ve Doğan RNA FISH ile kopyalanma Analizi<em> İn Vivo</em> Trofoblast Dev Hücreler ya da<em> İn Vitro</em> Ectoplacental Koni Eksplantlarından kısa vadeli Kültürler
Summary
Trophoblast giant cells (TGCs) play a key role in the placenta to ensure a healthy pregnancy. We present a protocol for assessing the transcriptional status of genes in TGCs by nascent fluorescent in situ hybridization on cryostat sections of post-implantation embryos or short-term cultures of embryonic day 7 ectoplacental cones.
Abstract
Plasenta bir ekstra-embriyonik soyundan, ilkel trofoblast türemiştir. iç hücre kütlesi örten kutup trofoektoderm sonra ikincil TGCs içine farklılaşma çoğalmaya devam ederken peri-implantasyon fare blastosist olarak, duvar trofoektoderm hücreleri birincil trofoblast dev hücreler (TGCs) içine ayırt. TGCs olan plasentadan önemli bir rol oynayabilir ve başarılı bir gebelik için gereklidir. implantasyon sonrası gelişimi sırasında spesifik genlerin transkripsiyonel regülasyonu İncelenmesi TGCs gelişimi anlayışlar verebilir. Kutup ilkel trofoblast türetilen gebelik (E7-7.5) arasında 7-7.5 gün embriyolardan ectoplacental koni (EPC), hücreleri, ikincil TGCs 1 içine ayırt. TGCs sayısı, bu aşamada çok düşük olmasına rağmen TGCs E7 embriyo kriyostat kesitleri üzerinde in situ olarak incelenebilir. İkincil TGCs analiz için alternatif bir yöntem E7 embriyo bireysel EPC kısa dönem kültürleri kullanmaktırs. Biz in vivo ve doğmakta olan transkript görselleştirmek için in situ hibridizasyon (RNA FISH) floresan kullanılarak tek hücre düzeyinde in vitro hem de ilgi genlerin transkripsiyonel durumunu araştırmak için bir teknik önermek. Bu teknik, gen ekspresyonunun doğrudan okunmasını sağlar ve büyük endoreplicating hücreleridir TGCs kromozomal durumu değerlendirilmesini sağlar. Gerçekten de, TGCs farklılaşması önemli bir özelliği, hücre döngüsü çıkıp endoreplication.This yaklaşım birden fazla tur tabi otozomal ve / veya cinsiyet kromozomları ifade edilen herhangi bir genin ekspresyonunu tespit etmek için uygulanabilir ve gelişim ilgili önemli bilgiler sağlar olmasıdır mekanizmaları olarak plasental hastalıklar.
Introduction
Memeli trofoblast dev hücreler (TGCs) anne ve embriyonik dokular arasında bir bariyer oluşturur. Onlar rahim içine implantasyonu ve gebeliğin işgali aracılık ve plasenta oluşumu için gelişiminde kritik rol oynamaktadır. Onlar birkaç büyüme faktörleri (sitokinler) ve embriyonik büyüme ve hayatta kalmak için gerekli Prolaktin / plasenta laktojeni ailesi ve steroidler, hormonları üretir. TGCs ve G, değişken fazlarda ardışık oluşan bir hücre döngüsü, endocycle olan hücreleri, büyük tek çekirdekli ve poliploid bulunmaktadır. Gerçekten de, TGCs bir bölme 2 DNA sentez birden fazla tur geçmesi mümkün hücreleri endoreplicating edilir. Diğer embriyonik ve extraembryonic hücre tipleri ile karşılaştırıldığında TGCs in vivo genlerin transkripsiyonel durumunu incelemek için, Yeni oluşan RNA FISH implantasyon sonrası aşamalarında kriyostat kesitleri 3, in vivo olarak gerçekleştirilebilir. TGCs nedeniyle thei için bölümlerinde kolayca tanınabilirr büyük boyutlu ve transkripsiyonel gen aktivitesi kaydedildi ancak erken post-implantasyon aşamalarında onların sayısı düşüktür edilebilir. E7 embriyonik bölümlerde TGCs azlığı, trofoektoderm gelişimi sırasında gen ifadesinin düzenlenmesi incelemek için farklılaştırılmış TGCs elde etmek embriyonik trophectodermal dokuların kısa vadeli kültürleri gerçekleştirmek için götürdü. yani trofoektoderm hücreleri (TS) kök Ayrıca, sırayla mümkün olduğunca fizyolojik olarak kalması, kurulan hücre hatları ikincil TGCs nedeniyle anormal gene TGCs hatalarına ile ilişkili patolojik gebelik incelemek için değerli bir araç sağlamak gelişim mekanizmaları Nesil araştırmak için her zaman uygun değildir farelerde düzenleme.
Ectoplacental koni (EPC) trofoblast hücrelerin ikincil TGCs 4 öncüleridir. İkincil TGCs için kültür EPC spontan farklılaşma daha önce 5 bildirilmiştir. Ancak, birincil TGCs, ikincil TGC Farkli çalışmalarının aksinesokan presumablydue maternal veya embriyonik dokularda serbest EPC eksplantlar izole zorluklara, sınırlı kalmıştır. Biz E7, TGCs çok az, ancak EPC öncüleri elde edilebilir gelişimsel implantasyon sonrası aşamasında tek tek embriyodan türetilen ikincil TGCs ilgili RNA FISH gerçekleştirmek için, bu yöntemler adapte. Nükleer birincil transkript analiz RNA BALIK ikincil TGCs üzerinde tek hücre düzeyinde seviyesinde hiç yapılmamıştı. Bu transkripsiyon hassas analiz izin verir ve implantasyon sonrası aşamada 3'te TGCs epigenetik instabilite göstermek için kullanılmıştır.
Memelilerde epigenetik klasik bir örneği, X kromozomu inaktivasyonu (XCI) Heard laboratuarında 6 incelenmiştir. Bu işlemde dişi 2 X kromozomu bir inaktive edilir. Xist transkript kat bunun bir kadın hücrelerinde ifade edilir ve en çok genin susturulması tetikler edildiği X kromozomu kodlayıcı olmayan. RNA, FISH kullanılarak,X'e bağlı genlerin olgunlaşmamış transkript olabildiğince incelenebilir inaktif X kromozomu (Xi) üzerine Xist RNA birikimi. Biz burada post-implantasyon embriyoların bölümlerinde ve EPC kısa vadeli kültürleri üzerinde RNA FISH gerçekleştirmek için bir prosedür açıklanmaktadır. Kadın embriyonik kök hücreleri ve preimplantasyon embriyolar 7-11 ayırıcı XCI incelemek için kullanılan edilenler uyarlanan Bu protokol. In vitro TGCs, hem de in vivo olarak bir kadın embriyolar XCI örnekler verilmektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Yeni oluşan RNA BALIK farklı gelişim aşamalarında embriyonik dokuda transkripsiyonel aktivitenin tek bir hücre analizi için kolay ve hassas bir yöntemi temsil eder. Bu yaklaşımın gücü morfolojik kriterlere göre herhangi bir aşamada farklı embriyo soy tespit kapasitesidir. Bununla birlikte bu aynı zamanda minimum eşiğe mevcut olmasını gerektirir. Herhangi bir arka plan farklı embriyonik bölgeleri ve zorlu hücre tiplerinin belirlenmesi vermektedir. Minimal bir arka plan sağlamak için, bu protokolde iki kritik adımlar vardır. İlk cryosection kalitesi ve ikinci gen ekspresyon seviyesi ve prob kalitesine bağlıdır RNA FISH, verimi (sinyal gürültü oranı) 'dir. İkincisi için, sondalar bu nedenle her zaman bölümlerinde kullanımdan önce lamelleri (embriyonik kök hücreler veya somatik hücre) ile kültürlenmiş hücreler üzerinde test edilmiştir.
Bu protokol, biz th sağlamakE teknikleri iki farklı numune hazırlama türleri (kriyostat kesitleri ve embriyonik eksplant primer kültürlerinde) den TGCs üzerinde RNA BALIK analizi gerçekleştirmek için gerekli. Bu tür tek hücre analizi değerlendirilmesi gereken farklı post-implantasyon aşamalarında gen ifadesinde dinamik değişiklikleri sağlar.
Biz (E7-7.5 implantasyon sonrası aşamalarında) orta TGCs oluşturmak için tarif yöntemleri implantasyon sonrası aşamalarında TGCs oluşmaktadır ekstra embriyonik soy X kromozomu inaktivasyonu kalıplarını incelemek için laboratuarımızda kullanılmıştır. kemirgenlerde Ekstra embriyonik gelişim TGCs ayrımında bağlıdır. Nitekim, TGCs plasental ve böylece embriyonik gelişimi için gereklidir. TGC farklılaşmasında Kusurları embriyonik ölümcül (inceleme için başvuru 15) neden olur. RNA FISH kullanarak TGCs transkripsiyonel aktivite bize fare gelişimi 3 sırasında bu tür hücre tipinin alışılmadık bir X kromozomu inaktivasyonu durumunu göstermek için izin verdi.
<p clap = "jove_content"> elde edilir ve ikincil TGCs çalışma için sunulan yöntemler, normal ve mutant farelerde, hem de bir parçası olan önemli bir ekstra embriyonik dokuların gelişimi moleküler yolları okumak için uygulanabilir. Bu yaklaşımlar, diğer memelilerde TGC gelişimini incelemek için uyarlanabilir. Bizim analizimiz bize in vivo TGCs ve EPC eksplant elde edilen in vitro TGCs çeşitli genlerin transkripsiyonel aktivitesini değerlendirmek için izin vahşi tip fare embriyoları kullanımını içeriyordu. Bu yöntem, ve / veya kültür ortamı içinde, inhibitör moleküllerinin eklenmesi ile transgenik farelerin analizine genişletilebilir. Biz başarıyla gibi akıbet geliştirdi sırasında 4-5 gün boyunca ayrı ayrı kültüre olabilir fare geliştirme, E3.0 blastosist önceki bir aşamada görünen birincil TGCs gibi, TGCs Başka tip RNA FISH bu yöntemi kullandık ICM büyük birincil TGCs 16,17 tarafından çevrili olmak. Farklı için olgunlaşmamış transkripthem Xist genler görüntülenmiştir, aynı RNA FISH yaklaşımı 3 ile niceliksel olarak belirtilmiştir.Kombine immünofloresan ve RNA balık da, in vitro kültürlenmiş TGCs 3 gibi kriyostat kesitleri üzerinde gerçekleştirilebilir. Bu, birincil transkript bozunmaya çok hassastırlar ve RNaz içermeyen bileşiklerin mutlak bir gereklilik değildir yöntem olup özelliği, çok sağlam olduğunu gösterir. / RNA BALIK aynı anda belirli bir hücrede transkripsiyon seviyeleri, hücresel lokalizasyonu ve protein ifadesi, hakkında ek bilgi sağlar IF. Parafine gömülü doku kesitleri, daha önce elimizde, doku morfolojisi 18 muhafaza ederken, insan tümörlerinde Yeni oluşan RNA tespit etmek için kullanılmıştır rağmen, kriyostat kesitleri immünofloresan sırasında antikorların tespiti için gerekli oluşmakta olan RNA ve her iki epitopu da korumak için daha uygun olan .
RNA, FISH ek olarak, im şumunofluorescence, kromozomal DNA, balık da RNA balık 3 için kullanılanlara benzer florokromlar ile işaretlenmiş problar kullanılarak sekonder TGCs gerçekleştirilebilir. Floresan probları ya da plazmidler / fosmids veya BAC'ler, burada kullanılan floresan dUTPs ile etiketlenmiş ve Chaumeil ve diğ., 8'de tarif olabilir. Seçenek olarak ise, floresan markajlı oligonükleotidlerin 19 kullanılabilir. DNA, FISH şerit spesifikliğini gerektirmediği için, oligonükleotid probları hedef bölgede iki tamamlayıcı şeritlerin hedeflemek üzere dizayn edilebilir. Sinyal amplifikasyon spesifik ve amplifikatör probların iki ardışık mermi elde dallı DNA probları, aynı zamanda FISH sinyallerini 20 bir sinyal-gürültü oranı arttırmak için kullanılabilir. Bizim DNA bazlı prob sinyal kalitesi, özgüllük ve kullanım kolaylığı arasında daha iyi bir dengeyi sağlamak, ancak alternatif olarak, örneğin riboprobes gibi RNA probları kullanılabilir.
Son olarak, 3D görüntü acquisitibu büyük hücreler gerekli mekansal bilgi elde etmek için gereklidir ve böyle DeltaVision (GEH) olarak Dekonvolüsyonun böyle Apotome mikroskop olarak floresan mikroskop, ya da Epifloresans mikroskop kullanarak çeşitli yapılabilir, ya da diğer mikroskoplar uygun görüntüleme doku bölümleri, ve büyük için (> 20 mikron) TGCs. Tek kopya DNA loci için, doğmakta olan RNA FISH veya DNA FISH ile tespit noktalı sinyal kolayca konfokal mikroskobu ile tespit edilemeyebilir dikkat edilmelidir.
Sonuç olarak, burada açıklamak yöntemleri yararlı hem gelişimsel bir bağlamda TGS'nin detaylı analiz için değil, aynı zamanda diğer hastalık durumlarında olmalıdır. Kemirgenlerde TGC gelişimi ve fonksiyonu katılan bir çok gen, kopyalama faktörleri, proteaz ve hücre adhezyon moleküllerinin 21 gibi kemirgenler ve insanlarda arasında muhafaza edilir. Fare TGCs plasenta gelişme, düzenleyen okuyan genler için bir hücre modeli vardırd nedenle insan plasental hastalıklar içgörüler verir. Dahası, bu hücreler endoreplicating ve bazı kanser hücreleri endocycle programları meşgul olduğundan, gen amplifikasyonu işlemlere ek olarak, tarif yöntemler de kanser hücrelerinin istikrarsızlığı genom neden mekanizmaları keşfetmek için gerekli olan tek bir hücre araştırmalarda yardımcı olması gerektiği gerçeğine .
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz resimli yardım için Sophie gournet teşekkür Julie Chaumeil el yazması, hayvan barınma tesisi ve Birim görüntüleme platformu okumak için. Bu çalışma programı «Investissements d'Avenir» altında destek alan referanslar ANR-10-LABX-0044 ve ANR-10-IDEX-0001-02 PSL, EpiGeneSys 7.ÇP hayır ile Fransız Hükümeti tarafından başlatılan ve ANR tarafından uygulamaya koymuştur. EH mükemmellik 257.082 Ağ, bir ERC Advanced Araştırmacı hayır ödül. 250.367 ve AB 7.ÇP SYBOSS hiçbir hibe. 242.129 EH yazarlar ışık yardım için Institut Curie, Fransa-Biyogörüntüleme (ANR-10-InSb-04) üyesi, ve Genetik ve Gelişimsel Biyoloji Bölümü (UMR3215 / U934) Hücre ve Doku Görüntüleme Platformu kabul etmek istiyorum mikroskopi.
Materials
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ 1500 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi SV6 | |
| Scissors Pascheff-Wolff | Moria | MC19 | |
| Dumont #5 forceps | Roth | PK78.1 | |
| 4-well tissue culture dishes | Nunc | 176740 | |
| 60 mm Petri dishes Falcon | Dutsher, France | 353004 | |
| 100 mm Petri dishes Falcon | Dutsher, France | 353003 | |
| Coverslips 18×18 | VWR | 631-1331 | |
| Coverslips 22×22 | VWR | 631-0125 | |
| 12 mm glass round coverslips | Harvard apparatus | 64-0712 | |
| Slides Superfrost plus | VWR | 631-9483 | |
| 4-slide Transport box Lockmailer | Dutsher, France | 40684 | |
| Cryotubes 1.8 ml Corning | Fisher Science | 10418571 | |
| Glass Coplin staining jars | Fischer Scientific | W1561L | |
| TissueTek O.C.T compound | VWR | 4583 | |
| RPMI 1640 medium | Invitrogen | 61870 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D1408 | 10x is used |
| Water | Sigma-Aldrich | W3500 | |
| Paraformaldehyde | Panreac Quimica, Spain | 141451 | 3% in PBS |
| Triton-X-100 | Euromedex | 2000-A | 0.5% final |
| Vanadyl ribonucleoside complex (VRC) | New England Biolabs, USA | S1402S | |
| Sodium dextran sulfate | Sigma-Aldrich | D8906 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | New England Biolabs, USA | B9001S | |
| Formamide | Sigma-Aldrich | 47671-1L-F | aliquots kept at -20°C |
| Illustra TempliPhi Kit Construct (Kit MDA) | Dutsher, France | 25-6400-80 | |
| Nick translation kit | Abbott, USA | 07J00-001 | |
| 20x SSC buffer concentrate | Sigma-Aldrich | S6639 | |
| Spectrum green dUTP | Abbott, USA | 02N32-050 | |
| Spectrum red dUTP | Abbott, USA | 02N34-050 | |
| Cy-5 dUTP | Dutsher, France | PA55022 | |
| Mouse Cot-1 DNA | Invitrogen | 18440016 | |
| DNA, MB grade | Invitrogen | Roche | DNA from fish sperm |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Sigma-Aldrich | D9564 | DAPI |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| p-phenylenediamine | Sigma-Aldrich | 695106 | |
| Centrifuge 5417R | Eppendorf, Germany | molecular biology grade | |
| Eppendorf concentrator plus | Eppendorf | ||
| Eppendorf Thermomixer comfort | Eppendorf | ||
| Liquiport Liquid pump | KNF Neuberger, Trenton, USA | ||
| Shake'N'Bake Hybridization oven | Boekel Scientific, USA | ||
| Cryostat | Leica | CM3050 | |
Riferimenti
- Cross, J. C. Genetic insights into trophoblast differentiation and placental morphogenesis. Sem. Cell Dev. Biol. 11, 105-113 (2000).
- Zybina, E. V., Zybina, T. G. Polytene chromosomes in mammalian cells. Int. Rev. Cytol. 165, 53-119 (1996).
- Corbel, C., Diabangouaya, P., Gendrel, A. -. V., Chow, J. C., Heard, E. Unusual chromatin status and organization of the inactive X chromosome in murine trophoblast giant cells. Development. 140, 861-887 (2013).
- Rossant, J., Tamura-Lis, W. Effect of culture conditions on diploid to giant-cell transformation in postimplantation mouse trophoblast. J. Embryol. Exp. Morphol. 62, 217-227 (1981).
- El-Hashash, A. H., Kimber, S. J. Trophoblast differentiation in vitro: establishment and characterization of a serum-free culture model for murine secondary trophoblast giant cells. Reproduction. 128, 53-71 (2004).
- Chow, J. C., Heard, E. X inactivation and the complexities of silencing a sex chromosome. Curr Opin Cell Biol. 3, 359-366 (2009).
- Chaumeil, J., Okamoto, I., Heard, E. X-chromosome inactivation in mouse embryonic stem cells: analysis of histone modifications and transcriptional activity using immunofluorescence and FISH. Methods Enzymol. 376, 405-419 (2004).
- Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation. Methods Mol. Biol. 463, 297-308 (2008).
- Okamoto, I., Otto, A. P., Allis, C. D., Reinberg, D., Heard, E. Epigenetic dynamics of imprinted XCI during early mouse development. Science. 303, 644-664 (2004).
- Okamoto, I., Arnaud, D., Le Baccon, P., Otte, A. P., Disteche, C. M., Avner, P., Heard, E. Evidence for de novo imprinted X-chromosome inactivation independent of meiotic inactivation in mice. Nature. 438, 369-373 (2005).
- Patrat, C., Okamoto, I., Diabangouaya, P., Vialon, V., Le Baccon, P., Chow, J., Heard, E. Dynamic changes in paternal X-chromosome activity during imprinted X-chromosome inactivation in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. 106, 5198-5203 (2009).
- Geijsen Shea, K., N, Dissection of 6.5 dpc mouse embryos. J. Vis. Exp. (2), e160 (2007).
- Pollex, T., Piolot, T., Heard, E. Live-cell imaging combined with immunofluorescence, RNA, or DNA FISH to study the nuclear dynamics and expression of the X-inactivation center. Methods Mol. Biol. 1042, 13-31 (2013).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9, 671-675 (2012).
- Hemberger, M. IFPA award in placentology lecture – characteristics and significance of trophoblast giant cells. Placenta. 29, 4-9 (2008).
- Carney, E. W., Prideaux, V., Lye, S. J., Rossant, J. Progressive expression of trophoblast-specific genes during formation of mouse trophoblast giant cells in vitro. Mol. Reprod. Dev. 34, 357-368 (1993).
- Shin, J., et al. Maternal Rnf12/RLIM is required for imprinted X-chromosome inactivation in mice. Nature. 467, 977-981 (2010).
- Capodieci, P., Donovan, M., Buchinsky, H., Jeffers, Y., Cordon-Cardo, C., Gerald, W., Edelson, J., Shenoy, S. M., Singer, R. H. Gene expression profiling in single cells within tissue. Nat Methods. 9, 663-665 (2005).
- Beliveau, B. J., Joyce, E. F., Apostolopoulos, N., Yilmaz, F., Fonseka, C. Y., McCole, R. B., Chang, Y., Li, J. B., Senaratne, T. N., Williams, B. R., et al. Versatile design and synthesis platform for visualizing genomes with Oligopaint FISH probes. Proc. Natl. Acad. Sci. 109, 21301-21306 (2012).
- Kenny, D., Shen, L., Kolberg, J. A. Detection of viral infection and gene expression in clinical tissue specimens using branched DNA (bDNA) in situ hybridization. J. Histochem. Cytochem. 50, 1219-1227 (2002).
- Cross, J. C., Baczyk, D., Hemberger, M., Hugues, M., Simmons, D. G., Yamamoto, H., Kingdom, J. C. Genes, development and evolution of the placenta. Placenta. 24, 123-130 (2003).
