의 초기 RNA 물고기에 의해 전사 분석<em> 생체</em> 영양막 세포 거대 세포 또는<em> 체외</em> Ectoplacental 콘의 Explants의 단기 문화
Summary
Trophoblast giant cells (TGCs) play a key role in the placenta to ensure a healthy pregnancy. We present a protocol for assessing the transcriptional status of genes in TGCs by nascent fluorescent in situ hybridization on cryostat sections of post-implantation embryos or short-term cultures of embryonic day 7 ectoplacental cones.
Abstract
태반은 한 여분의 배아 혈통의 trophectoderm에서 유래. 내부 세포 덩어리 위에 놓인 극 trophectoderm 나중에 차 TGCS로 분화 증식을 계속하는 동안 요정 주입 쥐의 배반포에서, 벽화 trophectoderm 세포는 차 영양막 세포 거대 세포 (TGCS)로 분화. TGCS 개발 태반에서 핵심적인 역할을하고 성공적인 임신을 위해 필수적이다. 착상 후 개발하는 동안 특정 유전자의 전사 조절의 조사는 TGCS 개발에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 북극 trophectoderm에서 파생 된 임신 (E7-7.5)의 7-7.5 일에서 배아에서 ectoplacental 콘 (EPC)의 세포, 보조 TGCS 1로 분화. TGCS 수가이 단계에서 매우 낮지 만 TGCS은 E7에서 배아의 저온 유지 부에 동일계에서 연구 될 수있다. 이차 TGCS을 분석하는 또 다른 수단은 E7 배아 개별 내피 전구 세포의 단기 배양 물을 사용하는 것에스. 우리는 생체 내 및 초기 전 사체를 시각화 계내 혼성화 (FISH RNA)에 형광체를 사용하여 단일 세포 수준에서의 시험 관내 모두에서 관심 유전자의 전사 상태를 조사하는 방법을 제안한다. 이 방법은 유전자 발현의 직접적인 판독을 제공하며, 대형 endoreplicating 셀인 TGCS 염색체 상태의 평가를 가능하게한다. 실제로 TGCS 말단 분화의 중요한 특징은 세포주기를 종료하고 endoreplication.This 방법의 여러 발사를 거쳐 염색체 및 / 또는 성 염색체로부터 발현하는 유전자의 발현을 검출하는 데 적용 할 수 있고, 개발에 중요한 정보를 제공 할 수있다 메커니즘뿐만 아니라 태반 질환.
Introduction
포유 동물 영양막 세포 거대 세포 (TGCS)은 산모와 태아 조직 사이에 장벽을 형성한다. 그들은 자궁에 주입하고, 수태의 침공을 중재하고 태반의 형성을위한 발달에 중요한 역할을한다. 그들은 여러 성장 인자 (사이토 카인)와 배아의 성장과 생존에 필요한 프로락틴 / 태반 락토 겐의 가족과 스테로이드의 호르몬을 생산하고 있습니다. TGCS는 S와 G 위상을 교대로 구성된 세포주기의 endocycle와 세포, 큰 단핵 및 배수체이다. 사실, TGCS 모든 부문이없이 DNA 합성의 여러 라운드를받을 수 세포를 endoreplicating있다. 다른 배아 배외 (extraembryonic)과 세포 유형에 비해 TGCS 생체 내에서 유전자의 전사 상태를 조사하기 위하여, 초기 RNA의 FISH 특정 착상 후 단계에서 저온 유지 부 (3)의 생체 내에서 수행 될 수있다. TGCS 인해 파묻혀에 섹션에 쉽게 알아볼 수 있습니다R 큰 크기 및 전사 유전자의 활동을 기록하지만 초기 착상 후 단계에서 자신의 번호가 낮을 수있다. E7 배아 부분에 TGCS의 소수는 trophectoderm 개발 과정에서 유전자 발현의 조절을 연구하기 위해 차별화 된 TGCS를 얻기 위해 배아 trophectodermal 조직의 단기 문화를 수행하기 위해 우리를 이끌었다. 즉 trophectoderm 세포 (TS)를 줄기 또한, 위해 가능한 생리 학적으로 남아 설립 세포주 보조 TGCS 인해 비정상적인 유전자에 TGCS의 결함과 관련된 병리학 적 임신을 연구하는 유용한 도구를 제공의 발달 메커니즘의 생성을 조사하기 위해 항상 적합하지 않다 마우스의 규제.
ectoplacental 콘 (EPC)의 영양막 세포는 보조 TGCS 4의 전구체이다. 보조 TGCS에 배양 내피 전구 세포의 자발적 분화 이전에 5를보고되었다. 그러나 차 TGCS, 보조 TGC의 differen에 대한 연구는 대조적으로tiation는 presumablydue 어떤 산모 나 태아 조직의 무료 EPC 외식 분리의 어려움, 제한된 남아있다. 우리는 E7, TGCS이 매우 적은 있지만 EPC 전구체로부터 생성 될 수있는 개발 후 주입 단계에서 개별 배아에서 파생 된 보조 TGCS에 RNA의 FISH를 수행하기 위해 이러한 방법을 적용. 핵 차 성적표를 분석하는 RNA의 물고기는 보조 TGCS의 단일 세포 수준의 수준에서 수행 된 적이있다. 이 전사의 정확한 분석이 가능하고 이식 후 3 단계에서 TGCS의 후생 유전 학적 불안을 표시하기 위해 사용되었다.
포유 동물에서 후성 유전학의 고전적인 예는 X 염색체 비활성화 (XCI)는 허드 연구소 6 연구되고있다. 이 과정에서 여성에서 2 X 염색체 중 하나는 비활성화된다. XIST 성적 증명서 코트는 여성 세포에서 발현 대부분의 유전자의 침묵을 트리거되는 X 염색체 비 코딩. RNA의 물고기를 사용하여,X 연결된 유전자의 초기 성적은 가능한 한 조사 할 수있는 비활성 X 염색체 (사이)에 XIST RNA의 축적. 우리는 여기에서 착상 후 배아의 섹션과 EPC의 단기 문화에 RNA FISH을 수행하는 절차를 설명합니다. 여성 배아 줄기 세포와 착상 전 배아 7-11 차별화에 XCI을 연구하기 위해 사용 된 것과 적응이 프로토콜. 우리는 시험 관내 TGCS뿐만 아니라, 생체 내에서 여성의 배아에서 XCI의 예를 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
초기 RNA FISH는 서로 다른 발달 단계에서 배아 조직에서 전사 활동의 단일 세포 분석을위한 쉽고 민감한 방법을 나타냅니다. 이 방법의 파워 학적 기준에 따라 임의의 특정 단계에서 상이한 계통의 배아를 식별 할 수있는 능력이다. 그러나이 또한 최소한의 배경 형광이 존재해야합니다. 그러한 배경이 다른 배아 지역과 도전 세포 유형의 식별을 렌더링합니다. 최소한의 배경을 보장하기 위해,이 프로토콜에서 두 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫번째는 동결 절단 (Cryosections)의 품질이며, 둘째는 유전자 발현 수준과 프로브의 품질에 의존 RNA FISH의 효율 (신호 대 잡음 비)이다. 후자의 경우, 프로브 그러므로 항상 섹션을 사용하기 전에 커버 슬립 (배아 줄기 세포 또는 체세포)에 배양 된 세포에 시험한다.
이 프로토콜에서는, 우리는 일 제공전자 기술은 두 개의 서로 다른 시료 제제의 종류 (저온 유지 부 및 배아 이식편의 차 배양)에서 TGCS에서 RNA의 FISH 분석을 수행하는 데 필요한. 이러한 단일 세포 분석 평가하는 다양한 착상 후 단계에서 유전자 발현의 동적 변화를 가능하게한다.
우리가 (E7-7.5 후 주입 단계에서) 보조 TGCS를 생성하기 위해 설명하는 방법은 사후 주입 단계에서 TGCS 구성되어 여분의 배아 계보의 X 염색체 비활성화 패턴을 연구하기 위해 실험실에서 사용되었다. 설치류에서 엑스트라 배아 개발 TGCS의 분화에 따라 달라집니다. 사실, TGCS는 태반 따라서 배아 발달에 필수적이다. TGC 분화의 결함은 배아 치사를 (검토 기준 15 참조) 발생합니다. RNA FISH를 사용 TGCS의 전사 활동은 우리가 마우스 개발 3 중에 이러한 세포 유형의 비정상적인 X 염색체 불 활성화 상태를 입증 할 수 있었다.
<p class = "jove_content"> 구하여 보조 TGCS 공부 여기에 제시된 방법은 정상 및 돌연변이 마우스에서 모두가의 일부 중요한 추가 배아 조직 개발 분자 경로를 연구에 적용될 수있다. 이러한 접근 방법은 다른 포유류의 TGC 개발을 조사하도록 구성 될 수있다. 분석은 우리 생체 TGCS 및 EPC 이식편 유래의 체외 TGCS 다양한 유전자의 전사 활성을 평가할 수 있도록 야생형 마우스 배아의 사용을 포함했다. 이 방법 및 / 또는 배지에서 분자 억제제의 첨가에 의해 트랜스 제닉 마우스의 분석으로 확장 될 수있다. 우리는 성공적 가지를 개발하는 동안 4-5일의에 대한 개별적으로 배양 할 수 있습니다 마우스 개발, E3.0의 blastocyts의 초기 단계에 나타나는 주요 TGCS로, TGCS의 다른 유형에 RNA FISH이 방법을 사용했다 ICM은 큰 차 TGCS (16, 17)에 의해 포위된다. 다른에 대한 초기 성적 증명서뿐만 아니라 XIST 같은 유전자는 시각화와 같은 RNA의 FISH 방법 3을 사용하여 정량화 할 수있다.결합 된 면역 및 RNA FISH는 체외 배양 TGCS 3뿐만 아니라 저온 유지 부에서 수행 될 수있다. 이것은 기본 증명서는 분해에 매우 취약하고 된 RNase 유리 화합물의 절대 조건이있는 한 방법은 매우 견고한 것을 보여준다. / RNA FISH 동시에 주어진 셀의 전사 수준, 세포 현지화 및 단백질 발현에 대한 추가 정보를 제공합니다. 파라핀 포매 조직 섹션 이전 우리 손에, 조직의 형태 (18)을 유지하면서 인간 종양에서 초기 RNA를 검출하기 위해 사용 된,하지만, 저온 유지 섹션 면역 동안 항체의 탐지에 필요한 초기 RNA 및 에피토프를 모두 보존 더 적합 .
RNA 물고기뿐만 아니라, 메신저 다음munofluorescence는 염색체 DNA FISH는 RNA의 FISH 3에 사용 된 것과 유사한 형광 색소로 표지 된 프로브를 사용하여 이차 TGCS에서 수행 될 수있다. 형광 프로브는 어느 플라스미드 / fosmids 또는 BAC에, 여기에서 사용 된 형광 표지 dUTPs 및 Chaumeil 외., (8)에 기술 될 수있다. 대안 적으로, 형광 표지 된 올리고 뉴클레오티드 (19)를 사용할 수있다. FISH는 DNA 가닥 특이성을 필요로하지 않기 때문에, 올리고 뉴클레오티드 프로브는 표적 부위에 상보적인 두 가닥 중 하나를 목표로 설계 될 수있다. 신호 증폭 특정 증폭기 프로브 개의 순차 발사함으로써 달성된다 분지 DNA 프로브는도 FISH 신호 (20)의 신호 대 잡음비를 향상시키기 위해 사용될 수있다. 우리의 DNA 프로브에 기반 신호 품질 특성 및 사용의 용이성 간의 더 나은 균형을 보장하지만 대안 적으로, 리보 프로브와 같은 RNA 프로브가 사용될 수있다.
마지막으로, 3D 이미지 acquisiti에이 큰 셀에서 필요한 공간 정보를 얻기 위하여 필수적이며, 예 Deltavision (GEH)로서 컨벌루션와 같은 Apotome 현미경과 같은 형광 현미경, 또는 표면 형광 현미경의 다양한 사용하여 수행 될 수 있고, 또는 다른 현미경 적합 이미징 조직 섹션, 대형 용 (> 20 μm의) TGCS. 단일 복사본 DNA 궤적위한 초기 RNA 또는 DNA의 FISH의 FISH에 의해 검출 된 신호 점상 용이 초점 현미경에 의해 검출하지 않을 수도 있다는 것을 유의한다.
결론적으로, 우리가 여기서 설명하는 방법이 유용 모두 발달 맥락에서 TGS의 상세한 분석을 위해,뿐만 아니라 다른 질병 상황에 있어야합니다. 설치류 TGC 개발 및 기능에 관여하는 많은 유전자는 전사 인자, 단백질 분해 효소 및 세포 부착 분자 (21)와 같은 설치류와 인간 사이에서 보존된다. 마우스 TGCS는 태반 개발을 조절 공부 유전자 세포 모델입니다D 따라서 인간의 태반 질환에 대한 통찰력을 제공합니다. 또한, 인해 이들 세포 endoreplicating이고 일부 암세포 endocycle 프로그램과 결합하기 때문에, 유전자 증폭 방법 외에도,이 서술 된 방법은 또한 암세포 불안정 게놈 주요 메커니즘을 탐구하는 데 필요한 단일 세포 연구에 도움이되어야한다는 사실 .
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 그림에 대한 도움말은 소피 Gournet 감사, 줄리 Chaumeil 원고, 동물 주택 설비 및 장치의 영상 플랫폼을 읽어. 이 작품은 프로그램«INVESTISSEMENTS 드 아브 니르»에서 지원을받은 참조 ANR-10 LabX에-0044 및 ANR-10 IDEX-0001-02 PSL의 EpiGeneSys FP7 없음으로 프랑스 정부에 의해 출시 ANR에 의해 구현했다. EH에 우수 257082 네트워크, ERC 고급 수사관이없는 수여. 250,367 및 EU FP7 SYBOSS은 부여하지 않습니다. 242129 EH에 저자는 빛에 대한 도움 연구소 퀴리, 프랑스 Bioimaging (ANR-10 InSb를-04) 회원의 유전학과 발달 생물학 교실 (UMR3215 / U934)의 세포 및 조직 이미징 플랫폼을 인정하고 싶습니다 현미경 사용.
Materials
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ 1500 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi SV6 | |
| Scissors Pascheff-Wolff | Moria | MC19 | |
| Dumont #5 forceps | Roth | PK78.1 | |
| 4-well tissue culture dishes | Nunc | 176740 | |
| 60 mm Petri dishes Falcon | Dutsher, France | 353004 | |
| 100 mm Petri dishes Falcon | Dutsher, France | 353003 | |
| Coverslips 18×18 | VWR | 631-1331 | |
| Coverslips 22×22 | VWR | 631-0125 | |
| 12 mm glass round coverslips | Harvard apparatus | 64-0712 | |
| Slides Superfrost plus | VWR | 631-9483 | |
| 4-slide Transport box Lockmailer | Dutsher, France | 40684 | |
| Cryotubes 1.8 ml Corning | Fisher Science | 10418571 | |
| Glass Coplin staining jars | Fischer Scientific | W1561L | |
| TissueTek O.C.T compound | VWR | 4583 | |
| RPMI 1640 medium | Invitrogen | 61870 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D1408 | 10x is used |
| Water | Sigma-Aldrich | W3500 | |
| Paraformaldehyde | Panreac Quimica, Spain | 141451 | 3% in PBS |
| Triton-X-100 | Euromedex | 2000-A | 0.5% final |
| Vanadyl ribonucleoside complex (VRC) | New England Biolabs, USA | S1402S | |
| Sodium dextran sulfate | Sigma-Aldrich | D8906 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | New England Biolabs, USA | B9001S | |
| Formamide | Sigma-Aldrich | 47671-1L-F | aliquots kept at -20°C |
| Illustra TempliPhi Kit Construct (Kit MDA) | Dutsher, France | 25-6400-80 | |
| Nick translation kit | Abbott, USA | 07J00-001 | |
| 20x SSC buffer concentrate | Sigma-Aldrich | S6639 | |
| Spectrum green dUTP | Abbott, USA | 02N32-050 | |
| Spectrum red dUTP | Abbott, USA | 02N34-050 | |
| Cy-5 dUTP | Dutsher, France | PA55022 | |
| Mouse Cot-1 DNA | Invitrogen | 18440016 | |
| DNA, MB grade | Invitrogen | Roche | DNA from fish sperm |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Sigma-Aldrich | D9564 | DAPI |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| p-phenylenediamine | Sigma-Aldrich | 695106 | |
| Centrifuge 5417R | Eppendorf, Germany | molecular biology grade | |
| Eppendorf concentrator plus | Eppendorf | ||
| Eppendorf Thermomixer comfort | Eppendorf | ||
| Liquiport Liquid pump | KNF Neuberger, Trenton, USA | ||
| Shake'N'Bake Hybridization oven | Boekel Scientific, USA | ||
| Cryostat | Leica | CM3050 | |
Riferimenti
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