Diseño y Uso de un bajo coste, Automatizado Morbidostat para Adaptive Evolución de las bacterias a los antibióticos En la selección de fármacos
Summary
We describe a low cost, configurable morbidostat that enables the characterization of antibiotic drug resistance by dynamically adjusting the drug concentration. The device can be integrated with a multiplexed microfluidic platform. The approach can be scaled up for laboratory antibiotic drug resistance studies.
Abstract
Describimos un bajo costo, morbidostat configurable para la caracterización de la vía evolutiva de resistencia a los antibióticos. El morbidostat es un dispositivo de cultivo bacteriano que monitorea continuamente el crecimiento bacteriano y ajusta dinámicamente la concentración de fármaco para desafiar constantemente las bacterias a medida que evolucionan para adquirir resistencia a los medicamentos. El dispositivo cuenta con un volumen de trabajo de ~ 10 ml y es totalmente automatizado y equipado con medición de la densidad óptica y micro-bombas para el medio y la administración de fármacos. Para validar la plataforma, que mide la adquisición gradual de la resistencia a trimetoprima en Escherichia coli MG 1655, e integró el dispositivo con una plataforma de microfluidos multiplexado para investigar la morfología celular y la sensibilidad a los antibióticos. El enfoque puede ser de hasta a escala en los estudios de laboratorio de resistencia a los antibióticos, y es extensible a la evolución adaptativa para las mejoras de deformación en la ingeniería metabólica y otros experimentos con cultivos bacterianos.
Introduction
Desde la introducción del primer fármaco antibiótico penicilina, la resistencia microbiana a los antibióticos se ha convertido en un problema de salud mundial 1. Aunque la adquisición de resistencia a los antibióticos puede ser estudiado retrospectivamente in vivo, las condiciones de estos experimentos a menudo no están controlados a lo largo de toda la evolución 2. Alternativamente, la evolución adaptativa de laboratorio puede revelar la evolución molecular de una especie microbiana menores de estrés ambiental o la presión de selección de un fármaco antibiótico 3. Recientemente, muchos experimentos evolutivos bien controlados de resistencia a los antibióticos han permitido comprender la aparición de resistencia a los antibióticos. Por ejemplo, el grupo de Austin demostró emergencia rápida en un entorno compartimentado microfluidos diseñado adecuadamente 4. El morbidostat recientemente desarrollado induce mutaciones sistemáticas bajo la presión de selección de drogas 5,6. El morbidostat, una selec microbianadispositivo de la que ajusta continuamente la concentración de antibiótico para mantener una población casi constante, es un avance importante en la prueba de fluctuación se utiliza en microbiología 7,8. En la prueba de fluctuación, un fármaco antibiótico se inyecta a alta concentración, y los mutantes supervivientes se tamizan y se contó. En cambio, los microbios en un morbidostat son constantemente desafiados y adquieren múltiples mutaciones.
El morbidostat opera de manera similar a la quimiostato, un dispositivo inventado por la cultura y Novick Szliard en 1950 que mantiene una población constante mediante el suministro continuo de nutrientes, mientras que la dilución de la población microbiana 9. Desde su introducción, el quimiostato se ha avanzado y mejorado. quimiostatos microfluidos actuales han alcanzado las capacidades de nanolitros y unicelulares. Sin embargo, estos dispositivos no son adecuados para los experimentos de evolución adaptativa, que requieren una población de células grandes con muchos eventos de mutación 10,11. Recientemente, mini-quimiostatos con volúmenes de trabajo de ~ 10 ml también se han desarrollado para rellenar el hueco entre los biorreactores de escala en litros y el microfluidos quimiostato 12,13.
Aquí se presenta el diseño y el uso de un bajo costo, morbidostat automatizado para un estudio de resistencia a los antibióticos. El módulo propuesto se puede emplear en un incubador agitador en un laboratorio de microbiología con el requisito mínimo de hardware. El firmware de código abierto también se adapta fácilmente a las aplicaciones específicas de la evolución de adaptación, como la ingeniería metabólica 3. Por último, el morbidostat está integrado en una plataforma de microfluidos multiplexado para las pruebas de sensibilidad a los antibióticos 14.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un dispositivo morbidostat bajo la huella de componentes de bajo coste se demuestra. Los aumentos en el nivel de resistencia a los medicamentos registrados por el dispositivo son coherentes con los informes anteriores de 5. Diseñado para los estudios evolutivos de la resistencia a los medicamentos, el dispositivo es potencialmente aplicable a muchos otros experimentos. En primer lugar, una amplia base de datos de mutaciones inducidas por fármacos se puede establecer para un gran conjunto de antibióticos cl…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Prof. Sze-Bi Hsu and Ms. Zhenzhen for useful discussions and help in the theoretical analysis and numerical simulation. Y. T. Y. would like to acknowledge funding support from the Ministry of Science and Technology under grant numbers MOST 103-2220-E-007-026 and MOST 104-2220-E-007-011, and from the National Tsing Hua University under grant numbers 103N2042E1, 104N2042E1, and 105N518CE1.
Materials
| Environmental Shaker Incubator | BioSan | ES-20 | |
| Arduino Leonardo board | Arduino | Leonardo | |
| 680 Ohm Carbon Resistor | Digikey | Bias resistor for LED | |
| 100k Ohm Carbon resistor | Digikey | Bias resistor for phototransistor | |
| 940 nm light emitting diode | Bright LED Electronic | BIR-BM13E4G-2 | Optical density measurement |
| 940 nm phototransistor | Kodenshi | ST-2L2B | Optical density measurement |
| Darlington pair IC Toshiba | Mouser | ULN2803APG | this IC drives micropumps and magnetic stirring unit |
| 5V DC brushless fan | ADDA | AD0405LX-G70 | spec: 5V supply voltage and 80mA available www.jameco.com |
| Piezoelectric micropump | CurieJet | PS15I-FT-5L | Pressure >3kPa Flow rate >5 ml/min |
| Tygon 3350 Tuning | Saint Gobain | ABW00001 | ID: 1/32" OD: 3/32" L:50' |
| Magnetic Stir bar | COWIE | tapered shape dim: 10 mm x 4mm | |
| Glass scintillation 20ml vial | DGS | Pyrex glass 28mm(dia.)x 61 mm(h) | |
| Culture vial holder | Custom made from Polyformaldehyde | ||
| Silicone | Dow Corning | Sylgald 184 | used to seal the glass vial |
| Medium bottle | VWR | 66022-065 | |
| Difco M9 minimal salt 5x | BD | Medium | |
| Cadamino Acid | BD | Medium | |
| glucose | Sigma | ||
| Agar Bateriological | Oxoid | for agar plate | |
| Luria Bertani medium | |||
| Inverted microscope | Leica Microsystems | Leica DMI-LED | used for microfluidic measurement Use X40 objective NA=0.55 |
| Microscope Incubator | Live Cell Instrument | CU-109 | used for microfluidic measurement |
| Solenoidal valves | Pneumadyne | S10MM-31-12-3 | Normally open 1.3 Watt 12 Vdc |
| USB interface card | Hobby Engineering | USBIO24-R Digital I/O Module | for microfluidics measurement |
| Air compressor | Rocker Scientific | ROCKER 440 | Pressure source for microfluidcs Max. Pressure 80 Psi |
| Male luer-lock fittings to 1/8" barb | ValuePlastics.com | MTLL230-1 | used for microfluidic control |
| 1/8" barb to 10-32 threaded port | ValuePlastics.com | B-1 | used for microfluidic control |
| Female luer-lock fittings to 10-32 threaded port | ValuePlastics.com | KFTL-1 | used for microfluidic control |
| NPN darlington transistor 500mA, 40V (2N6427) | DigiKey.com | 2N6427GOS-ND | used for microfluidic control |
| 10kOhm, carbon film resistor, 0.25W | DigiKey.com | P10KBACT-ND | used for microfluidic control |
| Tantalum capacitor, 10uF, 25V, 10% | DigiKey.com | 478-1841-ND | used for microfluidic control |
| Andor CCD camera | Andor | Zyla 4.2 Plus SCMOS | used for microfluidic on chip imaging |
| ELISA plate reader | |||
| two component Silicone | Momentive | RTV 615 | used for microfluidic chip fabrication |
| SU-8 photoresist | Micrchem | SU8 2015 | used for microfluidic chip fabrication |
| AZ4620 photoresist | Clariant | AZ 4620 | used for microfluidic chip fabrication |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC 32G | used for microfluidic chip fabrication |
| 20 Gauge Syringe Needle | BD | used for microfluidic chip fabrication | |
| Labcycler | Sensoquest | Labcycler | PCR |
| DNA polymerase | Toyobo | KDO Plus | PCR amplification |
| Trimethoprim | Sigma | ||
| Plate reader | Biotek | Synergy H1 hybrid | antibiotic resistane measurement |
Riferimenti
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