JoVE Journal > Immunology and Infection
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Introduction
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Materials
Riferimenti
Immunologia e infezioni

Implementação de um Sistema de Infecção baseado em Inserir Permeável Membrana para estudar os efeitos de secretada bacterianas toxinas em células hospedeiras de mamíferos

Published: August 19, 2016
doi:
10.3791/54406
,
1Department of Biological Sciences, Eck Institute for Global Health,University of Notre Dame

Summary

Aqui, é descrito um método que utiliza um sistema de infecção baseada inserção membrana permeável para estudar os efeitos de estreptolisina S, uma toxina segregada produzida por Streptococcus do grupo A, em queratinócitos. Este sistema pode ser facilmente aplicado ao estudo de outras proteínas bacterianas segregadas em diferentes tipos de células hospedeiras durante a infecção.

Abstract

Muitos agentes patogénicos bacterianos segregar toxinas potentes para ajudar na destruição de tecidos do hospedeiro, para iniciar mudanças de sinalização em células hospedeiras ou para manipular as respostas do sistema imunitário durante o curso da infecção. Embora métodos têm sido desenvolvidas para purificar com sucesso e produzem muitos destes factores de virulência importantes, ainda existem muitas toxinas bacterianas cuja estrutura única ou extensas modificações pós-translacionais torná-los difíceis de purificar e estudar em sistemas in vitro. Além disso, mesmo quando a toxina pura pode ser obtida, existem muitos problemas associados com o estudo dos efeitos específicos de uma toxina, sob condições fisiológicas relevantes. Mais em modelos de cultura celular in vitro, concebidos para avaliar os efeitos de toxinas bacterianas secretadas em células hospedeiras envolvem a incubação de células hospedeiras com uma dose única de toxina. Tais métodos mal aproximar o que células hospedeiras realmente experiência durante uma infecção, onde a toxina é continuamente produzida porcélulas bacterianas e deixada a acumular-se gradualmente durante o curso da infecção. Este protocolo descreve a concepção de um sistema de infecção bacteriana baseada em inserto membrana permeável para estudar os efeitos de estreptolisina S, uma toxina potente produzido por Streptococcus do grupo A, nos queratinócitos epiteliais humanos. Este sistema imita mais de perto o ambiente fisiológico natural durante uma infecção do que os métodos onde a toxina pura ou sobrenadantes bacterianos são aplicados directamente às células hospedeiras. É importante ressaltar que este método também elimina o viés da resposta do hospedeiro que são devido ao contacto entre as bactérias e células hospedeiras dirigir. Este sistema foi utilizado para avaliar eficazmente os efeitos de estreptolisina S (SLS) na integridade da membrana de acolhimento, a viabilidade celular, e as respostas de sinalização celular. Esta técnica pode ser facilmente aplicada ao estudo de outros factores de virulência secretadas em uma variedade de tipos de células hospedeiras de mamífero para investigar o papel específico de um factor secretado d bacterianaurante o curso da infecção.

Introduction

Compreender a função de fatores de virulência bacteriana no contexto da infecção da célula hospedeira é um grande foco da investigação patogênese bacteriana. Muitos agentes patogénicos bacterianos segregam activamente toxinas e outros factores solúveis para ajudar na destruição de tecidos do hospedeiro, para iniciar mudanças de sinalização em células hospedeiras ou para manipular as respostas do sistema imunitário durante o curso da infecção 1-10. Embora métodos têm sido desenvolvidas para purificar com sucesso e produzem muitos destes factores de virulência importantes para o estudo, alguns produtos bacterianos têm estruturas únicas ou extensas modificações pós-traducionais que as tornam candidatas recalcitrantes para métodos de purificação e, portanto, não pode ser estudado em isolamento utilizando sistemas in vitro . Por exemplo, Streptococcus do grupo A, o agente patogénico responsável por uma miríade de infecções variando de faringite a fascite necrotizante e síndroma do choque tóxico, produz um segregadatoxina bacteriana conhecida como estreptolisina S (SLS) 11-17. Este péptido ribossomicamente produzido é codificada pelo gene cluster estreptolisina S associado (SAG), e o produto maduro é estimada como sendo de 2,7 kDa em tamanho 14-17. O protoxina, codificado por saga, é modificado pós-tradução de várias enzimas (SAGB, SAGC e SAGD) para produzir a forma madura e funcional 15-17. A complexidade destas modificações pós-traducionais juntamente com a sequência de aminoácidos invulgar da toxina tornaram a toxina incompatível com todos os esforços de purificação e elucidação da estrutura que foram tentadas até à data, 15,17. Estes desafios têm esforços complicados para determinar o papel específico desta toxina na patogênese host.

Nos casos em que a preparação de toxinas purificadas ou outros fatores secretados for muito complexa ou não possível, mecanismos paraelucidar a função destes produtos têm sido tradicionalmente estudada através da preparação de sobrenadantes bacterianos filtrados, que são então aplicadas às células hospedeiras 18-20. Há vários desafios associados com esta técnica. Em primeiro lugar, muitos destes factores segregados, incluindo SLS, não mantêm a actividade máxima ou consistente quando armazenada e aplicada às células hospedeiras em um momento posterior. Além disso, quando os sobrenadantes são recolhidos a um único ponto de tempo e, em seguida, aplicado a células hospedeiras, é difícil determinar a relevância fisiológica e para tirar conclusões directos sobre o processo de infecção natural, em que os factores secretados podem acumular durante o curso da infecção de um concentração f isiologicamente relevante. Este segundo desafio se aplica não só para o uso de sobrenadantes bacterianos, mas também para a utilização de toxinas purificadas em estudos de células hospedeiras de 1 – 3,8. Para resolver estas questões, a inse membrana permeávelinfecção do sistema baseado em RT foi desenvolvido para avaliar os efeitos de SLS em células hospedeiras de uma maneira que mantém a actividade da toxina óptima e também elimina a variável de contacto directo entre as bactérias e as células hospedeiras. Neste sistema, células epiteliais humanas são cultivadas numa monocamada na câmara inferior de uma câmara de dois bem, e as bactérias são introduzidos para dentro da câmara superior do mesmo poço. Uma membrana porosa (0,4 uM poros) separa as câmaras superior e inferior, permitindo factores segregados para ser trocadas entre as duas câmaras, mas a impedir a passagem de bactérias. Este sistema tem permitido para uma avaliação eficaz da resposta do hospedeiro que são unicamente devido a componentes bacterianos secretadas sustentada, eliminando quaisquer respostas que podem ocorrer através do contato direto durante o Grupo de uma infecção estreptocócica. Embora outros factores bacterianas secretadas além SLS também pode passar através da membrana porosa, a utilização de um painel de mutante isogénica incluindo de tipo selvagem (WT), um SLS-kNockout (ΔsagA) e uma saga estirpe complementada (ΔsagA + Saga) permite a avaliação precisa da resposta do hospedeiro que são estritamente SLS dependentes 21.

Embora os sistemas de inserção membrana permeável semelhantes têm sido utilizados para o estudo dos factores segregados envolvidas em infecções virais, biologia do cancro, e a migração de células imunitárias 22 – 26, alguns estudos que envolvem interacções bacterianas com células hospedeiras têm utilizado esta abordagem 6,27,28. Mesmo os estudos que usam tais sistemas para explorar as interacções entre as bactérias e as células hospedeiras têm-se centrado principalmente na migração de células inflamatórias ou bactérias através de uma monocamada epitelial ou endotelial plaqueadas sobre o inserto membrana permeável. O sistema baseia-infecção inserção membrana permeável aqui descrito é um método simples e eficaz que depende da separação de bactérias e células hospedeiras através de uma membrana porosa para avaliar a EFFECTS da toxina secretada, SLS, na integridade da membrana de acolhimento, a viabilidade celular, a transdução de sinal celular, e factores da célula hospedeira segregar. Esta técnica pode ser adaptado para o estudo de outras factores de virulência secretadas em uma variedade de tipos de células hospedeiras de mamífero para investigar o papel de um factor específico de bactérias ao longo do curso de uma infecção.

Protocol

1. Cultura Bacteriana Gerar estirpes mutantes isogénicas para ser utilizado para o estudo do factor segregado específico de interesse 21. Nota: Os GASM1T1 5448 cepas utilizadas para estes experimentos incluídos WT GAS ', um gato Saga Δ SLS deficiente mutante (abreviado no texto como Δ Saga), e uma saga estirpe complementada (abreviado no texto como Δ Saga + Saga) 21. Prepare culturas líquidas durante a noite de estirpes bacterianas de interesse. Cresça GÁS M1T1 5448 estirpes em -10 ml de caldo Todd-Hewitt a 37 ° C durante 16-20 h antes de infectar as células humanas. Centrífuga de culturas durante a noite bacterianas (2,400 rcf durante 10 min) e ressuspender em meio bacteriana fresca. Nota: A ressuspensão no mesmo volume que as culturas durante a noite foram cultivadas em (5-10 ml) geralmente produz uma densidade óptica inicial desejável. Normalizar culturas bacterianas paraAs concentrações iniciais iguais por diluição das culturas re-suspenso em meio bacteriano adicional até que a mesma densidade óptica a 600 nm (OD 600) é obtida para todas as estirpes a serem testadas (DO600 de cerca de 1,0 é recomendada para conveniência). Nota: Nestes estudos, as culturas bacterianas em fase estacionária foram utilizados para infectar células hospedeiras imediatamente após a normalização. No entanto, dado que algumas estirpes de bactérias em fase estacionária saída nonsynchronously pode ser mais apropriado para iniciar infecções hospedeiras com culturas em fase log de se esta se encontra a ser o caso para as estirpes de interesse. Antes de posterior análise, executar uma contagem das colónias de ensaio para determinar as unidades formadoras de colónias (CFU) por mililitro presentes nas culturas de arranque de modo a que a multiplicidade de infecção (MOI), ou a proporção de bactérias por célula hospedeira, pode ser determinada. Prepare 1 ml de diluições em série de culturas bacterianas que foram normalizados para o Densi óptica desejadaTy em tampão fosfato salino (PBS) ou meio de crescimento bacteriano adequado (caldo Todd-Hewitt foi usado nestes estudos). Preparar diluições que vão desde 10 -1 a 10 -6 a produzir, pelo menos, um conjunto de placas de agar com as colónias contáveis ​​(30-300 colónias). Executar todas as diluições em triplicado. Transferir 100 ul de cada diluição em série numa placa de agar contendo meio apropriado para a espécie bacteriana a ser analisado. Nota: Todd-Hewitt agar foi utilizada nestes estudos. Utilizar um vidro ou plástico espalhador bacteriana para distribuir uniformemente a alíquota de 100 ul por toda a superfície da placa de ágar, e continuar a espalhar até que o líquido foi absorvido no agar. Executar sob chamas usando uma técnica estéril. Incubar as placas de agar a 37 ° C durante a noite ou até aparecer colónias contáveis. Contar as colónias que crescem em cada placa e calcular as CFU / ml na cultura original pela seguinte formula: número de colônias x inverso do volume de diluição / cultura de série banhado em mililitros. por exemplo (200 colónias x 1/10 -5 diluição) / 0,1 ml = plaqueadas 2.0 x 10 8 CFU / mL Cultura de Células 2. Anfitrião Obter uma linha de células hospedeira apropriada para as análises desejadas. Nota: os queratinócitos epiteliais humanas HaCaT 29, uma simpática oferta do V. Nizet, foram utilizados para estes estudos. Manter células HaCaT em placas de cultura de 100 mm em meio de Dulbecco modificado de Eagle (DMEM) com soro fetal bovino a 10% inactivado pelo calor (FBS). Incubar a 37 ° C com 5% de CO 2. A infecção celular 3. anfitrião com Permeável Membrana Inserir Sistema células da placa em pratos de cultura de tecidos apropriados e permitir-lhes crescer até atingirem 90% de confluência. Nota: As células HaCaT utilizados nestes estudos tipicamente atingem a confluência dentro de 2-3 days após o plaqueamento. Para recolha de lisado (por exemplo, sinalização de análise e ensaios de determinação de trifosfato de adenosina (ATP)), o prato de células HaCaT em pratos de 6 poços a uma densidade de sementeira de aproximadamente 3 x 10 5 células / poço. Para as experiências de imagiologia de imunofluorescência, células da placa em lamelas de vidro estéreis dentro de 6 pratos de poços a uma densidade de sementeira de aproximadamente 3 x 10 5 células / poço. Para etídio permeabilização da membrana homodímero e ensaios de libertação de lactato desidrogenase (LDH), o prato de células HaCaT em placas de 24 poços a uma densidade de sementeira de aproximadamente 5 x 10 4 células / poço. Imediatamente antes do tratamento, lavar as células com 1x PBS estéril. Aplique meio de crescimento fresco às células. Para as condições aqui descritas, aplicam-se 2 ml de meio por poço para placas de 6 cavidades ou 0,5 ml de meio por poço para placas de 24 poços. Se os tratamentos farmacológicos estão sendo testados, misturar com meio fresco e aplicar durante este step. Nota: Alguns ensaios podem exigir meios de comunicação alternativos. Por exemplo, como fenol concentrações séricas vermelho e alta interferir com o ensaio de libertação de LDH, fenol DMEM isento de vermelho suplementado com albumina a 1% de soro de bovino (BSA) (w / v), 2 mM de L-glutamina, e piruvato de sódio 1 mM foi utilizado para estas experiências. Depois de meio fresco foi aplicada, colocar cuidadosamente uma inserção de membrana de 0,4 um estéril permeável em cada poço. Executar este passo de uma câmara de fluxo laminar, e utilizar uma pinça estéril para transferir a membrana permeável a inserção em cada poço. Aplicar meio de cultura celular fresco para a câmara superior de cada poço de acordo com as instruções do fabricante. Para as condições aqui descritas, aplicam-se 1 ml de meio por poço para placas de 6 cavidades ou 0,1 ml de meio por poço para placas de 24 poços. Aplicar um volume apropriado de culturas bacterianas normalizados (ver secção 1) para a câmara superior do sistema de inserção de membrana permeável. Use meio bacteriano para contr não infectadostratamentos Ol. Para os resultados descritos aqui, adicionar 25 ul de culturas normalizadas por câmara para placas de 24 cavidades e adicionar 100 ul de culturas por cavidade para placas de 6 cavidades. Nota: Nestes estudos, de tipo selvagem ou mutante GAS foi aplicada às células hospedeiras a uma MOI de 10. MOI foi calculada com base nos números de células eucarióticas finais (por exemplo, 2 x 10 6 células / poço), de tal modo que 10 vezes o número de bactérias foram adicionados por célula hospedeira, no início do período de infecção (por exemplo, 2 x 10 7 CFU por cavidade). Apropriada MOI variará com diferentes espécies bacterianas e com as análises de acompanhamento desejados. Nota: Para além de utilizar forma bacteriana para os controlos não infectados, outros controlos úteis para certas aplicações desta técnica podem incluir bactérias mortas pelo calor, ou de meio bacteriano gasto para comparação. Incubar as células infectadas a 37 ° C com 5% de CO 2. Coleção 4. Amostra <ol> Para a coleta de meio de cultura de células, lisados ​​de células hospedeiras, ou lamelas de vidro com células intactas para o acompanhamento análises, comece removendo cuidadosamente a inserção membrana permeável com uma pinça estéril. De Avaliação da Protiens hospedeiras secretados: Recolhe-se o meio a partir da câmara inferior para tubos de 1,5 ml. Evitar perturbar a monocamada durante a coleta. Centrifugar as amostras a 14.000 rcf durante 10 min a 4 ° C para remover os restos celulares. Remover tudo menos 50 ul do sobrenadante para um tubo de 1,5 ml fresco e armazenar a -20 ° C ou utilizar imediatamente. De Avaliação do Host celular Lystates: Suavemente Aspirar o meio acima da monocamada de células hospedeiras. Evitar perturbar a monocamada, pois isso pode resultar em perda de amostra. Lavar as células uma vez com PBS 1x. Gentilmente aspirar PBS. aplica-se imediatamente um volume apropriado de tampão de lise arrefecido com gelo para se obter a concentração de proteína desejada, e incuba-se aas amostras em gelo durante 15 min. Aplicar entre 200 uL e 350 uL de tampão de lise por poço de cada placa de 6 poços para atingir concentrações proteicas entre 0,5 e 1,5 mg / ml. Nota: O tampão de lise utilizada nestes estudos era composta por água desionizada, 1% (v / v) de Nonidet P40 substituto, um cocktail de inibidores de fosfatase, e um cocktail de inibidor de protease. reagentes específicos estão listados na seção de Materiais e Equipamentos. Usar um raspador de células para separar as células da superfície da placa de cada poço e pipeta de todo o conteúdo de cada cavidade para um tubo de 1,5 ml. Centrifugar as amostras a 14.000 rcf durante 20 min a 4 C. Para avaliar componentes ligado solúvel, remover o sobrenadante para um novo tubo e armazenar a -20 C ou usar imediatamente. Para avaliar componentes de lisado insolúveis nucleares ou outros, reservam-se o pellet e armazenar a -20 C ou usar imediatamente. De Avaliação por Imagem Imunofluorescência: Comomeio pirata e lavar as células em 1x PBS frio. Fixar as células durante a noite em% de paraformaldeído (PFA) em PBS solução de 4 (w / v). Nota: Nestes estudos, 1 ml de PFA foi adicionado por poço de cada placa de 6 poços. 5. Aplicações sugeridas Hospedar Signal Analysis Transdução por SDS-PAGE e Western Blotting Recolha lisados ​​de células hospedeiras, como descrito na secção 4.3. Determinar a concentração de proteína de cada ligado por exemplo ácido bicinconínico ensaio (BCA) ou usando padrões de proteínas equivalentes 30. Normalizar as concentrações de proteína entre as amostras antes de carregar e executar as amostras em um gel de poliacrilamida 4-15% ou alternativa apropriada 31. Normalizar as concentrações de amostra, pipetando a mesma quantidade de proteína de cada amostra (por exemplo, 20 ug) para um novo tubo de 1,5 ml e adicionando volumes variáveis ​​de tampão de lise (volume de tampão = volume total de amostra – volumeadicionado) para cada tubo para perfazer o volume total (por exemplo, 50 ul) e final equivalente a concentração de proteína através de amostras. amostras de transferência para um fluoreto de polivinilideno (PVDF) membrana (ou equivalente). Para os resultados descritos aqui, transferir as amostras a 25 volts, durante 2 h antes de aumentar a tensão de 70 volts por um adicional de 45 min. Utilize tampão de transferência constituído por 200 mM de base Tris, 1,5 M de glicina e 20% de metanol (v / v) em água desionizada. membranas de bloco em 5% de BSA + 0,1% de Tween 20 em solução salina tamponada com Tris (TBS). Ajustar em conformidade com base nas recomendações do fabricante para o anticorpo a ser utilizado. Incubar as membranas com anticorpos primários durante a noite a 4 ° C. Uso a fabricante recomenda diluição. Lavar as membranas durante 1,5 h em TBS + 0,1% de Tween 20; refrescar tampão a cada 10-15 minutos. Incubar com peroxidase de rábano (HRP) -conjugated anticorpo secundário, a uma diluição de 1: 5000 durante 1,5 h à temperat quartoure. Lavar as membranas durante 1,5 h em TBS + 0,1% de Tween 20; refrescar tampão a cada 10 – 15 minutos. Incubar membranas com reagente de detecção de quimioluminescência antes do desenvolvimento de película de acordo com as instruções do fabricante. Outros métodos de detecção podem ser utilizados como desejado. Coloração por imunofluorescência de células hospedeiras de e imagem Fix lamelas contendo células hospedeiras, como descrito na secção 4.4. Remover e lavar solução PFA lamelas contendo as células tratadas duas vezes em PBS, aspiração entre as lavagens. Nota: PFA é altamente tóxico e deve ser descartado de forma apropriada. Bloquear as lamelas durante 2 horas à temperatura ambiente, em PBS com 1% (w / v) de soro normal de cabra, 2% (v / v) de Triton X-100, e 0,5% (v / v) de Tween 20. Lavar as lamelas com PBS durante 30 min, o tampão refrescar a cada 10 min. Incubam-se as lamelas com o anticorpo primário a uma razão de 01:50 (ou conforme recomendado pelo fabricante) no bloqueio Soluição durante a noite a 4 ° C. Lave as lamelas durante 1,5 horas em PBS, atualizar a tamponar a cada 30 min. Incubar as lamelas durante 2 horas à temperatura ambiente em anticorpo secundário (de cabra anti-IgG de coelho AlexaFluor488 foi utilizado para estes estudos) usando uma proporção de 1: 200 de anticorpo a solução de bloqueio. Wash lamelas durante 1 hr, refrescar o buffer a cada 20 minutos. Aplicar manchas desejados. Nota: Estes estudos utilizaram DAPI (mancha nuclear) e rodamina-faloidina (mancha de actina) em proporções de 1: 1000 em solução de bloqueio. Incubar lamelas com manchas nucleares e de actina durante 30 min à temperatura ambiente. Lavar as lamelas em STP durante 30 minutos à temperatura ambiente, refrescar o tampão a cada 10 min. Montar as lamelas em lâminas de vidro, utilizando meio de montagem. Permitir lamelas para definir sobre as lâminas durante a noite antes da selagem e de imagem. Para os resultados descritos aqui, recolher imagens em uma USI microscópio de fluorescênciang um objectivo padrão 20X. Use software ImageJ e de imagem de microscópio para processar as imagens capturadas. Homodímero de etídio Ensaio de Morte Celular Aspirar o meio de cada cavidade e lavar as células duas vezes com PBS estéril. Aplicar 4 uM de etídio homodímero-1 em PBS. Incubar as células à temperatura ambiente durante 30 min no escuro. Determinar o nível de fluorescência utilizando um leitor de placa definida como 528 nm de excitação e 617 nm de emissão com um valor de corte de 590 nm. Adicionar 0,1% (w / v) Saponina a cada poço após a leitura inicial e permitir que a placa a incubar durante um adicional de 20 min à temperatura ambiente (com agitação) antes de ler a placa uma segunda vez com as mesmas definições. Determinar a percentagem de permeabilização da membrana individualmente para cada poço dividindo a fluorescência inicial leitura (pós-tratamento) pela segunda leitura de fluorescência (pós-saponina). ATP Ensaio Determinação <li> Recolha lisados ​​como descrito na secção 4.3 acima. Normalizar os níveis de proteína nos lisados ​​via ensaio BCA ou similar 30. Determinar os níveis de ATP celular utilizando um kit de determinação do ATP à base de luminescência ou equivalente de acordo com as instruções do fabricante. Normalizar valores tratados com as amostras de controlo não infectadas correspondentes. Ensaio de libertação de LDH Após a infecção, coletar sobrenadantes como descrito na secção 4.3. Avaliar a libertação de LDH usando um estojo de detecção de citotoxicidade por libertação de LDH de acordo com as instruções do fabricante.

Representative Results

O protocolo de infecção do sistema à base de pastilha membrana permeável desenvolvido para o estudo de factores bacterianas secretadas é detalhado na Figura 1. Este sistema baseia-se na separação de bactérias e células hospedeiras através de uma membrana porosa para avaliar os efeitos dos factores bacterianas secretadas, neste caso a estreptolisina S (SLS), em respostas do hospedeiro, tais como integridade hospedeiro membrana, a viabilidade celular, a transdução de sinal celular, e factores de células hospedeiras segregadas. a Figura 2 proporciona dados representativos de Western Blot demonstrando que este sistema pode ser utilizado para avaliar alterações na activação de contacto proteínas do hospedeiro sinalização independentes de. Especificamente, os dados representativos mostram melhorada significativamente a activação de p38 MAPK na presença de estirpes de gás de produção de SLS. Este sistema também pode ser aplicado para visualizar os efeitos de factores bacterianas secretadas em localização da proteína hospedeira por microscopia de imunofluorescência (<forte> A Figura 3). Os dados mostram a activação do mediador inflamatório chave Factor Nuclear kappa B (NFkB), que transloca desde o citoplasma para o núcleo após activação 21 SLS-dependentes. Os resultados nas Figuras 2 e 3 indicam que tanto o SLS-dependentes respostas de sinalização inflamatórias não requerem o contacto directo entre as bactérias e as células hospedeiras. Como experiências anteriores já demonstraram SLS-dependente p38 e ativação de NFkB em modelos de infecção direta 21, níveis semelhantes de p38 ou activação NFkB entre as três linhagens de gás no sistema baseado na inserção membrana permeável teria indicado que a resposta necessária contacto directo entre a bactérias e células hospedeiras. a Figura 4 demonstra que esta infecção do sistema pode ser aplicado para avaliar as alterações dependentes de toxinas na citotoxicidade anfitrião através de ensaios de homodímero de etídio e a libertação de LDH. Isto é evidenciado pelo aumento significativo in tanto a permeabilização da membrana e na libertação de LDH a partir de células hospedeiras expostas a estirpes de gases, contendo SLS em comparação com células não infectadas ou de células expostas a tensão SLS-deficiente. Estas alterações na citotoxicidade não são imediatos, como os efeitos significativos que não são evidentes após a infecção até 12 horas no caso de permeabilização da membrana e 16 horas no caso de libertação de LDH. Os dados representativos ilustrar a importância da selecção dos pontos de tempo apropriados e condições de infecção para a avaliação destas respostas do hospedeiro. Além de permitir que para a avaliação de alterações da sinalização hospedeiras e citotoxicidade, o sistema de infecção baseada inserção membrana permeável é aplicável ao estudo de alterações metabólicas, tais como a determinação exacta dos níveis de ATP hospedeiro, evitando a contaminação bacteriana de lisados ​​de células hospedeiras (Figura 5) . Estes dados mostram uma perda significativa de ATP de queratinócitos em resposta à infecção com gás por 16 horas após a infecção, com perda de ATP aumentada eun a presença de SLS. Estes resultados são consistentes com os aumentos dependentes da toxina observadas no hospedeiro de sinalização de stress-resposta e citotoxicidade. Figura 1: Infecção Diagrama de Permeável Membrana Insert-Based System Protocol para avaliar os efeitos de fatores bacterianos secretado em células hospedeiras queratinócitos humanos são banhados no compartimento inferior e cresceu para 90% de confluência.. A membrana revestida de colagénio com 0,4 um poros separa as câmaras superior e inferior, e as bactérias são adicionadas à câmara superior do sistema de inserção de membrana permeável para o período de infecção desejado. Sobrenadantes de culturas celulares e células hospedeiras podem ser recolhidas após o período de infecção e utilizado para uma variedade de análises. Por favor clique aqui para ver uma versão maiordesta figura. Figura 2:. O sistema de membrana permeável Infecção Inserir-base pode ser utilizada para hospedeiros de células de Lisado Análise por SDS-PAGE e Western Blotting Os dados representativos demonstram que o SLS aumenta a activação da via de MAPK p38 em queratinócitos infectados. HaCaTs (A) foram infectadas com GÁS durante 7 h, através do sistema de inserção infecção membrana permeável (a MOI = 10) e os lisados ​​foram avaliados para a activação de p38. (B) A densitometria de três independente Ocidental blots foi realizada para quantificar a activação relativa de p38 em resposta a GAS'infection. As médias de três réplicas biológicas são mostrados, com barras de erro representam o desvio padrão. Relativa de activação de p38 é representado como o nível de proteína fosforilada / total. A significância estatística foi determinada em comparação comAs células não infectadas. O p-valor global foi determinada por análise de variância (p = 0,0063). testes de Dunnett foram realizadas post hoc para comparar cada condição para o controle não infectado correspondente dizer. *, P = 0,01-0,05; **, P = 0,001-0,01; ***, P = 0,0001-0,001; ****, P <0,0001. Este valor foi modificado a partir Flaherty et al. 2015 21. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3:. O Sistema de Infecção Permeável Membrana Insert-Baseado Permite a visualização de Host de sinalização Alterações feitas por Imunofluorescência Microscopia Os dados representativos mostram que estreptolisina S aumenta a sinalização pró-inflamatória através da ativação de NFkB. HaCaT queratinócitos humanos foram infectados com gás a uma M OI de 10, durante 8 h utilizando o sistema de infecção baseado no inserto membrana permeável. (A e B) Localização nuclear de NFkB foi avaliado por imagem de imunofluorescência. A percentagem de células localizadas nucleares foi calculado por contagem do número de células em que tinha NFkB translocados a partir do citoplasma para o núcleo para um determinado campo e dividindo esse número pelo número total de células para o mesmo campo. As barras de escala indicam a 100 uM. (A) A média de três réplicas biológicas estão representadas para cada condição com barras de erro representam o desvio padrão. O p-valor global foi determinada por ANOVA; p <0,0001. testes de Dunnett foram realizadas para comparar cada condição para a condição de controle não infectado correspondente. *, P = 0,01-0,05; **, P = 0,001-0,01; ***, P = 0,0001-0,001; ****, P <0,0001. Este valor foi modificado a partir Flaherty et al. 2015 21./ftp_upload/54406/54406fig3large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4:. O Sistema de Infecção Permeável Membrana Insert-base permite a determinação de origem bacteriana-Mediated Membrane permeabilização e citotoxicidade na ausência de contato direto entre as bactérias e células hospedeiras Os dados representativos demonstram que a viabilidade dos queratinócitos diminui na presença de toxina SLS ativa . GÁS – induzida morte celular foi avaliada nas células HaCaT na presença de WT, SLS-deficiente ou Saga GÁS complementado Os queratinócitos foram expostos ao gás que utilizam o sistema à base de inserção infecção membrana permeável para 8-16 horas a um MOI de 10. (. A) A viabilidade foi avaliada pelo ensaio de etídio homodímero ou ensaio de libertação B) LDH (. Em ambos os painéis, 3 replicates são avaliados e barras de erro representam o desvio padrão. A significância para cada ponto de tempo foi determinada por análise de variância (A) 8 h, p = 0,0241; 12 h; p <0,0001 (B) 8 h, p = 0,0287; 12 h, p = 0,1977; 16 h, p = 0,0031. testes de Dunnett foram realizados para comparar as médias de cada doença para a infecção de tipo selvagem para o ponto de tempo correspondente. *, P = 0,01-0,05; **, P = 0,001-0,01; ***, P = 0,0001-0,001; ****, P <0,0001. Este valor foi modificado a partir Flaherty et al. 2015 21. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 5: O Sistema de Infecção Permeável Membrana Insert-Baseado Permite a determinação precisa dos níveis de anfitrião ATP, impedindo Bacterial contaminação de Cell Host Lysates. Os dados representativos demonstram perda SLS dependentes de ATP durante o Grupo de uma infecção estreptocócica. As células HaCaT foram infectadas com GÁS durante 8-16 h utilizando o sistema de infecção baseado no inserto membrana permeável. Técnicas repetições (n = 3) a partir de um replicado biológicas representativas (2 x 10 6 culas por amostra) foram calculadas para cada condição, com barras de erro representam o desvio padrão. O p-valores globais foram determinados por análise de variância (12 h; p <0,0001; 16 h; p <0,0001). testes de Dunnett foram realizadas para comparar cada condição com infecção de tipo selvagem para o ponto de tempo correspondente. *, P = 0,01-0,05; **, P = 0,001-0,01; ***, P = 0,0001-0,001; ****, P <0,0001. Este valor foi modificado a partir Flaherty et al. 2015 21. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Aqui é descrito um método que utiliza um sistema de infecção baseada inserção membrana permeável para examinar os efeitos da toxina bacteriana estreptolisina S em queratinócitos epiteliais humanos num sistema in vitro. Este protocolo pode ser adaptado para o estudo de outras factores de virulência bacterianas secretadas, bem como tipos de células hospedeiras alternativas. Este sistema recentemente desenvolvido fornece várias vantagens sobre os métodos experimentais que utilizam toxinas purificados ou sobrenadantes bacterianos filtrados 1 – 3,8,18 tal – 20. O sistema baseado no inserto membrana permeável proporciona uma dose de manutenção constante da toxina bacteriana a células-hospedeiro relevante, uma vez que é produzida, o que permite que a actividade da toxina máxima deve ser mantida e também aumenta a consistência entre experiências. Além disso, este sistema imita mais de perto as condições fisiológicas, permitindo que o factor secretado a acumular-se ao longo do tempo medida que a infecção progride e por Eliminar a necessidade de seleccionar arbitrariamente concentrações de toxinas específicas para aplicar a células hospedeiras. Além disso, este sistema poderia também proporcionar meios para os investigadores a determinar se um factor bacteriana de interesse é entregue às células hospedeiras de um modo dependente de contacto. Contactar-dependência é frequentemente testado por meio da geração de mutantes deficientes em bacterianas isogénicas aderência ou através da utilização de reagentes que impedem a aderência. O sistema descrito aqui iria fornecer uma alternativa simples para complementar ou substituir estas abordagens tradicionais.

Além das aplicações testadas descritos no ponto 5 do protocolo, outras aplicações a que este sistema infecção pode ser facilmente adaptado incluem a recolha de amostras para matrizes de citocinas e ensaios ELISA. Em ambos os casos, um protocolo semelhante ao descrito para os ensaios de libertação de LDH pode ser seguido. Embora não seja mostrado aqui, este sistema foi usado para recolher amostras eficazmente célula hospedeira a ser umnalyzed por citometria de fluxo. Nesta aplicação, a membrana permeável a inserção é removido após o período de infecção, as células são lavadas para remover o meio de cultura de células, e a tripsina é aplicada para permitir a recolha das células para análise. A separação física de bactérias a partir de células hospedeiras é particularmente útil para esta aplicação porque ajuda a evitar a formação de grandes agregados constituídos por bactérias aderidas e as células hospedeiras que poderiam de outro modo interferir com a contagem de células precisas pelo citómetro de fluxo.

Embora as respostas do hospedeiro muito consistentes foram observadas quando se comparam os resultados dos estudos de infecção com base em pastilhas de membrana permeável com estudos tradicionais de infecção directa, algumas diferenças notáveis ​​na cinética destas respostas do hospedeiro foram observados 21. Por exemplo, alterações na sinalização de acolhimento e de membrana à base de citotoxicidade tomar 30-50% mais tempo para ocorrer no modelo de infecção com base em inserto membrana permeável do que CRrespondendo modelos de infecção directa. Uma vez que o sistema à base de pastilha membrana permeável requer meio a ser aplicada para os compartimentos superior e inferior de cada poço, o sistema desenvolvido para os estudos descritos aqui necessário um aumento de 30% no volume médio total por poço comparada com correspondentes modelos de infecção directa utilizados anteriormente 21. Esta diferença no volume total de meio, juntamente com o aumento da distância entre as bactérias e as células hospedeiras em que o contacto directo é proibida, provavelmente aumenta o tempo que leva para SLS se difundir através do meio para atingir as células hospedeiras e provocar os efeitos observados. Além disso, o sistema baseado em inserir membrana permeável remove muitos fatores GAS virulência que são susceptíveis de contribuir para sediar os danos celulares; a ausência desses fatores adicionais neste sistema é também susceptível de contribuir para o atraso na morte da célula hospedeira e iniciação de eventos hospedeiras sinalização em comparação com infecção direta 21. Esses fatores devem ser consideradosao conceber experiências para avaliar outros componentes bacterianas secretadas.

Para identificar as condições mais significativas para testar os efeitos de factores bacterianas secretadas em células hospedeiras, testando uma gama de pontos de tempo para cada aplicação do sistema à base de inserção infecção membrana permeável é recomendado. É importante ter em conta as condições em que o factor de virulência específicos de interesse é produzida de forma óptima (por exemplo fase log, em fase estacionária, em resposta a certos sinais ambientais, etc.) a fim de observar com êxito os seus efeitos. Em experiências voltadas para avaliar as alterações nas proteínas hospedeiras sinalização, foi necessário seleccionar os pontos de tempo que permitido um tempo suficiente de SLS para atingir células hospedeiras e de ser produzido em quantidades suficientes para induzir a sinalização 21 muda. Ao mesmo tempo, a avaliação de alterações no hospedeiro sinalização necessária para ser conduzida antes da permeabilização da membrana induzida por SLS, como esse efeito complicates a recolha de lisados ​​de células hospedeiras para a análise. A morte celular induzida por SLS pode ser perfeitamente observado em ambos os modelos de infecção à base de inserção directa de membrana permeável e várias horas após a iniciação dos eventos de sinalização 21 relatados. Além disso, na selecção dos pontos de tempo de interesse, é também importante para garantir que as bactérias serem estudadas são incapazes de penetrar a membrana inserção porosa durante o período de estudo. A produção de certos componentes de bactérias durante um período prolongado pode perturbar a integridade da membrana e permitir a passagem de bactérias para o compartimento inferior. Para determinar se este é um problema potencial no sistema de interesse, as estirpes bacterianas a serem estudados pode ser aplicada à câmara superior do sistema baseado no inserto membrana permeável a uma gama de pontos de tempo. Em cada ponto de tempo, a inserção pode ser cuidadosamente removido e o meio a partir da câmara inferior pode ser recolhida e utilizada numa co colónia padrãoensaio unting (ver secção 1.5). Se não há colónias são formadas a partir do meio de cultura celular no compartimento inferior, a membrana de inserção pode ser considerado como estando prevenir eficazmente a passagem de bactérias no ponto de tempo e a carga bacteriana testada.

Um outro componente de design experimental que é provável que requerem optimização para a análise de eficácia de factores bacterianas secretadas é a multiplicidade de infecção (MOI). A MOI refere-se à proporção de células bacterianas por célula hospedeira, e, portanto, é influenciada pela célula hospedeira de confluência no momento da infecção e do número de unidades formadoras de colónias bacterianas (UFC) aplicado às células. Nestes estudos, as células de queratinócitos cresceram até 90% de confluência, o que permitiu que essas células para formar uma monocamada coesa com junções apertadas intactas. cuidadosa consideração da organização fisiológica das células hospedeiras a ser estudado é necessário selecionar uma confluência apropriado para experimentos de infecção. Uma vez que um apropriate número de células hospedeiras por poço é determinada, uma CFU bacteriano adequado pode ser calculado com base fora da MOI desejada. Nos estudos aqui descritos, GAS foi aplicada às células hospedeiras a uma MOI de 10. MOI apropriado irá variar com diferentes bactérias e com as análises de seguimento desejados. Um baixo início MOI é tipicamente mais fisiologicamente relevante e permite o factor bacteriana de interesse a acumular-se de forma suficientemente lenta para capturar alterações subtis na sinalização célula hospedeira antes que as alterações drásticas na viabilidade de células hospedeiras são evidentes. MOI mais elevadas são utilizadas em diversos estudos que avaliam a citotoxicidade, mas este efeito pode também ser conseguido por começando com uma baixa MOI e permitindo a infecção de progredir para um longo período de tempo. É importante para determinar uma CFU precisas para corolário densidade óptica para todas as estirpes bacterianas a serem testadas, como mutantes isogénicas podem ter uma taxa de crescimento alterado em comparação com bactérias de tipo selvagem e podem, portanto, requerem que uma CFU maior ou menor ser adicionados por cavidade deassegurar uma comparação apropriada da resposta do hospedeiro entre as linhagens. Nos casos em que as células hospedeiras de mamífero a ser estudados são capazes de matar bactérias ou inibir o seu crescimento, ou se o crescimento nonsynchronous entre estirpes bacterianas é suspeita, que também pode ser útil para realizar estudos para avaliar a carga bacteriana final no fim do período de infecção. Isto poderia ser conseguido através da recolha de o conteúdo do inserto permeável e realizando um ensaio de contagem de colónias semelhante ao descrito no ponto 1.5 do processo.

Seleccionar poços de tamanho apropriado para o ensaio desejado, também é importante para a obtenção de resultados óptimos. inserções de membrana permeável estão disponíveis numa variedade de tamanhos, mas os resultados mais consistentes para os estudos aqui apresentados foram observados utilizando inserções concebidos para 24 poços e 6 placas de cultura de tecido. Estes tamanhos de pastilhas são relativamente fáceis de manusear com fórceps estéreis, e facilidade de manipulação é crítica em Preventing transferência indesejada de bactérias a partir do compartimento superior para o compartimento inferior do poço. Para experiências envolvendo a coleção de lisados ​​de células hospedeiras, 6 pratos bem fornecer um número de célula apropriada por condição para a maioria das análises e são grandes o suficiente para acomodar raspadores de células para coleta de amostras. Para os ensaios de citotoxicidade em que as células hospedeiras permanecem aderentes e são marcadas com um corante fluorescente ou colorometric que pode ser medida num leitor de placa (por exemplo, de etídio ensaio homodímero, ensaio de exclusão de azul de tripano), uso de uma placa de 24 poços com as inserções correspondentes é recomendado. Para experiências em que o meio de cultura de células serão coletadas e analisadas (por exemplo, a libertação de LDH, estudos de citocinas) ou o 24 bem ou podem ser utilizados 6 placas bem, embora os poços menores normalmente fornecem volumes de amostras adequadas para estas análises e minimizar o uso do necessário reagentes. Em geral, o método é altamente versátil e pode ser adaptado, conforme necessário para preparar samples para inúmeras aplicações de acompanhamento.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank our fellow Lee Lab colleagues, who provided valuable insight and expertise that greatly assisted this research. This work was supported by the Young Innovator Award from the National Institute of Health, awarded to S.W. Lee (NIH-1DP2OD008468-01). R.A. Flaherty is supported by the Albertus Magnus Fellowship provided by Dr. Robert C. Boguslaski, and a teaching assistantship through the Eck Institute for Global Health at the University of Notre Dame.

Materials

Todd-Hewitt broth Acumedia 7161A Use appropriate broth for bacterial species of interest.
BioSpectrometer Eppendorf basic model Any UV-Vis spectrophotometer is suitable. 
Petri Dishes Fisher Scientific FB0875713 Other brands are suitable.
Agar Sigma A1296-1kg Other brands are suitable.
HaCaT human epithelial keratinocytes Gift from lab of Victor Nizet.
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) Life Technologies 11995-073 Use appropriate media for cell line of interest.
Fetal Bovine Serum (FBS) Biowest S162H Use appropriate media additives for cell line of interest.
10cm tissue culture dishes Nunc 150350 Other brands are suitable.
6 well tissue culture dishes CytoOne cc7682-7506 Other brands are suitable but need to be compatible with the Corning insert.
24 well tissue culture dishes CytoOne cc7682-7524 Other brands are suitable but need to be compatible with the Corning insert.
Glass coverslips Fisherbrand 12-541-B These must be autoclaved prior to use for cell plating.
Phosphate Buffered Saline (PBS) Gibco 10010-023
Phenol Red Free DMEM Life Technologies 31053028 Phenol Red Free media is only required for the LDH release assay.
Bovine Serum Albumin (BSA) Fisher Scientific BP1600-100
L-glutamine Gibco 25030149 Only required to supplement cell culture media for LDH release assay.
Sodium pyruvate Gibco BP356100 Only required to supplement cell culture media for LDH release assay.
Collagen-coated 0.4μm Transwell inserts (6 well) Corning 3540
Collagen-coated 0.4μm Transwell inserts (24 well) Corning 3595
Forceps Fisher 3120018 These must be sterilized with ethanol prior to handeling Transwell inserts.
Cell scrapers Fisherbrand 08-100-241 These are only required for the collection of cell lysates.
Paraformaldehyde Fisher Scientific 04042-500 TOXIC.  This is only required for immunofluorescence imaging.
Bicinchoninic acid (BCA) assay kit Pierce 23227 Other protein quantification assays may be used.
Tris-glycine 4-15% polyacrylamide gels BioRad 4561083 Buffer system and percent polyacrylamide should be selected based on proteins of interest.
Electrophoresis cassette supplies BioRad 1658063 Only required for Western Blotting.
Electrophoresis power supply BioRad 1645050 Only required for Western Blotting.
Western blot transfer cassette BioRad Only required for Western Blotting.
Polyvinylidene (PVDF) Membrane EMD Millipore IPVH00010 Only required for Western Blotting.
Tween 20 Sigma P1379-500mL
Rabbit IgG-HRP secondary antibody Santa Cruz Biotechnology sc2030 The secondary antibody should be determined based on the selected method of detection. 
Mouse IgG-HRP secondary antibody Santa Cruz Biotechnology sc2031 The secondary antibody should be determined based on the selected method of detection. 
Phospho-p38 (T180+T182) MAPK antibody Cell Signaling 4511 Select appropriate primary antibodies based on proteins of interest.
Total p38 MAPK antibody Cell Signaling 8690 Select appropriate primary antibodies based on proteins of interest.
Goat anti-rabbit IgG Alexafluor488 Molecular Probes A-11034 Other secondary antibodies may be used for immunofluoresence imaging detection.
LumiGLO Detection Reagent KPL 54-61-00 Only required for Western Blotting with detection on film.
Detection film Biodot BDB57 Only required for Western Blotting with detection on film.
DeltaVision Nikon 90i fluoresence microscope Nikon Other fluorescence microscopes are suitable for these analyses.
Normal goat serum Thermo Scientific 31873
Triton X-100 Sigma T9284-500mL
DAPI nuclear stain Cell Signaling 4083 Select stains based on specific immunofluorescence applications of interest.
Rhodamine-phalloidin actin stain Molecular Probes R415 Select stains based on specific immunofluorescence applications of interest.
Fluoromount-G Southern Biotech 0100-01 Only required for immunofluorescence imaging.
Ethidium homodimer 1 Molecular Probes E1169 Only required for membrane permeabilization cytotoxicity assay.
Spectramax M5 Microplate Reader Molecular Devices Other microplate readers capable of detecting UV-vis, fluorescence and luminescence may be suitable.
Saponin Sigma 47036-50G-F Only required for membrane permeabilization cytotoxicity assay.
Molecular Probes ATP Determination Kit Life Technologies A22066 Other kits are likely to be suitable.
Cytotoxicity Detection Kit for LDH release Roche 11644793001 Other kits are likely to be suitable.
Nonidet P40 Substitute Sigma 74385-1L Other suppliers are suitable.
HALT Phosphatase Inhibitor Cocktail Thermo Scientific 78420B Other cocktails are likely to be suitable.
SIGMAFAST Protease Inhibitor Cocktail Tablets, EDTA-free Sigma S8830-2TAB Other cocktails are likely to be suitable.
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Flaherty, R. A., Lee, S. W. Implementation of a Permeable Membrane Insert-based Infection System to Study the Effects of Secreted Bacterial Toxins on Mammalian Host Cells. J. Vis. Exp. (114), e54406, doi:10.3791/54406 (2016).
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