Crescita differita Inibizione test per quantificare l'effetto di antimicrobici batteri derivati sulla concorrenza
Summary
The deferred growth inhibition assay can be used to assess the competition effect by one bacterial isolate on another. Inhibition is quantified by measuring the zone of clearing around the inhibitor-producing isolate, or qualitatively assessed by determining the visible extent of inhibition.
Abstract
Competitive exclusion can occur in microbial communities when, for example, an inhibitor-producing strain outcompetes its competitor for an essential nutrient or produces antimicrobial compounds that its competitor is not resistant to. Here we describe a deferred growth inhibition assay, a method for assessing the ability of one bacterium to inhibit the growth of another through the production of antimicrobial compounds or through competition for nutrients. This technique has been used to investigate the correlation of nasal isolates with the exclusion of particular species from a community. This technique can also be used to screen for lantibiotic producers or potentially novel antimicrobials. The assay is performed by first culturing the test inhibitor-producing strain overnight on an agar plate, then spraying over the test competitor strain and incubating again. After incubation, the extent of inhibition can be measured quantitatively, through the size of the zone of clearing around the inhibitor-producing strain, and qualitatively, by assessing the clarity of the inhibition zone. Here we present the protocol for the deferred inhibition assay, describe ways to minimize variation between experiments, and define a clarity scale that can be used to qualitatively assess the degree of inhibition.
Introduction
Bacteria living in communities compete at the interspecific and intraspecific level for space and nutrients 6. Competition between microbes can often lead to exclusion of particular species or strains within a community. Exclusion can be due to competition for a particular receptor or nutrient, or the production of an antimicrobial compound by a member of the community 6.
Studies investigating competitive exclusion frequently examine the presence and absence of species using 16S rRNA sequencing 3,4,13. However, intraspecific trait variation, for example the presence or absence of antimicrobial peptide production, can hugely impact the ability of one species to inhibit another 1. Since 16S rRNA sequencing cannot distinguish between strains of the same species, intraspecific trait variation cannot be assessed. The technique described here can be used to assess the potential of individual strains to exclude other bacteria. This method has previously been used to show a positive correlation between the presence of Staphylococcus aureus inhibitory bacteria and the absence of S. aureus in a nasal community 7.
The deferred growth inhibition (competition) assay can identify production of antimicrobial compounds or nutrient competition by the inhibitor strain. It can also detect positive interactions, whereby the presence of the inhibitor strain actually improves the growth of the competitor strain. This assay can be used to create quantitative data (zone of clearing size) and qualitative data (degree of inhibition), both of which can be overlaid onto data of the presence or absence of a species within a community to find correlations between phenotype (trait) and competitive exclusion 7.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un punto critico di questo protocollo batterica concorso specie che lo differenzia dagli altri, è la notte di incubazione dell'inibitore isolare prima dell'aggiunta dell'isolato concorrente. Il ceppo inibitore richiede questo periodo di crescita per la produzione di composti inibitori. Poiché il ceppo concorrente pone sopra lo stesso mezzo, questo metodo consente al ricercatore di osservare l'intero potenziale del ceppo inibitore di interferire con la crescita del ceppo concorrente. Come risultato, questo saggio riflette ciò che accade con la natura; un isolato è completamente stabilito in una nicchia, e l'altro deve essere in grado di contrastare eventuali variabili inibitori di essere in grado di invadere con successo la nicchia.
Ci sono due parti di questo protocollo che hanno più probabilità di causare risultati errati se eseguita in modo non corretto. In primo luogo, la sterilizzazione incompleta delle bottiglie vaporizzatore può introdurre batteri contaminanti nel dosaggio. Incubation del brodo utilizzata per risciacquare il flacone vaporizzatore nel passaggio 3.6 in un recipiente sterile può essere usato per confermare bottiglie erano completamente sterilizzato. Altri lavaggi in soluzioni disinfettanti, come Virkon, possono essere utilizzate prima del lavaggio in superficie del detergente attiva, descritta nel passaggio 3.2, se è necessaria sterilizzazione aggiuntiva.
Un secondo passo che può causare risultati errati è la diluizione del ceppo concorrente (passo 6.1). Se la diluizione non è ottimale, chiare misurazioni di inibizione non possono essere facilmente determinati. Questo test è stato ottimizzato utilizzando vari isolati nasali come inibitore-ceppi produttori in una vasta gamma di specie di batteri Gram-positivi e Gram-negativi contro S. aureus SH1000 come il 7,8 ceppo concorrente. In seguito è stato testato utilizzando vari stafilococchi coagulasi-negativi e coagulasi-positivi come concorrente e ceppi inibitore-produzione. Durante la prova di generi diversi da quelli descritti sopra come il competitoreceppo, qualche ottimizzazione della diluizione per l'inoculo può essere necessario.
Se i punteggi chiarezza variano in modo significativo tra le ripetizioni, potrebbe essere necessario standardizzare l'inoculo ceppo concorrente impostandolo a una densità ottica specifica. Tuttavia, questo aumenta il tempo dosaggio necessario per impostare, ed è in grado di ridurre il numero di ceppi è possibile elaborare per esperimento. Visivamente regolando la cultura ad un OD appropriato utilizzando uno standard McFarland può fornire una rapida alternativa.
Una limitazione di questa tecnica è che può essere applicato solo a batteri coltivabili. Questo è il motivo per cui molti studi utilizzano 16S rRNA sequenziamento di predire le interazioni di esclusione competitiva 3,4,13. Tuttavia, le tecniche genetiche e metagenomiche può distinguere solo i membri della comunità a livello di specie, e / o non tenere conto di particolare variazione intraspecifica tratto. E 'possibile selezionare per l'associazione di un particulgene ar che codifica un tratto con la presenza o l'assenza di una specie batterica 5, tuttavia ciò richiede pre-conoscenza di un gene probabilmente associati con esclusione di una specie.
Una considerazione sicurezza di questa tecnica è che, a causa della generazione di aerosol di batteri, esso può essere utilizzato solo in laboratori con un armadietto di sicurezza di livello 2, o con simili precauzioni di sicurezza. Ci sono tecniche alternative per testare la concorrenza tra gli isolati che rappresentano la variazione intraspecifica tratto e non generano aerosol di batteri. Uno di questi metodi è il dosaggio simultaneo dell'antagonismo 2. In questo metodo, un inoculo di un isolato si sviluppa su una piastra di agar, e un secondo inoculo isolato è macchiata o pugnalato sopra una volta che il primo si è asciugato. Ciò produrrebbe un ambiente in cui le tensioni sono in concorrenza diretta (antagonismo simultanea), sia in competizione per la produzione di composti inibitori e scavenging nutrienti prima. il advantage del test di inibizione della crescita differita nel corso del test antagonismo simultanea è che l'isolato inibitore deve sempre avere il vantaggio competitivo di essere completamente stabilita prima dell'invasione dell'isolato concorrente. Questo è più riflettente di ciò che succederebbe nell'ambiente, come nella maggior parte nicchie, sarà stabilito un isolato prima che venga aggiunto un altro ceppo, piuttosto che due isolati aggiunti contemporaneamente 8.
Un'altra alternativa per evitare la generazione di aerosol di batteri sarebbe aggiungere il concorrente isolare in cima agar, che potrebbe essere versato anziché spruzzata sulla isolare inibitore. Tuttavia, il volume della parte superiore agar aggiunto dovrebbe essere di circa 3 ml di garantire una copertura uniforme della piastra. All'interno di questo volume, l'isolato concorrente non sarebbe cresce sugli stessi media come l'isolato inibitore, in modo da non soffrire di nutrienti ridotti. Il concorrente sarebbe anche non essere in contatto diretto con tutti i composti inibitori until loro diffuso nella top agar. Tale test non potrebbe essere descritto come l'inibizione differito o antagonismo simultanea.
Un metodo simile è stato precedentemente utilizzato per valutare i livelli di resistenza bacitracina tra S. clinica aureus isolati 10. La differenza principale tra il protocollo descritto qui e quello descritto da 10, è quest'ultimo ceppi concorrenti classificati come sensibili (completare chiarezza inhibition- punteggio 0) o resistenti (parziali chiarezza inhibition- punteggio 1-5). Il test di inibizione della crescita differita potrebbe quindi anche essere usato per individuare i livelli di resistenza ai produttori di particolari antimicrobici, o anche per la ricerca di nuovi antimicrobici attivi contro i patogeni multi-farmaco resistente.
È stato suggerito che la microflora ospitanti possono essere manipolati per eliminare componenti indesiderabili della comunità batterica 9. L'applicazione di corinebatteri o stafilococcoylococcus epidermidis hanno già dimostrato di eliminare S. aureus colonizzazione nelle narici in una percentuale significativa della popolazione 11,12. Studi in ceppi specifici che possono competitivamente escludere membri indesiderabili della flora ospitanti, attraverso tecniche come quella qui descritta, può quindi portare a terapie future.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JCM è finanziato da un premio BBSRC-IPA con Unilever Plc (BB / L023040 / 1). HAG è finanziato da un ministero saudita dell'Istruzione Superiore PhD studentship.
Materials
| Brain heart infusion broth | Lab M | lab049 | rich general purpose media |
| agar-agar | Merck Milipore | 101614 | |
| petri dishes | Sarstedt | 82.1473.001 | |
| plastic perfume vaporizer | not known | – | 10 cm high with 3.5 cm diameter clear plastic spray bottle with lid, purchased from the travel section of a supermarket |
| Universal bottles | no longer in production, alternative SLS BOT5006 | 28 ml glass cylindrical bottle (approx 280 mm diameter, 850 mm height), flat bottomed with plastic screw cap | |
| Decon 90 | Decon | surface active cleaning agent |
Riferimenti
- Bolnick, D. I., et al. Why intraspecific trait variation matters in community ecology. Trends Ecol Evol. 26 (4), 183-192 (2011).
- Christensen, G. J. M., et al. Antagonism between Staphylococcus epidermidis and Propionibacterium acnes and its genomic basis. BMC Genomics. 17 (152), (2016).
- Faust, K., et al. Microbial co-occurrence relationships in the human microbiome. PloS Comput Biol. 8 (7), (2012).
- Frank, D. N., Feazel, L. M., Bessesen, M. T., Price, C. S., Janoff, E. N., Pace, N. R. The Human nasal microbiota and Staphylococcus aureus carriage. PLoS One. 5 (5), e10598 (2010).
- Fredheim, E. G., Flaegstad, T., Askarian, F., Klingenberg, C. Colonisation and interaction between S. epidermidis and S. aureus in the nose and throat of healthy adolescents. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 34, 123-129 (2015).
- Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle. Nat Rev Microbiol. 8, 15-25 (2010).
- Libberton, B., Coates, R. E., Brockhurst, M. A., Horsburgh, M. J. Evidence that intraspecific trait variation among nasal bacteria shapes the distribution of Staphylococcus aureus. Infect Immun. 82 (9), 3811-3815 (2014).
- Libberton, B., Horsburgh, M. J., Brockhurst, M. A. The effects of spatial structure, frequency dependence and resistance evolution on the dynamics of toxin-mediated microbial invasions. Evol appl. 8, 738-750 (2015).
- Liu, C. M., et al. Staphylococcus aureus and the ecology of the nasal microbiome. Sci Adv. 1, e1400216 (2015).
- Nascimento, J. S., Ceotto, H., Nascimento, S. B., Giambiagi-deMarval, M., Santos, K. R., Bastos, M. C. Bacteriocins are alternative agents for control of multiresistant staphylococcal strains. Lett Appl Microbiol. 42, 215-221 (2006).
- Park, B., Iwase, T., Liu, G. Y. Intranasal application of S. epidermidis prevents colonization by methicillin-resistant Staphylococcus aureus in mice. PLoS One. 6 (10), e25880 (2011).
- Uehara, Y., et al. Bacterial interference among nasal inhabitants: eradication of Staphylococcus aureus from nasal cavities by artificial implantation of Corynebacterium sp. J Hosp Infect. 44, 127-133 (2000).
- Wos-Oxley, M. L., et al. A poke into the diversity and associations within human anterior nare microbial communities. ISME J. 4, 839-851 (2010).
