The deferred growth inhibition assay can be used to assess the competition effect by one bacterial isolate on another. Inhibition is quantified by measuring the zone of clearing around the inhibitor-producing isolate, or qualitatively assessed by determining the visible extent of inhibition.
Competitive exclusion can occur in microbial communities when, for example, an inhibitor-producing strain outcompetes its competitor for an essential nutrient or produces antimicrobial compounds that its competitor is not resistant to. Here we describe a deferred growth inhibition assay, a method for assessing the ability of one bacterium to inhibit the growth of another through the production of antimicrobial compounds or through competition for nutrients. This technique has been used to investigate the correlation of nasal isolates with the exclusion of particular species from a community. This technique can also be used to screen for lantibiotic producers or potentially novel antimicrobials. The assay is performed by first culturing the test inhibitor-producing strain overnight on an agar plate, then spraying over the test competitor strain and incubating again. After incubation, the extent of inhibition can be measured quantitatively, through the size of the zone of clearing around the inhibitor-producing strain, and qualitatively, by assessing the clarity of the inhibition zone. Here we present the protocol for the deferred inhibition assay, describe ways to minimize variation between experiments, and define a clarity scale that can be used to qualitatively assess the degree of inhibition.
Bacteria living in communities compete at the interspecific and intraspecific level for space and nutrients 6. Competition between microbes can often lead to exclusion of particular species or strains within a community. Exclusion can be due to competition for a particular receptor or nutrient, or the production of an antimicrobial compound by a member of the community 6.
Studies investigating competitive exclusion frequently examine the presence and absence of species using 16S rRNA sequencing 3,4,13. However, intraspecific trait variation, for example the presence or absence of antimicrobial peptide production, can hugely impact the ability of one species to inhibit another 1. Since 16S rRNA sequencing cannot distinguish between strains of the same species, intraspecific trait variation cannot be assessed. The technique described here can be used to assess the potential of individual strains to exclude other bacteria. This method has previously been used to show a positive correlation between the presence of Staphylococcus aureus inhibitory bacteria and the absence of S. aureus in a nasal community 7.
The deferred growth inhibition (competition) assay can identify production of antimicrobial compounds or nutrient competition by the inhibitor strain. It can also detect positive interactions, whereby the presence of the inhibitor strain actually improves the growth of the competitor strain. This assay can be used to create quantitative data (zone of clearing size) and qualitative data (degree of inhibition), both of which can be overlaid onto data of the presence or absence of a species within a community to find correlations between phenotype (trait) and competitive exclusion 7.
Une étape cruciale de ce protocole de la concurrence des espèces bactériennes qui le différencie des autres, est l'incubation pendant la nuit de l'inhibiteur isoler avant l' addition de l'isolat de concurrent. La souche inhibiteur nécessite cette période de croissance pour produire des composés inhibiteurs. Comme la souche concurrent est superposé au-dessus du même milieu, cette méthode permet au chercheur d'observer le plein potentiel de la souche inhibiteur d'interférer avec la croissance de la souche concurrent. Par conséquent, cet essai reflète ce qui se passe avec la nature; un isolat est pleinement établie dans une niche, et l'autre doit être capable de neutraliser toutes les variables inhibitrices pour être en mesure d'envahir avec succès le créneau.
Il y a deux parties à ce protocole qui sont les plus susceptibles d'entraîner des résultats erronés si elle est effectuée de manière incorrecte. Tout d'abord, la stérilisation incomplète des bouteilles de vaporisateur peut introduire des bactéries contaminantes dans le dosage. Incubation du bouillon utilisé pour rincer la bouteille de vaporisation à l'étape 3.6, dans un récipient stérile peut être utilisée pour confirmer les bouteilles ont été complètement stérilisé. lavages supplémentaires dans des solutions désinfectantes, comme Virkon, peuvent être utilisés avant le lavage en surface agent de nettoyage actif, décrit à l'étape 3.2, si la stérilisation supplémentaire est nécessaire.
Une deuxième étape qui peut entraîner des résultats erronés est la dilution de la souche concurrent (étape 6.1). Si la dilution ne sont pas optimales, des mesures précises de l'inhibition ne peuvent pas être facilement déterminées. Cet essai a été optimisée en utilisant différents isolats nasaux comme inhibiteur des souches productrices dans un large éventail d'espèces Gram-positives et Gram-négatives par rapport à S. aureus SH1000 comme souche concurrent 7,8. Il a ensuite été testé à l'aide de divers staphylocoques à coagulase négative et à coagulase positive en tant que concurrent et un inhibiteur des souches productrices. Lors du test de genres autres que ceux décrits ci-dessus comme le concurrentsouche, une certaine optimisation de la dilution de l'inoculum peut être nécessaire.
Si les scores de clarté varient considérablement entre les répétitions, il pourrait être nécessaire de normaliser la souche concurrent inoculum en la fixant à une densité optique spécifique. Cependant, cela va augmenter le temps le dosage nécessaire pour mettre en place, et est susceptible de réduire le nombre de souches, il est possible de traiter par expérience. ajuster visuellement la culture à une DO appropriée en utilisant un standard McFarland peut fournir une alternative rapide.
Une limitation de cette technique est qu'elle ne peut être appliquée aux bactéries cultivables. Voilà pourquoi de nombreuses études utilisent 16S séquençage ARNr pour prédire les interactions d'exclusion compétitive 3,4,13. Cependant, les techniques génétiques et métagénomiques ne peuvent distinguer les membres de la communauté au niveau de l'espèce, et / ou ne pas tenir compte de la variation particulière de trait intraspécifique. Il est possible de cribler pour l'association d'un particular gène qui code pour un trait à la présence ou l' absence d'une espèce bactérienne 5, mais cela nécessite une connaissance préalable d'un gène susceptible d'être associé à l' exclusion d'une espèce.
Un examen de cette technique de sécurité est que, en raison de la génération d'aérosol de bactéries, il ne peut être utilisé dans les laboratoires d'une enceinte de sécurité de niveau 2, soit avec des précautions de sécurité similaires. Il existe des techniques alternatives pour tester la concurrence entre les isolats qui représentent intraspécifique la variation des caractéristiques et ne génèrent pas d'aérosols de bactéries. Un tel procédé est l'antagonisme dosage simultané 2. Dans cette méthode, un inoculum d'un isolat est étalée sur une plaque de gélose, et un second inoculum d'isolat est repéré ou poignardé sur le dessus une fois que le premier a séché. Cela produirait un environnement où les souches sont en concurrence directe (antagonisme simultané), à la fois en compétition pour produire des composés inhibiteurs et piéger les nutriments en premier. Le Advantage du différé test d'inhibition de la croissance au cours du test de l'antagonisme simultané est que l'isolat d'inhibiteur doit toujours avoir l'avantage concurrentiel d'être pleinement établie avant l'invasion de l'isolat de concurrent. Ceci est plus le reflet de ce qui se passerait dans l'environnement, comme dans la plupart des niches, un isolat sera établi avant une autre souche est ajoutée, plutôt que deux isolats sont ajoutés en même temps 8.
Une autre alternative pour éviter la production d'aérosols de bactéries serait d'ajouter le concurrent d'isoler dans la gélose supérieure, ce qui pourrait être versé plutôt que pulvérisé sur l'isolat d'inhibiteur. Cependant, le volume de gélose ajoutée devrait être d'environ 3 ml pour assurer une couverture uniforme de la plaque. Dans ce volume, l'isolat concurrent ne serait pas de plus en plus sur les mêmes supports que l'isolat d'inhibiteur, donc ne souffrirait pas de nutriments réduits. Le concurrent ne serait également pas en contact direct avec des composés inhibiteurs until leur diffusion dans l'agar-agar en haut. Un tel essai ne peut pas être décrit comme l'inhibition différée ou simultanée antagonisme.
Une méthode similaire a déjà été utilisé pour évaluer les niveaux de résistance à la bacitracine chez S. clinique aureus 10. La principale différence entre le protocole décrit ici et qui a été décrit par 10, sont les dernières souches concurrentes uniquement classées comme sensibles (compléter la clarté inhibition- marquer 0) ou résistants (partielles pas de clarté inhibition- marquer 1-5). Le test d'inhibition de la croissance différée pourrait donc également être utilisé pour dépister les niveaux de résistance aux producteurs d'antimicrobiens particuliers, ou même à la recherche de nouveaux antimicrobiens actifs contre les agents pathogènes multirésistantes.
Il a été suggéré que la microflore de l' hôte peuvent être manipulées pour éliminer les éléments indésirables de la communauté bactérienne 9. Application de corynébactéries ou Staphylococcus epidermidis ont déjà été montré pour éliminer S. aureus colonisation dans les fosses nasales , dans une proportion significative de la population 11,12. Les études portant sur des souches spécifiques qui peuvent exclure la concurrence des membres indésirables de la flore d'accueil, grâce à des techniques telles que celle décrite ici, peut donc conduire à la thérapeutique à venir.
The authors have nothing to disclose.
JCM est financé par une bourse BBSRC-IPA avec Unilever Plc (BB / L023040 / 1). HAG est financé par un saoudien Ministère de l'Enseignement supérieur PhD studentship.
Brain heart infusion broth | Lab M | lab049 | rich general purpose media |
agar-agar | Merck Milipore | 101614 | |
petri dishes | Sarstedt | 82.1473.001 | |
plastic perfume vaporizer | not known | – | 10 cm high with 3.5 cm diameter clear plastic spray bottle with lid, purchased from the travel section of a supermarket |
Universal bottles | no longer in production, alternative SLS BOT5006 | 28 ml glass cylindrical bottle (approx 280 mm diameter, 850 mm height), flat bottomed with plastic screw cap | |
Decon 90 | Decon | surface active cleaning agent |