ניתוח תעתיק ידי ינוקא RNA FISH של<em> In vivo</em> תאים ענקים Trophoblast או<em> במבחנה</em> לטווח קצר תרבויות של Ectoplacental Cone Explants
Summary
Trophoblast giant cells (TGCs) play a key role in the placenta to ensure a healthy pregnancy. We present a protocol for assessing the transcriptional status of genes in TGCs by nascent fluorescent in situ hybridization on cryostat sections of post-implantation embryos or short-term cultures of embryonic day 7 ectoplacental cones.
Abstract
השליה נובעת שושלת חוץ עוברית אחד, trophectoderm. בשנת הבלסטוציסט murine פרי-ההשתלה, תאים trophectoderm ציור קיר להתמיין לתאי ענק trophoblast העיקרי (TGCs) בעוד trophectoderm הקוטב שמעל מסת התאים הפנימית ממשיך להתרבות הבחנה מאוחר יותר לתוך TGCs משנית. TGCs לשחק תפקיד מפתח בפיתוח השליה חיוני הריון מוצלח. חקירת תקנת תעתיק של גנים ספציפיים במהלך הפיתוח לאחר השתלה יכולה לתת תובנה פיתוח TGCs. תאים של חרוט ectoplacental (EPC) מעוברים ב 7-7.5 ימים של ההיריון (E7-7.5), נגזר trophectoderm קוטב, להתמיין TGCs משנית 1. TGCs ניתן ללמוד באתרו, על סעיפי cryostat של עוברי E7 אם כי מספר TGCs נמוך מאוד בשלב זה. קיימות דרכים אחרות של ניתוח TGCs המשנית היא להשתמש לטווח קצר תרבויות של EPCs הפרט מעובר E7ים. אנו מציעים טכניקה לחקור את סטטוס התעתיק של גנים של עניין הוא in vivo ו במבחנה ברמת התא הבודד באמצעות ניאון הכלאה באתרו (RNA FISH) כדי לחזות תמלילי מתהווה. טכניקה זו מספקת הודעה ישירה של ביטוי גנים ומאפשרת הערכה על מצב כרומוזומליות של TGCs, אשר הוא תאי endoreplicating גדולים. אכן, תכונת מפתח של בידול הטרמינל של TGCs היא שהם לצאת ממעגל התא לעבור סבבים רבים של הגישה endoreplication.This ניתן ליישם כדי לזהות ביטוי של כל גן לידי ביטוי מתוך אוטוזומים ו / או כרומוזומי המין והוא יכול לספק מידע חשוב לתוך התפתחותי מנגנונים כמו גם מחלות השליה.
Introduction
תאים ענקים trophoblast יונקים (TGCs) מהווים מחסום בין רקמות אימהיות עובריות. הם לתווך השתלה ופלישה של conceptus לתוך הרחם ממלא תפקידים קריטיים בהתפתחות להיווצרות של השליה. הם מייצרים גורמי גדילה אחדים (ציטוקינים) והורמונים של המשפחה לקטוגן הפרולקטין / שלית הסטרואידים, הכרחית לצמיחה עוברית והישרדות. TGCs גדול, mononucleated ו polyploid תאים עם מחזור תא, endocycle, שמורכב לסירוגין שלבי S ו- G. ואכן, TGCs הוא endoreplicating תאים, מסוגלים לעבור סבבים רבים של סינתזת ה- DNA ללא כל חלוקה 2. על מנת לחקור את מצב תעתיק של גנים in vivo, ב TGCs לעומת סוגי תאים עובריים extraembryonic אחרים, FISH RNA המתהווה ניתן לבצע in vivo על סעיפים cryostat 3 בשלבים שלאחר ההשתלה ספציפיים. TGCs ניכרים בקלות על סעיפים בשל their גודל גדול ופעילות גן התעתיק שלהם ניתן להקליט אך מספרם בשלבים שלאחר השתלה מוקדם הוא נמוך. מיעוט TGCs על סעיפים עובריים E7, הוביל אותנו לבצע לטווח קצר תרבויות של רקמות trophectodermal עובריים להשיג TGCs הבדיל כדי ללמוד את הרגולציה של ביטוי גנים במהלך ההתפתחות trophectoderm. יתר על כן, על מנת להישאר פיסיולוגי ככל האפשר, שורות תאים הוקמו כלומר trophectoderm תאי גזע (TS) הם לא תמיד מתאימות לחקור דור מנגנוני התפתחותי של TGCs המשנית לספק כלי רב ערך כדי ללמוד הריונות פתולוגי קשורים לפגמי TGCs בשל גן נורמלי תקנה בעכברים.
תאים Trophoblast של חרוט ectoplacental (EPC) הם סימנים מקדימים של TGCs משנית 4. התמיינות ספונטנית של EPCs תרבותי משנית TGCs כבר בעבר דווח 5. עם זאת, בניגוד TGCs העיקרי, מחקרים על בידול משני TGCtiation נותר מוגבל, presumablydue לקשיים לבודדים explants EPC ללא כל רקמות של האם או עובר. מתאמנים שיטות אלה, על מנת לבצע FISH RNA על TGCs משנה מכחו מעובר פרט E7, שלב התפתחותי לאחר השתלה שבו TGCs מעט מאוד אבל יכול להיות שנוצר מבשרי EPC. FISH RNA לנתח תמלילים עיקריים גרעיניים מעולם לא נעשה ברמה ברמת התא הבודדה על TGCs המשנית. אופציה זו מאפשרת ניתוח מדויק של שעתוק שימש כדי להראות את חוסר היציבות אפיגנטיים של TGCs בשלבים שלאחר ההשתלה 3.
דוגמה קלאסית של אפיגנטיקה ביונקים, את איון כרומוזום X (xci) נלמדת במעבדה הרד 6. בתהליך זה אחד 2 הכרומוזומים X ב הנקבה מומת. המגזר השקלי הלא צמוד קידוד מעילים תמליל Xist כרומוזום X שממנו הוא בא לידי ביטוי בתאים נקבה ומפעיל השתקת ברוב הגנים. באמצעות FISH RNA,תמלילי מתהווה של גני X-linked יכולים להיחקר כפי שניתן את ההצטברות של Xist RNA על כרומוזום X הפעיל (Xi). אנו מתארים כאן הליך לבצע RNA FISH על סעיפים של עוברים לאחר ההשתלה ועל לטווח קצר תרבויות של EPC. פרוטוקול זה מותאם מאלה ששמשו ללמוד xci להבדיל מתאי גזע עובריים נשיים עוברת preimplantation 7-11. אנו מספקים דוגמאות של xci בעוברים נקבה in vivo, כמו גם במבחנה TGCs.
Protocol
Representative Results
Discussion
ינוקא RNA FISH מייצג שיטה קלה ורגישה לניתוח התא הבודד של פעילות תעתיק ברקמות עובריות בשלבי התפתחותיים שונים. כוחה של גישה זו הוא היכולת לזהות שושלות עובריות שונות בכל שלב מסוים על פי קריטריונים מורפולוגיים. עם זאת זה גם דורש כי קרינת רקע מינימאלית היא הווה. כל רקע כזה הופך את זיהוי של אזורים עובריים שונים סוגי תאים מאתגרים. כדי להבטיח רקע מינימלי, ישנם שני שלבים קריטיים בפרוטוקול זה. הראשון הוא איכות cryosection והשנייה הוא היעילות (יחס אות לרעש) של דג RNA, אשר תלוי ברמת ביטוי גנטי ואת האיכות של החללית. עבור אלה האחרונים, בדיקות ולכן נבחנים תמיד על תאים בתרבית על coverslips (תאי גזע עובריים או תאים סומטיים) לפני השימוש על סעיפים.
בפרוטוקול זה, אנו מספקים ה טכניקות דואר נדרשו לבצע ניתוח FISH RNA על TGCs משני סוגים שונים של הכנת מדגם (סעיפי cryostat ותרבויות עיקריות של explants העוברי). כזה ניתוח תא בודד מאפשר שינויים דינמיים בביטוי גנים בשלבים שלאחר השתלה שונות יוערכו.
השיטות אנו מתארים ליצור TGCs משנית (ב E7-7.5 בשלבים שלאחר ההשתלה) שימשו במעבדה שלנו לחקור את דפוסי איון כרומוזום X של השושלת חוץ עובריים אשר היוו של TGCs בשלבים שלאחר ההשתלה. פיתוח חוץ עוברי במכרסמים תלוי הבידול של TGCs. ואכן, TGCs חיוני שליה ולכן התפתחות עוברית. פגמי בידול TGC לגרום הקטלניות עובריות (לסקירה ראה התייחסות 15). פעילות תעתיק של TGCs באמצעות RNA FISH מותר לנו להפגין מעמד איון חריג כרומוזום X של תאים מסוג כזה במהלך העכבר פיתוח 3.
<p class = "jove_content"> השיטות שהוצגו כאן כדי לקבל וללמוד TGCs משנית ניתן להחיל ללמוד מסלולים מולקולריים בפיתוח של רקמות חוץ עובריים הם חשובים חלק, הן בעכברים נורמליים מוטציה. גישות אלה יכולים להיות מותאמים לחקור פיתוח TGC ביונקים אחרים. הניתוח שלנו מעורבים השימוש של עוברי עכברים סוג בר המאפשר לנו להעריך את פעילות תעתיק של גנים שונים in vivo TGCs וב TGCs במבחנה נגזר explant EPC. שיטה זו יכולה להתארך עד הניתוח של עכברים מהונדסים ו / או על ידי התוספת של מולקולות מעכבות במדיום התרבות. השתמשנו בהצלחה בשיטה זו של RNA FISH על סוג אחר של TGCs, כגון TGCs העיקרי אשר מופיע בשלב מוקדם יותר של התפתחות עכבר, blastocyts E3.0, אשר יכול להיות בנפרד בתרבית למשך 4-5 ימים במהלך שפתחו תולדה, את ICM להיות מוקף TGCs העיקרית הגדולה 16,17. תמלילי המתהווה עבור שונהגנים וכן Xist יכול להיות דמיינו לכמת באמצעות הגישה FISH אותו RNA 3.Immunofluorescence משולב ו- RNA FISH יכול להתבצע גם על סעיפים cryostat וכן TGCs בתרבית במבחנה 3. מכך ניתן להסיק כי השיטה היא די חזקה, כמו תמלילי העיקריים הם רגישים מאוד שפל ויש דרישה מוחלטת של תרכובות חינם RNase. IF / RNA FISH מספק מידע נוסף על רמות שעתוק, לוקליזציה הסלולר ביטוי חלבון, בו זמנית בתא נתון. אמנם, קטעי רקמה פרפין מוטבע בעבר שימשו כדי לזהות RNA המתהווה בגידולים אנושיים תוך שמירה על מורפולוגיה רקמות 18, בידינו, סעיפים cryostat מתאימים כפולה ומכופלת לשמר הן את RNA המתהווה ואת אפיטופים נדרש לגילוי על ידי נוגדנים במהלך immunofluorescence .
בנוסף RNA FISH, בעקבות immunofluorescence, כרומוזומליות DNA FISH יכול להתבצע גם על TGCs משנית באמצעות בדיקות שכותרתו עם fluorochromes, בדומה לאלה המשמשים RNA FISH 3. בדיקות ניאון יכול להיות פלסמידים / fosmids או BACS, שכותרתו עם dUTPs פלורסנט כפי שמוצג כאן, ותיאר Chaumeil et al., 8. לחלופין, oligonucleotides שכותרתו fluorescently יכול לשמש 19. מאז DNA FISH אינו מחייב גדיל-סגולי, בדיקות oligonucleotide יכולה להיות מתוכננות למקד אחד משני הגדילים משלימים באזור היעד. בדיקות דנ"א מסועפים, שבו הגברת אות מושגת על ידי שני סיבובים רציפים של בדיקות ספציפיות ומגבר יכולות לשמש גם כדי לשפר את יחס אות לרעש של אותות FISH 20. לחלופין, בדיקות RNA כגון riboprobes יכולות לשמש אם כי בדיקות דנ"א שלנו להבטיח תחלופה טובה יותר בין איכות אות, סגולי וקל שימוש.
לבסוף, acquisiti תמונת 3Dעל חיונית על מנת להשיג את המידע המרחבי הנדרש תאים גדולים אלה, והוא יכול להתבצע באמצעות מגוון של מיקרוסקופים הקרינה, כגון המיקרוסקופ Apotome, או מיקרוסקופים epifluorescence עם deconvolution כגון DeltaVision (geh), או מיקרוסקופים אחרים מתאימים עבור סעיפי רקמות הדמיה, וגדולים (> 20 מיקרומטר) TGCs. יצוין כי עבור לוקוסים דנ"א עותק יחיד, האות punctate זוהה על ידי FISH RNA המתהווה או FISH DNA לא יזוהו בקלות על ידי מיקרוסקופיה confocal.
לסיכום, השיטות המתואר כאן צריכות להיות שימושיות הן עבור הניתוח המפורט של TGS בהקשר התפתחותי, אלא גם במצבי מחלה אחרים. גנים רבים שמעורבים בפיתוח TGC ותפקוד במכרסמים שמורים בין מכרסמים ובני האדם, כגון גורמי תעתוק, פרוטאזות ומולקולות הידבקות תא 21. עכבר TGCs הוא מודל תא עבור גנים לומדים מווסתי התפתחות שליהד ולכן לתת תובנה מחלות שליה אנושיות. יתר על כן, בשל העובדה כי תאים אלה הם endoreplicating ומאז כמה תאים סרטניים לעסוק תוכניות endocycle, בנוסף לתהליכי הגברת גן, השיטות אנו מתארים צריכות גם להיות מועילות בחקירות תא בודדות נדרשו לחקור מנגנונים מובילים הגנום חוסר יציבות בתאי סרטן .
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים סוף Gournet לעזרה עם איורים, גולות Chaumeil לקריאת כתב היד, מתקן דיור חיה ואת פלטפורמת ההדמיה של היחידה. עבודה זו קיבלה תמיכה במסגרת תוכנית «Investissements d'Avenir» שהושק על ידי ממשלת צרפת ויושמו על ידי ANR עם אזכור ANR-10-LABX-0044 ו PSL ANR-10-IDEX-0001-02, את לא EpiGeneSys FP7. 257,082 רשת של אקסלנס EH, חוקר מתקדם ERC הפרס לא. 250,367 והאיחוד האירופי FP7 SYBOSS להעניק אין. 242,129 ל EH המחברים מבקשים להודות פלטפורמת הדמיה תאים ורקמות של גנטיקה מהמחלקה לביולוגיה התפתחותית (UMR3215 / U934) של קירי Institut, חבר צרפת-bioimaging (ANR-10-InSb-04), עזרה עם אור מיקרוסקופיה.
Materials
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ 1500 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi SV6 | |
| Scissors Pascheff-Wolff | Moria | MC19 | |
| Dumont #5 forceps | Roth | PK78.1 | |
| 4-well tissue culture dishes | Nunc | 176740 | |
| 60 mm Petri dishes Falcon | Dutsher, France | 353004 | |
| 100 mm Petri dishes Falcon | Dutsher, France | 353003 | |
| Coverslips 18×18 | VWR | 631-1331 | |
| Coverslips 22×22 | VWR | 631-0125 | |
| 12 mm glass round coverslips | Harvard apparatus | 64-0712 | |
| Slides Superfrost plus | VWR | 631-9483 | |
| 4-slide Transport box Lockmailer | Dutsher, France | 40684 | |
| Cryotubes 1.8 ml Corning | Fisher Science | 10418571 | |
| Glass Coplin staining jars | Fischer Scientific | W1561L | |
| TissueTek O.C.T compound | VWR | 4583 | |
| RPMI 1640 medium | Invitrogen | 61870 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D1408 | 10x is used |
| Water | Sigma-Aldrich | W3500 | |
| Paraformaldehyde | Panreac Quimica, Spain | 141451 | 3% in PBS |
| Triton-X-100 | Euromedex | 2000-A | 0.5% final |
| Vanadyl ribonucleoside complex (VRC) | New England Biolabs, USA | S1402S | |
| Sodium dextran sulfate | Sigma-Aldrich | D8906 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | New England Biolabs, USA | B9001S | |
| Formamide | Sigma-Aldrich | 47671-1L-F | aliquots kept at -20°C |
| Illustra TempliPhi Kit Construct (Kit MDA) | Dutsher, France | 25-6400-80 | |
| Nick translation kit | Abbott, USA | 07J00-001 | |
| 20x SSC buffer concentrate | Sigma-Aldrich | S6639 | |
| Spectrum green dUTP | Abbott, USA | 02N32-050 | |
| Spectrum red dUTP | Abbott, USA | 02N34-050 | |
| Cy-5 dUTP | Dutsher, France | PA55022 | |
| Mouse Cot-1 DNA | Invitrogen | 18440016 | |
| DNA, MB grade | Invitrogen | Roche | DNA from fish sperm |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Sigma-Aldrich | D9564 | DAPI |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| p-phenylenediamine | Sigma-Aldrich | 695106 | |
| Centrifuge 5417R | Eppendorf, Germany | molecular biology grade | |
| Eppendorf concentrator plus | Eppendorf | ||
| Eppendorf Thermomixer comfort | Eppendorf | ||
| Liquiport Liquid pump | KNF Neuberger, Trenton, USA | ||
| Shake'N'Bake Hybridization oven | Boekel Scientific, USA | ||
| Cryostat | Leica | CM3050 | |
Riferimenti
- Cross, J. C. Genetic insights into trophoblast differentiation and placental morphogenesis. Sem. Cell Dev. Biol. 11, 105-113 (2000).
- Zybina, E. V., Zybina, T. G. Polytene chromosomes in mammalian cells. Int. Rev. Cytol. 165, 53-119 (1996).
- Corbel, C., Diabangouaya, P., Gendrel, A. -. V., Chow, J. C., Heard, E. Unusual chromatin status and organization of the inactive X chromosome in murine trophoblast giant cells. Development. 140, 861-887 (2013).
- Rossant, J., Tamura-Lis, W. Effect of culture conditions on diploid to giant-cell transformation in postimplantation mouse trophoblast. J. Embryol. Exp. Morphol. 62, 217-227 (1981).
- El-Hashash, A. H., Kimber, S. J. Trophoblast differentiation in vitro: establishment and characterization of a serum-free culture model for murine secondary trophoblast giant cells. Reproduction. 128, 53-71 (2004).
- Chow, J. C., Heard, E. X inactivation and the complexities of silencing a sex chromosome. Curr Opin Cell Biol. 3, 359-366 (2009).
- Chaumeil, J., Okamoto, I., Heard, E. X-chromosome inactivation in mouse embryonic stem cells: analysis of histone modifications and transcriptional activity using immunofluorescence and FISH. Methods Enzymol. 376, 405-419 (2004).
- Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation. Methods Mol. Biol. 463, 297-308 (2008).
- Okamoto, I., Otto, A. P., Allis, C. D., Reinberg, D., Heard, E. Epigenetic dynamics of imprinted XCI during early mouse development. Science. 303, 644-664 (2004).
- Okamoto, I., Arnaud, D., Le Baccon, P., Otte, A. P., Disteche, C. M., Avner, P., Heard, E. Evidence for de novo imprinted X-chromosome inactivation independent of meiotic inactivation in mice. Nature. 438, 369-373 (2005).
- Patrat, C., Okamoto, I., Diabangouaya, P., Vialon, V., Le Baccon, P., Chow, J., Heard, E. Dynamic changes in paternal X-chromosome activity during imprinted X-chromosome inactivation in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. 106, 5198-5203 (2009).
- Geijsen Shea, K., N, Dissection of 6.5 dpc mouse embryos. J. Vis. Exp. (2), e160 (2007).
- Pollex, T., Piolot, T., Heard, E. Live-cell imaging combined with immunofluorescence, RNA, or DNA FISH to study the nuclear dynamics and expression of the X-inactivation center. Methods Mol. Biol. 1042, 13-31 (2013).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9, 671-675 (2012).
- Hemberger, M. IFPA award in placentology lecture – characteristics and significance of trophoblast giant cells. Placenta. 29, 4-9 (2008).
- Carney, E. W., Prideaux, V., Lye, S. J., Rossant, J. Progressive expression of trophoblast-specific genes during formation of mouse trophoblast giant cells in vitro. Mol. Reprod. Dev. 34, 357-368 (1993).
- Shin, J., et al. Maternal Rnf12/RLIM is required for imprinted X-chromosome inactivation in mice. Nature. 467, 977-981 (2010).
- Capodieci, P., Donovan, M., Buchinsky, H., Jeffers, Y., Cordon-Cardo, C., Gerald, W., Edelson, J., Shenoy, S. M., Singer, R. H. Gene expression profiling in single cells within tissue. Nat Methods. 9, 663-665 (2005).
- Beliveau, B. J., Joyce, E. F., Apostolopoulos, N., Yilmaz, F., Fonseka, C. Y., McCole, R. B., Chang, Y., Li, J. B., Senaratne, T. N., Williams, B. R., et al. Versatile design and synthesis platform for visualizing genomes with Oligopaint FISH probes. Proc. Natl. Acad. Sci. 109, 21301-21306 (2012).
- Kenny, D., Shen, L., Kolberg, J. A. Detection of viral infection and gene expression in clinical tissue specimens using branched DNA (bDNA) in situ hybridization. J. Histochem. Cytochem. 50, 1219-1227 (2002).
- Cross, J. C., Baczyk, D., Hemberger, M., Hugues, M., Simmons, D. G., Yamamoto, H., Kingdom, J. C. Genes, development and evolution of the placenta. Placenta. 24, 123-130 (2003).
