Implementación de un Sistema de infección basada en la inserción de membrana permeable para estudiar los efectos de toxinas secretadas bacterianas en células huésped de mamífero

1. bacteriana Cultura Generar cepas mutantes isogénicas que se utilizará para el estudio del factor secretado específica de interés 21. Nota: Los GASM1T1 5448 cepas utilizadas para estos experimentos incluidos WT GAS ', un gato Saga Δ SLS-mutante deficiente (abreviada en el texto como Δ SAGA), y una cepa complementada Saga (abreviado en el texto como Δ + Saga Saga) 21. Preparar cultivos líquidos durante la noche de cepas bacterianas de interés. Crecer GAS M1T1 5448 cepas en -10 ml de caldo de Todd-Hewitt a 37 ° C durante 16 a 20 h antes de infectar las células humanas. Centrifugar cultivos de una noche bacterianas (2.400 rcf durante 10 min) y se resuspenden en medio bacteriano fresco. Nota: la resuspensión en el mismo volumen que los cultivos de una noche se hicieron crecer en (5-10 ml) en general produce una densidad óptica inicial deseable. Normalizar los cultivos bacterianos aconcentraciones de partida iguales por la dilución de los cultivos se resuspendieron en medio bacteriano adicional hasta que la misma densidad óptica a 600 nm (OD 600) se obtiene para todas las cepas a ensayar (OD 600 de aproximadamente 1,0 se recomienda por conveniencia). Nota: En estos estudios, se utilizaron cultivos de bacterias de fase estacionaria para infectar células huésped inmediatamente después de la normalización. Sin embargo, ya que algunas cepas de bacterias en fase estacionaria salida nonsynchronously que puede ser más apropiado para iniciar infecciones huésped con cultivos en fase de registro si este se encuentra que es el caso para las cepas de interés. Antes de análisis, realizar un recuento de colonias de ensayo para determinar las unidades formadoras de colonias (UFC) por mililitro presente en los cultivos de partida de modo que la multiplicidad de infección (MOI), o la relación de bacterias por célula huésped, se puede determinar. Preparar 1 ml de diluciones seriadas de cultivos bacterianos que se han normalizado a la óptica deseada DENSIty en solución salina tamponada con fosfato (PBS) o medio de crecimiento bacteriano adecuado (caldo de Todd-Hewitt se utilizó en estos estudios). Preparar diluciones que van desde 10 -1 a 10 -6 para producir al menos un conjunto de placas de agar con colonias contables (30-300 colonias). Realizar todas las diluciones por triplicado. Transferir 100 l de cada dilución en serie en una placa de agar que contenía medio apropiado para la especie bacteriana que se está analizando. Nota: se utilizó agar Todd-Hewitt en estos estudios. Use un vaso o esparcidor bacteriana plástico para distribuir uniformemente la alícuota de 100 l en toda la superficie de la placa de agar, y continuar la propagación hasta que el líquido ha sido absorbido en el agar. Llevar a cabo bajo la llama utilizando una técnica estéril. Se incuban las placas de agar a 37 ° C durante la noche o hasta que las colonias contables aparecen. Contar las colonias que crecen en cada plato y el cálculo de las UFC / ml en la cultura original por el siguiente formula: número de colonias x inversa del volumen de dilución / cultura en serie chapado en mililitros. por ejemplo (200 x 1/10 colonias -5 dilución) / 0,1 ml chapados = 2,0 x 10 8 UFC / ml 2. anfitrión de Cultivos Celulares Obtener una línea de célula huésped apropiada para los análisis deseados. Nota: HaCaT queratinocitos epiteliales humanos 29, una especie de regalo de V. Nizet, fueron utilizados para estos estudios. Mantener las células HaCaT en placas de 100 mm de cultivo en Dulbecco medio de Eagle modificado (DMEM) con suero bovino fetal inactivado por calor al 10% (FBS). Incubar a 37 ° C con 5% de CO 2. La infección de la célula anfitrión 3. La permeabilidad de la membrana Sistema Insertar células de la placa en placas de cultivo de tejidos apropiados y les permiten crecer hasta que alcanzan el 90% de confluencia. Nota: Las células HaCaT utilizados en estos estudios típicamente alcanzar la confluencia en 2-3 days después de la siembra. Para la recolección de lisado (por ejemplo, el análisis y ensayos de determinación de trifosfato de adenosina (ATP) de señalización), la placa de células HaCaT en placas de 6 pocillos a una densidad de siembra de aproximadamente 3 x 10 5 células / pocillo. Para los experimentos de formación de imágenes de inmunofluorescencia, las células de la placa en cubreobjetos de vidrio estériles dentro de placas de 6 pocillos a una densidad de siembra de aproximadamente 3 x 10 5 células / pocillo. Para etidio homodímero permeabilización de la membrana y ensayos de liberación de lactato deshidrogenasa (LDH), la placa de células HaCaT en placas de 24 pocillos a una densidad de siembra de aproximadamente 5 x 10 4 células / pocillo. Inmediatamente antes del tratamiento, lavar las células con 1 x PBS estéril. Aplicar medio de crecimiento fresco a las células. Para las condiciones descritas aquí, aplicar 2 ml de medio por pocillo de placas de 6 pocillos o 0,5 ml de medio por pocillo de placas de 24 pocillos. Si los tratamientos farmacológicos se están probando, mezclar con medio fresco y se aplicará durante este stepag. Nota: Algunos ensayos pueden requerir medios de comunicación alternativos. Por ejemplo, como fenol concentraciones séricas de color rojo y de alta interfieren con el ensayo de liberación de LDH, libre de rojo fenol DMEM suplementado con 1% de albúmina de suero bovino (BSA) (w / v), 2 mM L-glutamina y piruvato de sodio 1 mM era utilizado para estos experimentos. Después de medio fresco se ha aplicado, se coloca cuidadosamente un inserto de membrana permeable a 0,4 micras estéril en cada pocillo. Realice este paso en una campana de flujo laminar, y el uso de pinzas estériles para transferir la pieza de inserción de la membrana permeable en cada pocillo. Aplicar medio de cultivo celular fresco a la cámara superior de cada pocillo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para las condiciones descritas aquí, aplicar 1 ml de medio por pocillo durante placas de 6 pocillos o 0,1 ml de medio por pocillo durante placas de 24 pocillos. Aplicar un volumen apropiado de cultivos bacterianos normalizados (véase el apartado 1) a la cámara superior del sistema de inserción de membrana permeable. Utilice medio bacteriano para contr no infectadatratamientos ol. Para los resultados aquí descritos, se añaden 25 l de las culturas normalizados por cámara de placas de 24 pocillos y añadir 100 l de las culturas por cámara de placas de 6 pocillos. Nota: En estos estudios, se aplicaron de tipo salvaje o mutante GAS a las células huésped a una MOI de 10. MOI se calculó basándose en el número de células eucariota finales (por ejemplo, 2 x 10 6 células / pocillo), de tal manera que 10 veces la cantidad de bacterias fueron añadidos por la célula huésped en el comienzo del período de infección (por ejemplo, 2 x 10 7 CFU por pocillo). MOI apropiada variará con diferentes especies bacterianas y con los análisis de seguimiento deseadas. Nota: Además de utilizar medio bacteriano para los controles no infectados, otros controles útiles para ciertas aplicaciones de esta técnica pueden incluir bacterias muertas por calor o medio bacteriano gastado para la comparación. Se incuban las células infectadas a 37 ° C con 5% de CO 2. Colección 4. Muestra <ol> Para recoger el medio de cultivo de células, lisados ​​de células huésped, o cubreobjetos de vidrio con células intactas para el seguimiento de los análisis, empezar por eliminar cuidadosamente el inserto de membrana permeable con pinzas estériles. Para la evaluación de Protiens anfitrión secretadas: Recoger el medio de la cámara inferior en tubos de 1,5 ml. Evitar perturbar la monocapa durante la recogida. Centrifugar las muestras a 14.000 rcf durante 10 min a 4 ° C para eliminar los restos celulares. Retire todos menos 50 l del sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 ml y se almacena a -20 ° C o usar inmediatamente. Para la evaluación de Host Cell lisados: aspirar suavemente el medio por encima de la monocapa de células huésped. No perturbar la monocapa, ya que esto puede resultar en la pérdida de muestra. Enjuagar las células una vez con PBS 1x. aspirar suavemente PBS. Inmediatamente aplicar un volumen apropiado de tampón de lisis enfriado en hielo para conseguir la concentración deseada de proteínas, e incubar lamuestras en hielo durante 15 min. Aplicar entre 200 l y 350 l de tampón de lisis por pocillo de cada placa de 6 pocillos para conseguir concentraciones de proteína entre 0,5 y 1,5 mg / ml. Nota: El tampón de lisis usado en estos estudios se compone de agua desionizada, 1% (v / v) Sustituto de Nonidet P40, un cóctel inhibidor de fosfatasa, y un cóctel inhibidor de la proteasa. reactivos específicos se enumeran en la sección de Materiales y Equipos. Use un raspador celular para desprender las células de la superficie de la placa de cada pocillo y la pipeta todo el contenido de cada pocillo a un tubo de 1,5 ml. Centrifugar las muestras a 14.000 rcf durante 20 min a 4 ° C. Para evaluar los componentes solubles de lisado, eliminar el sobrenadante a un tubo nuevo y se almacena a -20 ° C o usar inmediatamente. Para evaluar los componentes insolubles del lisado nucleares o de otro tipo, reservar el sedimento y se almacena a -20 ° C o usar inmediatamente. Para su evaluación por inmunofluorescencia de imagen: Comopirata medio y lavar las células en 1x PBS frío. Fijar las células durante la noche en% de paraformaldehído (PFA) solución de 4 en PBS (w / v). Nota: En estos estudios, se añadió 1 ml de PFA por pocillo de cada placa de 6 pocillos. 5. Aplicaciones sugeridas Anfitrión Análisis de Señales de Transducción por SDS-PAGE y transferencia de Western Recoger lisados ​​de células huésped como se describe en la sección 4.3. Determinar la concentración de proteínas de cada lisado de la muestra por el ácido bicinconínico de ensayo (BCA) o equivalentes utilizando estándares de proteína de 30. Normalizar las concentraciones de proteína entre las muestras antes de cargar y ejecutar las muestras en un gel de poliacrilamida al 4-15% o apropiado alternativa 31. Normalizar concentraciones de la muestra con la pipeta la misma cantidad de proteínas de cada muestra (por ejemplo, 20 g) en un nuevo tubo de 1,5 ml y la adición de volúmenes variables de tampón de lisis (volumen de tampón = volumen total – volumen de la muestraañadido) a cada tubo para llevar el volumen total (por ejemplo 50 l) y equivalente concentración final de proteína a través de muestras. Transferir las muestras a un fluoruro de polivinilideno (PVDF) (o equivalente). Para los resultados descritos aquí, transferir muestras a 25 voltios durante 2 horas antes de aumentar la tensión a 70 voltios durante 45 minutos adicionales. Utilizar tampón de transferencia compuesto por Tris base 200 mM, 1,5 M de glicina y 20% de metanol (v / v) en agua desionizada. membranas bloque en 5% de BSA + 0,1% de Tween 20 en solución salina amortiguadora Tris (TBS). Ajustar en consecuencia sobre la base de las recomendaciones del fabricante para el anticuerpo a utilizar. Se incuban las membranas con anticuerpos primarios durante la noche a 4 ° C. Uso en el fabricante recomienda la dilución. Lavar las membranas durante 1,5 horas en TBS + 0,1% Tween 20; refrescar amortiguar cada 10-15 minutos. Incubar con peroxidasa de rábano (HRP) conjugado con anticuerpo secundario a una dilución de 1: 5000 para 1,5 horas a temperat habitaciónUre. Lavar las membranas durante 1,5 horas en TBS + 0,1% Tween 20; refrescar el tampón cada 10 – 15 min. Incubar membranas con reactivo de detección de quimioluminiscencia antes de desarrollar en la película de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Otros métodos de detección se pueden usar como se desee. Host Cell La tinción de inmunofluorescencia e Imagen Fijar cubreobjetos que contienen células huésped como se describe en la sección 4.4. Retire la solución de PFA y lavar cubreobjetos que contienen células tratadas dos veces en PBS, aspirando entre lavados. Nota: PFA es altamente tóxico y debe ser desechado de manera apropiada. Bloquear los cubreobjetos durante 2 horas a temperatura ambiente en PBS con 1% (w / v) de suero normal de cabra, 2% (v / v) de Triton X-100, y 0,5% (v / v) de Tween 20. Lavar los cubreobjetos con PBS durante 30 minutos, la actualización de la memoria intermedia cada 10 minutos. Incubar los cubreobjetos con anticuerpo primario en una proporción 1:50 (o según lo recomendado por el fabricante) en el bloqueo de sollución durante la noche a 4 ° C. Lavar los cubreobjetos durante 1,5 horas en PBS, refrescante el tampón cada 30 minutos. Incubar los cubreobjetos durante 2 horas a temperatura ambiente en anticuerpo secundario (de cabra anti-IgG de conejo AlexaFluor488 se utilizó para estos estudios) utilizando una proporción de 1: 200 de anticuerpo para la solución de bloqueo. Lave cubreobjetos durante 1 hora, la actualización de la memoria intermedia cada 20 minutos. Aplicar las manchas deseadas. Nota: Estos estudios utilizaron DAPI (tinción nuclear) y rodamina-faloidina (actina mancha) en proporciones de 1: 1000 en solución de bloqueo. Incubar cubreobjetos con manchas nucleares y de actina durante 30 min a temperatura ambiente. Lavar los cubreobjetos en PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente, la actualización de la memoria tampón cada 10 minutos. Montar el cubreobjetos sobre portaobjetos de vidrio usando medio de montaje. Permitir a los cubreobjetos para establecer en las diapositivas durante la noche antes de sellar y de imagen. Para los resultados descritos aquí, recoger imágenes en un microscopio de fluorescencia USIng de un objetivo 20X estándar. Utilice el software ImageJ y las imágenes del microscopio para procesar las imágenes capturadas. Ensayo de Muerte Celular homodímero de etidio Aspirar medio de cada pocillo y se lavan las células dos veces con PBS estéril. Aplicar 4 M de etidio homodímero-1 en PBS. Se incuban las células a temperatura ambiente durante 30 min en la oscuridad. Determinar el nivel de fluorescencia usando un lector de placas ajustado a 528 nm de excitación y 617 nm de emisión con un valor de corte de 590 nm. Añadir 0,1% (w / v) de saponina a cada pocillo después de la lectura inicial y permitir que la placa de incubar durante 20 min adicionales a temperatura ambiente (con balanceo) antes de leer la placa una segunda vez en la misma configuración. Determinar el porcentaje de permeabilización de la membrana de forma individual para cada pocillo al dividir la fluorescencia inicial de lectura (post-tratamiento) por la segunda lectura de fluorescencia (post-saponina). Ensayo de determinación de ATP <li> Recoger lisados ​​como se describe en el apartado 4.3 anterior. Normalizar los niveles de proteína en los lisados ​​mediante ensayo BCA 30 o similar. Determinar los niveles celulares de ATP usando un kit de determinación de ATP basados ​​en la luminiscencia o equivalente de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Normalizar los valores tratados a las correspondientes muestras de control no infectadas. Ensayo de liberación de LDH Después de la infección, recoger los sobrenadantes como se describe en la sección 4.3. Evaluar la liberación de LDH utilizando un kit de detección de citotoxicidad de la liberación de LDH de acuerdo con las instrucciones del fabricante.