Clasificación de flujo y secuenciación exome de las células Reed-Sternberg del linfoma de Hodgkin clásico
Summary
En este trabajo describimos una clasificación combinada de células de citometría de flujo y un protocolo de construcción de biblioteca de próxima generación, de bajo ingreso, diseñado para producir datos de exome de alta calidad de las células Hodgkin Reed-Sternberg (HRS) del linfoma de Hodgkin clásico (CHL).
Abstract
Las células de Hodgkin Reed-Sternberg del linfoma de Hodgkin clásico se distribuyen escasamente dentro de un fondo de linfocitos inflamatorios y típicamente comprenden menos del 1% de la masa tumoral. El material derivado del tumor a granel contiene contenido de tumor a una concentración insuficiente para la caracterización. Por lo tanto, la clasificación de células activadas por fluorescencia utilizando ocho anticuerpos, así como la dispersión lateral y hacia adelante, se describe aquí como un método de separación y concentración rápidas con miles de células HRS de alta pureza del tumor para estudio posterior. Al mismo tiempo, debido a que los protocolos estándar para la secuenciación de exome típicamente requieren 100-1,000 ng de ADN de entrada, que a menudo es demasiado alto, incluso con clasificación de flujo, también proporcionamos un protocolo optimizado de construcción de biblioteca de entrada baja capaz de producir alta calidad Datos de tan poco como 10 ng de ADN de entrada. Esta combinación es capaz de producir bibliotecas de próxima generación adecuadas para la captura de hibridación de todo-eXome o más enfocados paneles de destino, como se desee. La secuenciación exome de las células HRS, cuando se compara con células T o B intratumor sanas, puede identificar alteraciones somáticas, incluyendo mutaciones, inserciones y deleciones, y alteraciones del número de copias. Estos hallazgos aclaran la biología molecular de las células HRS y pueden revelar vías para los tratamientos de fármacos dirigidos.
Introduction
Los avances en genómica del cáncer como resultado de la próxima generación de secuenciación han llevado a avances significativos en la identificación de objetivos terapéuticos y en el pronóstico de muchas neoplasias hematológicas y no hematológicas. Se están introduciendo rápidamente nuevas estrategias de tratamiento individualizadas basadas en alteraciones genómicas específicas en muchos tipos de tumores (revisadas en las referencias 1 , 2 ). A pesar de los avances significativos en la genómica del linfoma, el genoma de las células HRS neoplásicas en el linfoma de Hodgkin clásico (CHL) había sido subexplorado. Las investigaciones se han visto obstaculizadas por la escasez de células HRS neoplásicas dentro de un microambiente reactivo, lo que dificulta el aislamiento de células purificadas HRS poblaciones [ 3] .
El método para aislar células HRS viables de tumores primarios fue desarrollado por Fromm et al. 4 ,El método utiliza un cóctel de ocho anticuerpos, que consta de CD30, CD15, CD40, CD95, CD45 CD20, CD5 y CD64, para identificar inequívocamente células HRS a partir de una suspensión tumoral CHL. Son capaces de aislar al menos 1.000 células HRS viables de suspensiones de células frescas o congeladas a partir de biopsias tumorales que consisten en al menos 10 ^ { 7 } células (aproximadamente 10 mg de tejido). La pureza es superior al 90% mediante análisis citométrico de flujo y se estima que es Al menos 80% por exome análisis genómico de diez casos consecutivos.
Hemos refinado una técnica de aislamiento de células de citometría de flujo que ha facilitado enormemente el proceso, lo que permite el rápido aislamiento de miles de células HRS viables de los tumores primarios CHL [ 7] . Hemos utilizado la técnica para producir lo que se cree que es la primera secuencia de todo el exome de las células tumorales en los casos primarios de linfoma de Hodgkin. Nuestros estudios demuestranE viabilidad de alto rendimiento, el genoma de los estudios de los casos individuales CHL y ya han llevado a la identificación de nuevas alteraciones genómicas con el potencial de explicar los aspectos de la patogénesis CHL.
Desarrollamos una tubería para utilizar el ADN extraído para estudios genómicos de alto rendimiento. Con el fin de obtener resultados fiables de tan sólo 1.000 células HRS clasificadas (el mínimo obtenido a partir de casos secuenciales), hemos desarrollado un procedimiento modificado de construcción de biblioteca de ADN de próxima generación 8 que nos permitió aumentar la eficiencia de ligadura adaptador y generar bibliotecas de fragmentos de ADN Sin amplificación excesiva. Este método permite el análisis de muestras clínicas de rutina y la detección de mutaciones recurrentes y alteraciones cromosómicas 7 .
Protocol
Representative Results
Discussion
Aplicaciones o direcciones futuras después de dominar esta técnica
Este trabajo permite la secuenciación exome de muestras que contienen al menos 10 ng de ADN. En el contexto clínico, este límite excluye la mayoría de las muestras de aspiración con aguja fina debido a un material insuficiente, pero incluye biopsias de núcleo adecuadas y muestras de biopsia por escisión. Esto permitirá la adquisición de datos de un conjunto más grande de posibles muestras.
<p …Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El desarrollo de este método de proyecto fue financiado por el Departamento de Patología y Medicina de Laboratorio de Weill Cornell Medical College. Reconocemos el Programa de Formación Tri-Institucional en Biología Computacional y Medicina para la financiación parcial. Quisiéramos agradecer a los científicos que compartieron su tiempo y conocimiento con nosotros, especialmente Maryke Appel; Dan Burgess; Iwanka Kozarewa; Chad Locklear; Y todos los miembros de la Fundación Genómica de la Facultad de Medicina de Weill Cornell, incluyendo Jenny Zhang, Xiaobo (Shawn) Liang, Dong Xu, Wei Zhang, Huimin Shang, Tatiana Batson y Tuo Zhang.
Materials
| Petri or Cell Culture Dish (sterile) | |||
| RPMI-1640 Media | Roswell Park Memorial Institute | ||
| Fetal Calf Serum (FCS), (heat inactivated) | |||
| Freezing Media (RPMI, 20% FCS, 10% dimethylsulfoxide (DMSO))-make fresh and keep sterile | |||
| RPMI with 2% FCS (make fresh or store for up to 1 month) | |||
| scalpel with fresh blade | |||
| 10 ml syringe (no needle) | |||
| Cryogenic vials | |||
| 50 ml conical centrifuge tubes, force | |||
| Centrifuge | capable of handling 50 ml conical centrifuge tubes and providing 400g | ||
| Hepes buffer(1M, cell culture grade) | |||
| phosphate buffered saline (PBS) | |||
| Pluoronic-F68 | Thermo-Fisher | 24040-032 | |
| DNAase-I | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | D4527-10KU | store as 5mg/ml in RPMI in -200C |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | |||
| Sort Media (PBS+2%BSA+25mM HEPES+ Pluoronic –F68 (1X)) | |||
| CD64-FITC (22) | Beckman Coulter, Miami, FL | 20 uL suggested starting volume; Titering is suggested | |
| CD30-PE (BerH83) | BD Biosciences, San Jose, CA | 20 uL suggested starting volume; Titering is suggested | |
| CD5-ECD (BL1a) | Beckman Coulter, Miami, FL | 10 uL suggested starting volume; Titering is suggested | |
| CD40-PerCP-eFluor 710 (1C10) | Ebiosciences, San Diego, CA | 5 uL suggested starting volume; Titering is suggested | |
| CD20-PC7 (B9E9) | Beckman Coulter, Miami, FL | 10 uL suggested starting volume; Titering is suggested | |
| CD15-APC (HI98) | BD Biosciences, San Jose, CA | 20 uL suggested starting volume; Titering is suggested | |
| CD45 APC-H7 (2D1) | BD Biosciences, San Jose, CA | Can be substituted with 10 uL suggested volume of CD45-Krome Orange (J.33, Beckman Coulter); Titering is suggested | |
| CD95-Pacific Blue (DX2) | Life Technologies, Grand Island, NY | 5 uL suggested starting volume; Titering is suggested | |
| CD2 (5 μg; clone RPA-2.10) | Biolegend, San Diego, CA | For optional protocol; Titering is suggested | |
| CD54 (10 μg; clone 84H10) | Serotec, Oxford, United Kingdom | For optional protocol; Titering is suggested | |
| CD58 (10 μg; clone TS2/9) | eBioscience, San Diego, CA | For optional protocol; Titering is suggested | |
| LFA-1 (12 μg; clone MHM23) | Novus Biologicals, Littleton, CO | For optional protocol; Titering is suggested | |
| BD CS&T Beads | BD Biosciences, San Jose, CA | ||
| BD Accudrop Beads | BD Biosciences, San Jose, CA | ||
| BC Versa Comp antibody capture beads | Beckman Coulter, Miami, FL | Compensation Beads | |
| BD-FACS ARIA special research order instrument using 5 lasers | BD Biosciences, San Jose, CA | any BD-FACS aria with capabilities to detect the fluorochromes in the antibody panel should be sufficient | |
| Wizard | Promega | A2360 | |
| 10 mM Tris-Cl buffer | NA | ||
| Qubit dsDNA HS Assay kit | Life Technologies, Carlsbad, CA | ||
| S2 Sonicator | Covaris, Woburn, MA | Alternatives may be substituted | |
| microTUBE | Covaris, Woburn, MA | ||
| Low-Throughput Library Preparation Kit | Kapa Biosystems, Wilmington, MA | KK8221 | |
| Sybr Green | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S9430 | |
| Agencourt AMPure XP Beads | Beckman Coulter, Miami, FL | ||
| Bioanalyzer | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | ||
| SeqCap EZ Exome v.3.0 | Roche Nimblegen | 6465684001 | |
| HiSeq | Illumina | ||
| TruSeq-style Universal adapter | Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa | HPLC purification; AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGAT*C*T | |
| TruSeq-style index adapter | Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa | HPLC purification; /5Phos/GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACNNNNNNATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG | |
| TruSeq-style PCR primer 1 | Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa | AATGATACGGCGACCACCGAGA | |
| TruSeq-style PCR primer 2 | Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa | CAAGCAGAAGACGGCATACGAG | |
| Nuclease Free Duplex Buffer | Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa | ||
| BD FACSDIVA software | BD Biosciences, San Jose, CA | ||
| BD Falcon Tubes | BD Biosciences, San Jose, CA | ||
| BD Flow Tubes | BD Biosciences, San Jose, CA | ||
Riferimenti
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