Der Nachweis von modifizierte Formen von Cytosin Mit Sensitive Immunhistochemie
Summary
Herein we describe a sensitive immunochemical method for mapping the spatial distribution of 5mC oxidation derivatives based on the use of peroxidase-conjugated secondary antibodies and tyramide signal amplification.
Abstract
Methylation of cytosine bases (5-methylcytosine, 5mC) occurring in vertebrate genomes is usually associated with transcriptional silencing. 5-hydroxylmethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC), and 5-carboxylcytosine (5caC) are the recently discovered modified cytosine bases produced by enzymatic oxidation of 5mC, whose biological functions remain relatively obscure. A number of approaches ranging from biochemical to antibody based techniques have been employed to study the genomic distribution and global content of these modifications in various biological systems. Although some of these approaches can be useful for quantitative assessment of these modified forms of 5mC, most of these methods do not provide any spatial information regarding the distribution of these DNA modifications in different cell types, required for correct understanding of their functional roles. Here we present a highly sensitive method for immunochemical detection of the modified forms of cytosine. This method permits co-detection of these epigenetic marks with protein lineage markers and can be employed to study their nuclear localization, thus, contributing to deciphering their potential biological roles in different experimental contexts.
Introduction
Die Methylierung von Cytosin – Basen in der DNA (5mC) stellt einen großen in Wirbeltiere Genome gefunden epigenetische Markierung im Zusammenhang mit Transkriptions 1 zum Schweigen zu bringen. 5mC wird von DNA – Methyltransferasen 2-5 eingeführt und gehalten, und wurde in einer Reihe von biologischen Prozessen einschließlich genomische Imprinting, X-Chromosom Inaktivierung zellulärer Differenzierung und Entwicklung 3, 6. Folglich wichtige Rollen spielen gezeigt, die Störung der 5mC genomische Muster mit einer Reihe von Krankheiten assoziiert 7, 8-11. Trotz der Fortschritte im Verständnis 5mC Rolle bei der Entwicklung und Krankheit, ist es immer noch weitgehend unbekannt bleiben, wie diese Marke bei der Entwicklung und adulten Geweben entfernt wird. Mehrere mögliche Mechanismen der DNA – Demethylierung aktiven und passiven Demethylierung Mechanismen vor kurzem vorgeschlagen wurden , 12, 13, 14, 15. Entdeckung der Produkte von 5mC sequenzielle Oxidation vermittelt durch 10 bis 11 Translokation enzymES (TET1 / 2/3), wie 5-hydroxylmethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5FC) und 5-carboxylcytosine (5caC) in eukaryotischen DNA 16, 17, 18, 19 veranlasst Spekulationen , ob sie als Zwischenprodukte dienen können , DNA – Demethylierung Prozesse oder als stabile epigenetische Markierungen in ihrem eigenen Recht 13. Während der Demonstration , dass die Komponente der Reparatur Basis Exzision, Thymin-DNA – Glycosylase (TDG) binden können und beide 5FC und 5caC von DNA 19 zu entfernen, schlägt vor , 20 eine Rolle für die modifizierten 5mC Derivate in einer aktiven DNA – Demethylierung. Neuere Erkenntnisse zeigen , dass 5FC / 5caC die Rate der RNA II processivity Punkte auf mögliche Beteiligung dieser Marken in der Transkriptionsregulation 29 modulieren können. Aufgrund dieses potentielle biologische Bedeutung von oxidierten Formen von 5mC, eine Reihe von biochemischen und Antikörper – basierte Techniken zur Untersuchung ihrer genomischen Verteilung und globale Inhalte wurden 19-24 16, eingesetzt.
Da die meisten ter wirbel Organen verschiedener Zelltypen bestehen und daß die Verteilung der modifizierten Cytosin – Basen Gewebe- und Zelltyp – spezifische 16-18, 20, 23, 25-27, in verschiedenen Geweben , die räumliche Verteilung von oxidiertem 5mC Derivate Bestimmung wird zu einem wichtigen experimentellen Aufgabe erforderlich für ihre biologischen Funktionen enthüllt. Die meisten der biochemischen und Antikörper-basierte Ansätze bieten keine räumlichen Informationen bezüglich der Verteilung der modifizierten Formen von 5mC in verschiedenen Geweben und Zelltypen. Im Gegensatz dazu Immunochemie basierte Techniken kann die räumliche Verteilung und Kernlokalisation von 5mC 28 und dessen oxidierter Derivate 20 ein schnelles Werkzeug für die Beurteilung. Das heißt, der berichtete sehr geringe Häufigkeit von 5FC (20 in jedem 10 6 Cytosin) und 5caC (3 in je 10 6 Cytosin) in das Mausgenom 18 eine große Herausforderung für Standard Immunochemie darstellt.
Hier,Wir beschreiben eine hochempfindliche immunochemischen Methode, die von oxidierten Form von Cytosin in Säugetierhirngewebe robust und eine schnelle Erkennung bietet. Durch die Integration von Peroxidase-konjugierten sekundären mit einem Signalverstärkungsschritt gekoppelten Antikörpern, umgeht diese Methode für die Herausforderungen der sehr geringe Mengen an 5FC und 5caC zu erkennen. zusammen detektieren die modifizierten Formen von Cytosin mit linienspezifischen Markern, effektiv ergänzt andere Ansätze bei der Aufklärung der biologischen Funktion dieser epigenetische Markierungen Zusätzlich kann diese Technik verwendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Obwohl der gemeldete geringe Häufigkeit von 5mC Oxidationsderivate, 5FC und 5caC in einigen Geweben erhebliche Einschränkungen für ein Standard – Immunochemie Protokoll darstellen würde der Einbau von Peroxidase-konjugiertem Sekundärantikörper erlaubt den Nachweis dieser Cytosin Modifikationen in festen Geweben und Zellen (Figur 2) . Jedoch sollte die optimale Inkubationszeit mit dem Tyramid Lösung optimiert werden experimentell für jede einzelne Charge von Tyramid Signalverstärkungs Kit , wo eine lineare Beziehung zwischen der Signalintensität und die Dauer der Tyramid basierten Signalverstärkung beobachtet wird, für Details siehe Almeida et al. 2012 26 . Zusätzlich kann das Signal / Hintergrund-Verhältnis signifikant durch die Durchführung der Waschungen in einem Coplin jar verbessert werden effiziente Entfernung von überschüssigem Antikörper zu ermöglichen. Nach der Inkubation mit Tyramidesters Lösung ist es wichtig, die Reaktion durch Waschen in PBT-Lösung d sofort zu beendenecrease Hintergrundfärbung. Es ist wichtig, nicht die Abschnitte zu erlauben, an jedem beliebigen Punkt während des Verfahrens, um zu trocknen.
Die Effizienz der DNA Depurinierung kann durch Ausführen der Depurinierung Reaktion bei 37 ° C verbessert werden. Bei der Verwendung von 4 N HCl anstelle von 2 N verstärkt die Färbung der modifizierten Formen von 5mC unter Verwendung von 4 N HCl für DNA Depurinierung würde mit DAPI nicht zulassen Co-Färbung, wie sie ausschließlich mit doppelsträngiger DNA interagiert.
Obwohl diese Technik robust semi-quantitative Beurteilung der modifizierten Formen von Cytosin-Basen in dem detektierbaren bereitstellen kann, kann sie nicht für die Bewertung der absoluten Niveaus der 5mC oder dessen Oxidationsderivaten verwendet werden. Daher empfehlen wir die Verwendung von anderen ergänzenden , aber quantitative Ansätze 16, 19 -24. Seit der Entdeckung von 5mC Oxidationsderivate in Säugergenomen wurden mehrere Ansätze entwickelt worden , deren biologische Rollen zu studieren 16, 19-24. Obwohl diese approaCHES kann bei der Bestimmung der absoluten Mengen an 5mC Oxidationsderivate wertvoll sein, bieten sie keine Informationen über ihre räumliche Verteilung 20, 26. Wir haben erfolgreich die hier beschriebenen Verfahren verwendet , um die räumliche Verteilung und Lokalisierung von 5mC Oxidationsderivate in verschiedenen Zelltypen zu kartieren der entwickelnden und adulten Gehirn 20
Durch die Offenbarung ihrer räumlichen Verteilung 20 kann diese Technik entscheidend sein , um die biologischen Implikationen für das Verständnis und das Schicksal von oxidierten Derivaten 5mC in verschiedenen biologischen Kontexten , in denen diese modifizierten Derivaten von 5mC können einschließlich zelluläre Differenzierung, Entwicklung und Krankheit nachgewiesen werden. Darüber hinaus kann die Methode, die wir hier beschreiben, geben semi-quantitative Abschätzungen der oxidierten Derivaten 5mC in verschiedenen Geweben durch die Kinetik der Peroxidase-Reaktion Beurteilung (die der Färbungsintensität proportional ist) bei unterschiedlichen Inkubationszeiten mit tyramide 26.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Advanced Microscopy Unit (School of Life Sciences, University of Nottingham) and the Histology team of MRC Human Reproductive Sciences Unit (Edinburgh), the Institute of Neuroscience at the ULB and the FNRS for help and support. This work was supported by MRC (MR/L001047/1 to A.D.J.).
Materials
| Coplin jar | Cole-Parmer | UY-48585-30 | Glass made |
| Xylene | Use only in Class II safety cabinet | ||
| Phosphate buffer saline (PBS) | Fisher Scientific | 12821680 | pPH 7.5, filtered before use |
| 4% paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | P6148 | Once made can be stored at -20°C in aliquotes for several months |
| 4% formaldehyde (FA) | Sigma Aldrich | F8775 | Once made can be stored at -20°C in aliquotes for several months |
| Ethanol, anhydrous denatured, histological grade | Sigma Aldrich | 64-17-5 | 95, 75, 50 % in PBS |
| 0.01 % Tween 20 in PBS | Sigma Aldrich | P9416 | PBT |
| 0.5% Triton X-100 in PBS | Sigma Aldrich | X100 | PBX |
| 2 N HCl | Sigma Aldrich | 71826 | caution extremely toxic |
| 100 mM Tris-HCl | Promega | H5121 | PH adjusted to 8.5 |
| hydrophobic barrier pen | Abcam | ab2601 | for immunohistochemistry |
| Slide moisture chamber | Scientific Device Laboratory | 197-BL | |
| anti-5mC mouse antibody | Diagenode | C15200081 | monoclonal primary antibody |
| Anti-5hmC antibody | Active Motif | 39791 | rabbit polyclonal primary antibody |
| Anti-5caC antibody | Active Motif | 61225 | rabbit polyclonal primary antibody |
| Peroxidase-conjugated anti-rabbit seconday antibody | Dako | K1497 | |
| 555-congjuated goat anti-mouse antibody | Molecular probes | A-11005 | secondary antibody |
| 10% BSA | Sigma Aldrich | A9418 | Blocking solution |
| 22x32mm Glass cover slips | BDH | 406/0188/24 | |
| Tyramide Signal Amplification System | Perkin Elmer | NEL741001KT | Other fluorochome conjugated seconday antibodies can be used for co-detection of oxi-5mC |
| Mounting Medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| Colourless nail polish | |||
| chicken polyclonal anti-GFAP polyclonal antibody | Thermo Scientific | PA5-18598 | 1:400 dilution |
| anti-NeuN mouse monoclonal antibody | Merck milipore | MAB377B | 1:400 dilution |
Riferimenti
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