민감한 면역를 사용하여 시토신의 수정 된 형태의 검출
Summary
Herein we describe a sensitive immunochemical method for mapping the spatial distribution of 5mC oxidation derivatives based on the use of peroxidase-conjugated secondary antibodies and tyramide signal amplification.
Abstract
Methylation of cytosine bases (5-methylcytosine, 5mC) occurring in vertebrate genomes is usually associated with transcriptional silencing. 5-hydroxylmethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC), and 5-carboxylcytosine (5caC) are the recently discovered modified cytosine bases produced by enzymatic oxidation of 5mC, whose biological functions remain relatively obscure. A number of approaches ranging from biochemical to antibody based techniques have been employed to study the genomic distribution and global content of these modifications in various biological systems. Although some of these approaches can be useful for quantitative assessment of these modified forms of 5mC, most of these methods do not provide any spatial information regarding the distribution of these DNA modifications in different cell types, required for correct understanding of their functional roles. Here we present a highly sensitive method for immunochemical detection of the modified forms of cytosine. This method permits co-detection of these epigenetic marks with protein lineage markers and can be employed to study their nuclear localization, thus, contributing to deciphering their potential biological roles in different experimental contexts.
Introduction
DNA (5mC)에서 시토신 염기의 메틸화는 전사 1 침묵과 관련된 척추 동물의 게놈에서 발견되는 주요 후생 유전 학적 마크를 나타냅니다. 5mC 도입하고 DNA의 methyltransferases 2-5로 유지하고, 유전체 각인, X 염색체 불 활성화, 세포 분화 및 발달 3,6. 따라서, 중단 포함한 생물학적 과정의 숫자에 중요한 역할을하는 것으로 나타났다되고 5mC 게놈 패턴 질환 7, 8-11의 번호와 관련된다. 개발 및 질병에 5mC 역할을 이해하는데 진전에도 불구하고, 여전히이 마크가 개발 및 성인 조직에서 제거되는 방법을 크게 알려지지 않은 남아있다. DNA 탈 메틸화 여러 가능성 메커니즘은 최근 능동 및 수동 탈 메틸화기구 12, 13, 14, 15을 포함하여 제안되었다. 디스커버리 10-11 전위에 의해 매개 enzym 5mC 순차 산화 생성물ES (tet1 / 2 / 3)가 중간체로서 작용할 수 있는지 5 hydroxylmethylcytosine (5hmC) -5- formylcytosine (5fC) 및 DNA 16, 17, 18, 19 추측 자극 진핵 5- carboxylcytosine (5caC) 등 자신의 권리 (13)의 DNA 탈 메틸화 과정 또는 행위 안정적 후생 유전 학적 마크. 기본 절단 수리의 구성 요소, 티민-DNA 글리코 (TDG)가 결합하여 DNA 19 일부터 5fC과 5caC 모두 제거 할 수있는 데모, 20 활성 DNA 탈 메틸화에 수정 된 5mC 유도체의 역할을 제안하는 동안. 5fC / 5caC가 전사 조절 (29)에이 마크의 잠재적 인 참여에 RNA II의 processivity 점의 속도를 조절할 수 있음을 보여주는 최근의 증거. 인해 5mC의 산화 된 형태의 이러한 잠재적 인 생물학적 중요성 생화학 항체 기반 기술의 범위는 게놈 분포 글로벌 콘텐츠 (16), 19-24 연구에 이용되어왔다.
주어진 t의 대부분이그는 16-18, 20, 23, 25 내지 27은 서로 다른 조직에서 산화 5mC 유도체의 공간 분포를 결정하는 실험 중요해진다 장기 상이한 세포 유형으로 구성 수정 시토신 염기의 분포가 조직과 특정 세포 형인지 척추 생물학적 기능을 공개에 필요한 작업. 생화학 및 항체 기반 접근 방법의 대부분은 다른 조직과 세포 유형에 5mC의 수정 된 형태의 분포에 관한 공간 정보를 제공하지 않습니다. 대조적으로, 면역 화학 기반 기술 5mC (28) 및 산화 된 유도체 (20)의 공간적 분포와 핵 이행을 평가하는 신속한 수단을 제공 할 수있다. 즉 마우스 게놈 18 (매 10 6 시토신 3)보고 매우 낮은 5fC의 풍요 로움 (20 매 10 6 시토신에) 및 5caC 표준 면역 화학에 대한 큰 도전을 나타냅니다 말한다.
이리,우리는 강력한 제공하는 매우 민감한 면역 화학적 방법 및 포유 동물의 뇌 조직에서 시토신의 산화 된 형태의 신속 검출을 설명합니다. 신호 증폭 단계에 결합 된 퍼 옥시 다제 접합 이차 항체를 포함하여, 이러한 방법은 5fC 및 5caC의 매우 소량을 검출 문제를 회피. 또한,이 기술은 이러한 효과 후생 유전 학적 마크의 생물학적 기능을 밝히는데 다른 방법을 보완 리니지 마커 특정 사이토 공동 검출 변형 형태에 사용될 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
일부 조직에서 5mC 산화 유도체, 5fC 및 5caC의보고 낮은 풍부 표준 면역 화학 프로토콜에 대한 상당한 제한을 제시 것이지만, 퍼 옥시 다제 접합 된 이차 항체의 결합은 고정 된 조직과 세포에서 이러한 시토신 수정의 검출을 허용한다 (그림 2) . 그러나 tyramide 용액 최적의 배양 시간은 신호 강도 및 tyramide 기반 신호 증폭 기간 사이에 선형 관계가 내용은 관측 tyramide 신호 증폭 키트의 각각의 배치에 대해 실험적으로 최적화되어야 알메이다 등 참조. 2012 26 . 또한, 신호 / 배경 비는 크게 초과하는 항체를 효율적으로 제거 할 수 있도록하는 코 플린 항아리에서 세척을 수행함으로써 향상 될 수있다. tyramide 용액 인큐베이션 후, 즉시 내지 D PBT 용액에 세척하여 반응을 중단하는 것이 중요ecrease 배경 염색. 이 섹션의 절차를 수행하는 동안 어느 시점에서 건조하는 것을 허용하지 않는 것이 중요합니다.
DNA의 본 antibody의 효율은 37 ° C에서 본 antibody 반응을 수행함으로써 개선 될 수있다. 이 이중 가닥 DNA와 독점적으로 상호 작용으로 4 N 염산을 사용하는 대신이 있지만 N은 DAPI와 협력 염색을 허용하지 DNA의 antibody에서는 4 N 염산을 사용하여 5mC의 변형 된 형태의 염색을 향상시킨다.
이 기술은 시토신 염기 위치를 검출의 변형 형태의 강력한 반 정량적 평가를 제공 할 수 있지만, 5mC 또는 산화 유도체의 절대 레벨을 평가하기 위해 사용될 수 없다. 따라서, 우리는 다른 보완의 사용을 권장하지만 양적는 16, 19 -24 접근한다. 포유 동물 게놈에서 5mC 산화 유도체의 발견 이래, 여러 접근법은 생물학적 역할 16, 19-24을 연구하기 위해 개발되었다. 이 approa 있지만CHES가 5mC 산화 유도체의 절대 수준을 결정하는데 유용 할 수 있고, 이들은 공간적 분포 (20), (26)에 관한 정보를 제공하지 않는다. 우리는 성공적으로 상이한 세포 유형에서 5mC 산화 유도체의 공간적 분포 및 위치 파악을 매핑하기 위해 여기에 기술 된 방법을 사용한 현상과 성인 뇌 (20)
자신의 공간 분포 (20)를 공개함으로써,이 기술은 생물학적 의미와 5mC 이러한 수정 유도체는 세포 분화, 개발 및 질병을 포함하여 검출 할 수있는 다양한 생물 상황에서 5mC의 산화 파생 상품의 운명을 이해하는 데 중요 할 수 있습니다. 또, 여기서 설명하는 방법 tyrami 서로 다른 배양 시간 (염색 강도에 비례) 퍼 옥시 다제 반응의 동역학을 평가함으로써 다른 조직에서 5mC의 산화 유도체 반 정량적 평가를 제공 할 수 있습니다드 26.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Advanced Microscopy Unit (School of Life Sciences, University of Nottingham) and the Histology team of MRC Human Reproductive Sciences Unit (Edinburgh), the Institute of Neuroscience at the ULB and the FNRS for help and support. This work was supported by MRC (MR/L001047/1 to A.D.J.).
Materials
| Coplin jar | Cole-Parmer | UY-48585-30 | Glass made |
| Xylene | Use only in Class II safety cabinet | ||
| Phosphate buffer saline (PBS) | Fisher Scientific | 12821680 | pPH 7.5, filtered before use |
| 4% paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | P6148 | Once made can be stored at -20°C in aliquotes for several months |
| 4% formaldehyde (FA) | Sigma Aldrich | F8775 | Once made can be stored at -20°C in aliquotes for several months |
| Ethanol, anhydrous denatured, histological grade | Sigma Aldrich | 64-17-5 | 95, 75, 50 % in PBS |
| 0.01 % Tween 20 in PBS | Sigma Aldrich | P9416 | PBT |
| 0.5% Triton X-100 in PBS | Sigma Aldrich | X100 | PBX |
| 2 N HCl | Sigma Aldrich | 71826 | caution extremely toxic |
| 100 mM Tris-HCl | Promega | H5121 | PH adjusted to 8.5 |
| hydrophobic barrier pen | Abcam | ab2601 | for immunohistochemistry |
| Slide moisture chamber | Scientific Device Laboratory | 197-BL | |
| anti-5mC mouse antibody | Diagenode | C15200081 | monoclonal primary antibody |
| Anti-5hmC antibody | Active Motif | 39791 | rabbit polyclonal primary antibody |
| Anti-5caC antibody | Active Motif | 61225 | rabbit polyclonal primary antibody |
| Peroxidase-conjugated anti-rabbit seconday antibody | Dako | K1497 | |
| 555-congjuated goat anti-mouse antibody | Molecular probes | A-11005 | secondary antibody |
| 10% BSA | Sigma Aldrich | A9418 | Blocking solution |
| 22x32mm Glass cover slips | BDH | 406/0188/24 | |
| Tyramide Signal Amplification System | Perkin Elmer | NEL741001KT | Other fluorochome conjugated seconday antibodies can be used for co-detection of oxi-5mC |
| Mounting Medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| Colourless nail polish | |||
| chicken polyclonal anti-GFAP polyclonal antibody | Thermo Scientific | PA5-18598 | 1:400 dilution |
| anti-NeuN mouse monoclonal antibody | Merck milipore | MAB377B | 1:400 dilution |
Riferimenti
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