基于插入渗透膜感染系统的实现研究分泌细菌病毒对哺乳动物宿主细胞的作用

1.细菌培养产生等基因突变株用于感兴趣21的具体分泌因子的研究。 注意：这些实验包括使用的GASM1T1 5448株 WT 气“， 佐贺 Δ 猫 SLS缺陷的突变（简称文本为ΔSAGA）和SAGA补充株（简称文本为ΔSAGA SAGA +）21。 制备感兴趣的细菌菌株的过夜液体培养物。生长气体M1T1在-10毫升的Todd-Hewitt肉汤的5448菌株在37℃下16-20小时感染人体细胞之前。 隔夜离心细菌培养（2 400 RCF 10分钟），并悬浮在新鲜的细菌培养基。 注意：在相同的体积重悬的过夜培养物在（5-10毫升）生长通常产生期望初始光密度。 规范化的细菌培养，以通过在600nm（OD 600）稀释在附加细菌培养基中再悬浮培养物，直至相同的光密度等于起始浓度获得用于所有菌株进行测试（OD的大约1.0 600被推荐为方便起见）。 注意：在这些研究中，固定相细菌培养物用于感染宿主细胞立即正常化以下。然而，如细菌出口固定相的一些菌株nonsynchronously它可能更合适，如果这被发现是对所关注的菌株的情况下，开始与对数期培养物宿主的感染。 之前进一步分析，执行一个菌落计数测定以确定在起始培养物存在的每毫升菌落形成单位（CFU），使感染复数（MOI），或每宿主细胞的细菌的比率，可以被确定。 制备1毫升已归一化到所需的光学DENSI细菌培养物的系列稀释液在磷酸盐缓冲盐水（PBS）或适当的细菌生长培养基（的Todd-Hewitt肉汤在这些研究中使用）TY。制备稀释从10 -1至10 -6，以产生至少一组与可数菌落（30-300集落）琼脂平板。一式三份进行所有稀释。 转移100μl的各系列稀释的到被分析含有用于细菌种类适当培养基的琼脂平板。 注意：在这些研究中，使用的Todd-休伊特琼脂。 使用玻璃或塑料细菌吊具均匀分布的100微升等分试样在整个琼脂板的整个表面上，并且继续传播，直到液体已经被吸收到琼脂。使用无菌技术下进行的火焰。 孵育在37℃的琼脂平板过夜，或直到可数的菌落出现。 计数生长在各平板上的克隆和由以下formu计算在原始培养物中的CFU / ml的LA：菌落数×镀毫升连续稀释/培养体积成反比。 例如：（200个菌落点¯x1/10 -5稀释）/ 0.1毫升镀= 2.0×108 CFU /毫升 2.宿主细胞培养获得用于所需的分析合适的宿主细胞系。 注：角质形成人体上皮角质月29日 ，从五Nizet一种礼物，被用于这些研究。 维持在100mM培养皿HaCaT细胞在Dulbecco改进的Eagle培养基（DMEM）和10％热灭活的胎牛血清（FBS）。孵育在37℃，5％的CO 2。 3.宿主细胞感染渗透膜插入系统板细胞在合适的组织培养皿中，让他们成长，直到他们达到90％汇合。 注意：在这些研究中通常使用2〜3天之内到达汇合的HaCaT细胞电镀后AYS。 对于溶胞产物收集（ 例如信令分析和三磷酸腺苷（ATP）的测定测定），板HaCaT细胞在6孔培养皿中以大约3×10 5个细胞的接种密度/孔。 对于免疫荧光成像实验，板的细胞上在6孔培养皿中无菌盖玻片在约3×10 5个细胞的接种密度/孔。 为乙锭同型二聚体膜通透性和乳酸脱氢酶（LDH）释放测定法，镀HaCaT细胞在24孔培养皿中以大约5×10 4个细胞的接种密度/孔。 紧接在治疗之前，洗涤细胞以1×无菌PBS。 应用新鲜生长培养基细胞。对于这里所描述的条件下，应用每阱2毫升培养基为6孔板或每孔0.5毫升介质24孔板中。如果药物治疗正在测试中，拌入新鲜培养基，这期间STE申请页。 注意：有些试验可能需要替代的媒体。例如，如酚红和高血清浓度与LDH释放测定干扰，无酚红的DMEM补充有1％牛血清白蛋白（BSA）（重量/体积），2mM的L-谷氨酰胺和1mM丙酮酸钠是这些实验利用。 新鲜培养基已经施加之后，小心地在每一个无菌0.4微米透过膜插入井。执行在层流罩此步骤中，并使用无菌镊子对渗透膜插入物转移到每孔中。 根据制造商的说明适用新鲜的细胞培养基中的每个孔中的上腔室。对于这里所描述的条件下，应用每孔1ml培养基6孔板或每孔0.1毫升介质24孔板中。 申请归细菌培养物（见第1）至渗透膜的插入系统的上部腔室的适当体积。使用细菌培养基对照感染醇治疗。对于这里所描述的结果，添加25微升每室的归一化培养物的24孔板中，并加入100微升每室中培养的6孔板中。 注意：在这些研究中，野生型或突变体气体施加到宿主细胞 在10 MOI的MOI基于最终的真核细胞数，计算（ 例如 2×10 6个细胞/孔），使得均在感染期的开始（ 例如 ，2×每宿主细胞中加入10倍的细菌每孔10 7 CFU）。适当的MOI将与不同的细菌种类，并与所希望的后续分析而变化。 注意：除了使用细菌培养基未感染的对照，对于本技术的某些应用可以包括热灭活的细菌或用于比较花费细菌介质其他有用的控制。 孵育感染的细胞在37℃，5％的CO 2。 4.样品采集 <OL> 收集细胞培养基，宿主细胞裂解物，或玻璃盖玻片与完整细胞的后续分析中，开始通过仔细地除去用无菌镊子渗透膜插入。 对于分泌主机Protiens的评估： 收集来自下部腔室中的介质进入1.5毫升管中。避免收集过程中的干扰单层。 在4℃下14000 RCF离心10分钟离心样品以除去细胞碎片。 在-20°C删除所有，但50微升上清到一个新的1.5 ml管和储存或立即使用。 对于宿主细胞Lystates的评估： 轻轻吸宿主细胞的单层以上的介质。避免打扰单层，因为这可能会导致样品损失。 用1X PBS冲洗细胞一次。 轻轻吸PBS。立即应用冰冷的裂解缓冲液的适当体积，以获得所需的蛋白质浓度，并孵育在冰上15分钟的样品。 200微升和350微升每每6孔板的裂解缓冲液之间适用以实现0.5和1.5毫克/毫升之间蛋白浓度。 注意：在这些研究中所用的裂解缓冲液的组成为去离子水，1％（V / V）的Nonidet P40替代，磷酸酶抑制剂混合物，和蛋白酶抑制剂混合物。具体的试剂列在材料和设备部分。 使用细胞刮棒从每个的板面分离细胞并在每个的全部内容吸取井到1.5毫升管。 离心样品在4℃14000 RCF离心20分钟。 为了评估水溶性成分溶解产物，去除上清到一个新的管并储存在-20℃或立即使用。 评估核或其他不溶性裂解物组分，保留沉淀并贮存在-20℃或立即使用。 通过免疫荧光成像技术评价： 如海盗中，洗1X冷PBS细胞。 过夜在4％低聚甲醛（PFA）溶液固定细胞在PBS（重量/体积）。 注意：在这些研究中，将1ml的PFA每每6孔板的孔中加入。 5.建议应用主机信号转导分析SDS-PAGE和Western印迹收集宿主细胞裂解物如4.3节所述。 确定由二辛可宁酸（BCA）测定法或等效使用蛋白质标准30各样品裂解物的蛋白质浓度。 标准化样品之间蛋白浓度之前加载和运行在4-15％聚丙烯酰胺凝胶或合适的替代31样本。 样品体积-通过从每个样品（ 例如 20微克）吹打相同蛋白量成新的1.5毫升管并加入裂解缓冲液的可变体积（缓冲量=总体积正常化样品浓度加）到各管中，使总体积（ 例如 50微升）和最终蛋白质浓度相当于整个样品。 转移样品到一个聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（或等效物）。对于这里描述的结果，增加电压至70伏为额外的45分钟，然后在25伏转移样品2小时。使用200mM的Tris碱，1.5M甘氨酸和去离子水的20％甲醇（体积/体积）组成的转移缓冲液。 在5％BSA + 0.1％吐温20的Tris块膜缓冲盐水（TBS）。相应地调整根据制造商的建议，将要使用的抗体。 孵育初级抗体的膜在4℃下过夜。在使用厂家推荐的稀释。 洗膜在TBS + 0.1％吐温20 1.5小时;刷新缓冲每次10-15分钟。 与辣根过氧化物酶（HRP）缀合的孵育二级抗体以1:1的稀释度：5000，在室温TEMPERAT 1.5小时URE。 洗膜在TBS + 0.1％吐温20 1.5小时;刷新缓存每10 – 15分钟。 根据制造商的说明在胶片显影前孵育化学发光检测试剂膜。如需要，可以使用其它的检测方法。 宿主细胞免疫荧光染色和成像如第4.4节所述的修复含有宿主细胞盖玻片。 除去PFA溶液和洗涤含有处理的细胞两次在PBS盖玻片，洗涤之间进行抽吸。 注：PFA是剧毒的，必须适当处置。 用1％阻断在PBS中室温下搅拌2小时的盖玻片（重量/体积）正常山羊血清，2％（V / V）的Triton X-100和0.5％（体积/体积）吐温20。 用PBS洗涤盖玻片30分钟，刷新缓冲每10分钟。 孵育初级抗体的盖玻片在1:50比率（或由制造商推荐的）在阻断溶胶ution过夜，在4℃。 洗盖玻片在PBS 1.5小时，刷新缓冲区每隔30分钟。 孵育盖玻片在二级抗体室温2小时用1（山羊抗兔IgG AlexaFluor488被用于这些研究）：抗体的阻断溶液200比。 洗盖玻片1小时，刷新缓冲区每隔20分钟。 应用所需的污渍。 注意：在封闭溶液1000：利用DAPI（核染色）中，在1比罗丹明 – 鬼笔环肽（肌动蛋白染色）这些研究。 孵育核和肌动蛋白污渍盖玻片在室温下30分钟。 洗盖玻片在PBS，在室温下30分钟，刷新缓冲每10分钟。 安装在使用安装介质载玻片盖玻片。 允许盖玻片前一夜密封和成像设置幻灯片。对于这里描述的结果，在一个荧光显微镜USI采集图像纳克一个标准的20倍的目标。使用ImageJ的和显微镜的成像软件来处理拍摄的图像。 乙锭同型二聚体细胞死亡含量从每个孔洗细胞两次用无菌PBS吸介质。 在PBS申请4μM的乙锭同型二聚体-1。 在室温下孵育细胞，在黑暗中30分钟。 确定用酶标仪设定为528纳米激发和617与590纳米的截止值nm发射的荧光的程度。 加0.1％（重量/体积）皂苷对每个孔之后的初始读数，并允许读出板的第二时间在相同的设置前板孵育在室温下（与摇动）一个额外的20分钟。 由第二荧光读数（后皂素）除以初始荧光读数（后处理）单独确定百分之膜通透为每个孔中。 ATP含量测定<li>如上述第4.3节收集裂解液。 通过BCA测定或类似30正常化的裂解物的蛋白质水平。 确定使用基于发光的ATP的测定试剂盒，或根据制造商的说明等效细胞ATP水平。 正常化处理值，以相应的未感染的对照样品。 LDH释放分析感染后，收集上清如4.3节所述。 根据制造商的说明使用细胞毒性检测试剂盒为LDH释放评价LDH释放。