Superior de doctorado beca de educación de Arabia.
Materials
| Brain heart infusion broth | Lab M | lab049 | rich general purpose media |
| agar-agar | Merck Milipore | 101614 | |
| petri dishes | Sarstedt | 82.1473.001 | |
| plastic perfume vaporizer | not known | – | 10 cm high with 3.5 cm diameter clear plastic spray bottle with lid, purchased from the travel section of a supermarket |
| Universal bottles | no longer in production, alternative SLS BOT5006 | 28 ml glass cylindrical bottle (approx 280 mm diameter, 850 mm height), flat bottomed with plastic screw cap | |
| Decon 90 | Decon | surface active cleaning agent |
Riferimenti
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