Transcriptionele Analyse van ontluikende RNA FISH van<em> In Vivo</em> Trofoblast Giant Cells of<em> In Vitro</em> Korte termijn culturen van Ectoplacental Cone Explantaten
Summary
Trophoblast giant cells (TGCs) play a key role in the placenta to ensure a healthy pregnancy. We present a protocol for assessing the transcriptional status of genes in TGCs by nascent fluorescent in situ hybridization on cryostat sections of post-implantation embryos or short-term cultures of embryonic day 7 ectoplacental cones.
Abstract
De placenta afgeleid van een extra-embryonale afstammingslijn, de trophectoderm. In de peri-implantatie muizen blastocyst, muurschildering trophectoderm cellen differentiëren in primaire trophoblast giant cellen (TGCs), terwijl de polaire trophectoderm bovenop de binnenste celmassa blijft woekeren later differentiëren tot secundaire TGCs. TGCs spelen een sleutelrol in de placenta en zijn essentieel voor een succesvolle zwangerschap. Onderzoek van transcriptionele regulatie van specifieke genen tijdens post-implantatie ontwikkeling kan inzichten in TGCs ontwikkeling. Cellen van de ectoplacental conus (EPC) van embryo's in 7-7.5 dagen dracht (E7-7.5), afgeleid van het polaire trophectoderm, differentiëren tot secundaire TGCs 1. TGCs kunnen worden bestudeerd in situ op vriescoupes van embryo's in E7 hoewel het aantal TGCs zeer laag in dit stadium. Een alternatief middel van het analyseren van secundaire TGCs is om op korte termijn culturen van individuele EPC's te gebruiken van E7 embryos. Wij stellen een techniek om de transcriptionele status van genen van belang zowel in vivo en in vitro bij de enkele-celniveau via fluorescentie in situ hybridisatie (FISH RNA) op beginnende transcripten visualiseren onderzoeken. Deze techniek biedt een directe uitlezing van genexpressie en maakt de beoordeling van de chromosomale status van TGCs die groot endoreplicating cellen. Inderdaad, een belangrijk kenmerk van terminale differentiatie van TGCs is dat ze de celcyclus verlaten en ondergaat meerdere ronden van endoreplication.This benadering kan worden toegepast om expressie van elk gen tot expressie gebracht uit autosomen en / of geslachtschromosomen detecteren en kan belangrijke informatie verschaffen aan ontwikkelings- mechanismen en placenta ziekten.
Introduction
Zoogdiercellen trophoblast giant cellen (TGCs) vormen een barrière tussen moeder en embryonale weefsels. Zij bemiddelen implantatie en invasie van de conceptie in de baarmoeder en spelen cruciale rol in de ontwikkeling voor de vorming van de placenta. Ze produceren een aantal groeifactoren (cytokinen) en hormonen van de familie en steroïden prolactine / placenta lactogeen, noodzakelijk voor de embryonale groei en overleving. TGCs zijn groot, mononucleaire en polyploïde cellen met een celcyclus, de endocycle, die bestaat uit afwisselende S- en G fasen. Inderdaad, TGCs worden endoreplicating cellen, in staat om meerdere rondes van DNA-synthese te ondergaan zonder enige divisie 2. Om de transcriptionele status van genen in vivo, in vergelijking met andere TGCs embryonale en extra-embryonale celtypen te onderzoeken, kunnen ontluikende RNA FISH in vivo worden uitgevoerd op vriescoupes 3 op specifieke post-implantatie fase. TGCs zijn gemakkelijk te herkennen op de afdelingen als gevolg van their grote omvang en hun transcriptie activiteit van genen kan worden opgenomen maar hun aantal in de vroege post-implantatie fase is laag. Gebrek aan TGCs op E7 embryonale secties, leidde ons naar de korte termijn culturen van embryonale trophectodermal weefsels uit te voeren om gedifferentieerde TGCs met het oog op de regulering van de genexpressie tijdens trophectoderm ontwikkeling te bestuderen verkrijgen. Bovendien, om zo fysiologische mogelijk blijven gevestigde cellijnen dwz trophectoderm stamcellen (TS) zijn niet altijd geschikt om te onderzoeken ontwikkelingsmechanismen genereren van secundaire TGCs een waardevol hulpmiddel pathologische zwangerschappen geassocieerd met defecten in TGCs gevolg van abnormale gen bestuderen regulering in muizen.
Trofoblast cellen van de ectoplacental kegel (EPC) zijn voorlopers van secundaire TGCs 4. Spontane differentiatie van gekweekte EPC secundaire TGCs eerder gemeld 5. In tegenstelling tot primaire TGCs, studies op secundaire TGC Gesplitstetiatie zijn beperkt gebleven, presumablydue om de problemen van het isoleren van EPC explantaten vrij van de moeder of de embryonale weefsels. Passen wij deze werkwijzen om RNA FISH voeren op secundaire TGCs afgeleid uit de individuele embryo E7, een ontwikkelings post-implantatie fase waarin TGCs zeer weinig maar kan worden gegenereerd uit EPC precursors. RNA FISH nucleaire primaire transcripten te analyseren is nog nooit gedaan op het niveau van de enkele cel niveau op secundaire TGCs. Dit maakt nauwkeurige analyse van transcriptie en werd gebruikt om de epigenetische instabiliteit van TGCs op post-implantatie fase 3 tonen.
Een klassiek voorbeeld van de epigenetica bij zoogdieren, wordt het X-chromosoom inactivatie (XCI) studeerde in de Heard lab 6. In dit proces een van de 2 X-chromosomen in vrouwelijke geïnactiveerd. De niet-coderende Xist transcript bedekt de X-chromosoom waarvan het tot expressie wordt gebracht in vrouwelijke cellen en triggers silencing van de meeste genen. Met behulp van RNA FISH,ontluikende transcripten van X-gebonden genen worden onderzocht evenals de accumulatie van Xist RNA op het inactieve X-chromosoom (Xi). We beschrijven hier een procedure voor RNA FISH voeren op secties van post-implantatie embryo's en op korte termijn culturen van EPC. Dit protocol aangepast van die die werden gebruikt om XCI bestuderen differentiatie vrouwelijke embryonale stamcellen en pre-implantatie embryo's 7-11. Wij voorbeelden van XCI bij vrouwelijke embryo's in vivo en in vitro TGCs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ontluikende RNA FISH staat voor een eenvoudige en gevoelige methode voor de single cell analyse van de transcriptie-activiteit in embryonale weefsels in verschillende ontwikkelingsstadia. De kracht van deze aanpak is de mogelijkheid om verschillende embryonale lijnen identificeren enig stadium volgens morfologische criteria. Maar dit vereist ook dat minimale achtergrondfluorescentie aanwezig is. Een dergelijke achtergrond maakt de identificatie van de verschillende regio's en embryonale celtypen uitdagend. Om een minimale achtergrond te garanderen, zijn er twee belangrijke stappen in dit protocol. De eerste is de kwaliteit van de cryosectie en de tweede is de efficiëntie (signaal-ruisverhouding) van de RNA FISH, die afhangt van het niveau van genexpressie en de kwaliteit van de probe. Voor laatstgenoemde probes zijn dus altijd getest op gekweekte cellen op dekglaasjes (embryonale stamcellen of somatische cellen) voor gebruik op trajecten.
In dit protocol, bieden we the technieken vereist om RNA FISH analyse uitvoeren op TGCs uit twee verschillende soorten monstervoorbereiding (cryostaat secties en primaire, embryonale explantaten). Dergelijke single cell analyse stelt dynamische veranderingen in genexpressie bij verschillende post-implantatie etappes worden beoordeeld.
De werkwijzen beschrijven we naar secundair TGCs genereren (bij E7-7.5 post-implantatie fase) werden in ons laboratorium aan de X-chromosoom inactivatie patronen van een extra-embryonale stam die wordt gevormd door TGCs op post-implantatie fase bestuderen. Extra-embryonale ontwikkeling bij knaagdieren afhankelijk van de differentiatie van TGCs. Inderdaad, TGCs essentieel voor placenta en dus embryonale ontwikkeling. Defecten in TGC differentiatie leiden tot embryonale sterfte (voor een overzicht zie referentie 15). Transcriptie-activiteit van TGCs gebruik van RNA FISH liet ons toe om een ongebruikelijke X-chromosoom inactivatie status van een dergelijk celtype tijdens de ontwikkeling van de muis 3 demonstreren.
<p class = "jove_content"> De hier gepresenteerde verkrijgen en bestuderen secundaire TGCs werkwijzen kunnen worden toegepast om moleculaire pathways bestuderen ontwikkeling van belangrijke extra-embryonale weefsels zij deel uitmaken van, zowel in normale en mutante muizen. Deze benaderingen kunnen worden aangepast om te onderzoeken TGC ontwikkeling op andere zoogdieren. Onze analyse betrof het gebruik van wildtype muizenembryo's zodat we de transcriptionele activiteit van verschillende genen beoordelen in vivo TGCs en in vitro TGCs afgeleid van EPC explantaat. Deze werkwijze kan worden uitgebreid tot de analyse van transgene muizen en / of door toevoeging van remmer moleculen in het kweekmedium. We hebben met succes gebruik gemaakt van deze methode RNA FISH op een ander type TGCs, zoals primaire TGCs die in een eerder stadium van ontwikkeling van de muis, E3.0 blastocyts verschijnen die afzonderlijk gekweekt gedurende 4-5 dagen waarin uitgroei ontwikkeld, kan de ICM wordt omringd door grote primaire TGCs 16,17. Ontluikende transcripten voor verschillendegenen en Xist kon worden gevisualiseerd en gekwantificeerd met dezelfde RNA FISH benadering 3.Gecombineerde immunofluorescentie en RNA FISH kunnen ook worden uitgevoerd op vriescoupes en in vitro gekweekt TGCs 3. Dit demonstreert dat de werkwijze is zeer robuust, primaire transcripten zijn zeer gevoelig voor afbraak en er is een absolute vereiste RNase vrije verbindingen. IF / RNA FISH biedt extra informatie over de transcriptie niveaus, cellulaire lokalisatie en eiwit expressie, tegelijkertijd in een bepaalde cel. Hoewel secties van in paraffine ingebed weefsel zijn eerder gebruikt om ontluikende RNA in humane tumoren te detecteren behoud weefselmorfologie 18, in onze handen, cryostaat secties zijn geschikt voor instandhouding van zowel het ontluikende RNA en de epitopen vereist voor detectie van antilichamen in immunofluorescentie .
Naast RNA FISH na immunofluorescence chromosomaal DNA FISH kunnen ook worden uitgevoerd op secundaire TGCs gebruik probes gelabeld met fluorochromen, vergelijkbaar met die voor RNA FISH 3. Fluorescerende probes kunnen ofwel plasmiden / fosmids of BAC, gelabeld met fluorescente dUTPs zoals hier gebruikt en in Chaumeil et al., 8 beschreven. Alternatief kan fluorescent gelabelde oligonucleotiden worden 19. Aangezien DNA-streng FISH-specificiteit vereist, kunnen oligonucleotideprobes ontworpen op een van de twee complementaire strengen richten in het doelgebied. Vertakt DNA probes, waarbij signaalamplificatie wordt bereikt door twee opeenvolgende ronden van specifieke probes en versterker kan ook worden gebruikt om de signaal-ruisverhouding FISH signalen 20 versterken. Als alternatief kunnen RNA-probes zoals riboprobes gebruikt worden, hoewel onze DNA-probes garandeert een betere afweging tussen signaalkwaliteit, specificiteit en gebruiksgemak.
Tot slot, 3D-beeld acquisition is essentieel om de vereiste ruimtelijke informatie in deze grote cellen te verkrijgen, en kan worden uitgevoerd met verschillende fluorescentie microscopen, zoals apotome microscoop of epifluorescentie microscopen met deconvolutie zoals DeltaVision (GEH) of andere microscopen geschikt voor beeldvorming weefselcoupes en grote (> 20 urn) TGCs. Opgemerkt wordt dat enkele kopie DNA loci, de gestippelde gedetecteerd door FISH ontluikende RNA of DNA FISH kunnen niet gemakkelijk worden gedetecteerd door confocale microscopie.
Tot slot zou de werkwijzen hier beschreven bruikbaar voor zowel de gedetailleerde analyse van TGS in een ontwikkelingscontext, maar ook in andere situaties ziekte. Vele genen die betrokken zijn bij TGC ontwikkeling en functie bij knaagdieren zijn geconserveerd tussen knaagdieren en mensen, zoals transcriptiefactoren, proteasen en celadhesiemoleculen 21. Mouse TGCs zijn een cel model voor het bestuderen van genen die de ontwikkeling van de placenta een regulerend inzichten in de menselijke placenta ziekten geven dus. Verder komt door het feit dat deze cellen endoreplicating en omdat sommige kankercellen aangrijpen endocycle's, naast genamplificatie werkwijzen omvatten de werkwijzen beschrijven we ook nuttige eencellige onderzoeken moeten mechanismen die leiden tot instabiliteit van kankercellen genome verkennen .
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Sophie gournet voor hulp met illustraties, Julie Chaumeil voor het lezen van het manuscript, de stalruimte faciliteit en de imaging platform van de Unit. Dit werk heeft steun ontvangen in het kader van het programma «Investissements d'Avenir» gelanceerd door de Franse regering en uitgevoerd door ANR met de verwijzingen ANR-10-LABX-0044 en ANR-10-IDEX-0001-02 PSL, de EpiGeneSys KP7 geen. 257.082 Network of Excellence tot EH, een ERC Advanced Investigator Award nee. 250.367 en EU FP7 SYBOSS verlenen geen. 242.129 tot EH De auteurs willen graag de Cell en Tissue Imaging Platform van de Genetica en Developmental Biology Department (UMR3215 / U934) van het Institut Curie, lid van France-Bio-imaging (ANR-10-InSb-04), erkent voor hulp met licht microscopie.
Materials
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ 1500 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi SV6 | |
| Scissors Pascheff-Wolff | Moria | MC19 | |
| Dumont #5 forceps | Roth | PK78.1 | |
| 4-well tissue culture dishes | Nunc | 176740 | |
| 60 mm Petri dishes Falcon | Dutsher, France | 353004 | |
| 100 mm Petri dishes Falcon | Dutsher, France | 353003 | |
| Coverslips 18×18 | VWR | 631-1331 | |
| Coverslips 22×22 | VWR | 631-0125 | |
| 12 mm glass round coverslips | Harvard apparatus | 64-0712 | |
| Slides Superfrost plus | VWR | 631-9483 | |
| 4-slide Transport box Lockmailer | Dutsher, France | 40684 | |
| Cryotubes 1.8 ml Corning | Fisher Science | 10418571 | |
| Glass Coplin staining jars | Fischer Scientific | W1561L | |
| TissueTek O.C.T compound | VWR | 4583 | |
| RPMI 1640 medium | Invitrogen | 61870 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D1408 | 10x is used |
| Water | Sigma-Aldrich | W3500 | |
| Paraformaldehyde | Panreac Quimica, Spain | 141451 | 3% in PBS |
| Triton-X-100 | Euromedex | 2000-A | 0.5% final |
| Vanadyl ribonucleoside complex (VRC) | New England Biolabs, USA | S1402S | |
| Sodium dextran sulfate | Sigma-Aldrich | D8906 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | New England Biolabs, USA | B9001S | |
| Formamide | Sigma-Aldrich | 47671-1L-F | aliquots kept at -20°C |
| Illustra TempliPhi Kit Construct (Kit MDA) | Dutsher, France | 25-6400-80 | |
| Nick translation kit | Abbott, USA | 07J00-001 | |
| 20x SSC buffer concentrate | Sigma-Aldrich | S6639 | |
| Spectrum green dUTP | Abbott, USA | 02N32-050 | |
| Spectrum red dUTP | Abbott, USA | 02N34-050 | |
| Cy-5 dUTP | Dutsher, France | PA55022 | |
| Mouse Cot-1 DNA | Invitrogen | 18440016 | |
| DNA, MB grade | Invitrogen | Roche | DNA from fish sperm |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Sigma-Aldrich | D9564 | DAPI |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| p-phenylenediamine | Sigma-Aldrich | 695106 | |
| Centrifuge 5417R | Eppendorf, Germany | molecular biology grade | |
| Eppendorf concentrator plus | Eppendorf | ||
| Eppendorf Thermomixer comfort | Eppendorf | ||
| Liquiport Liquid pump | KNF Neuberger, Trenton, USA | ||
| Shake'N'Bake Hybridization oven | Boekel Scientific, USA | ||
| Cryostat | Leica | CM3050 | |
Riferimenti
- Cross, J. C. Genetic insights into trophoblast differentiation and placental morphogenesis. Sem. Cell Dev. Biol. 11, 105-113 (2000).
- Zybina, E. V., Zybina, T. G. Polytene chromosomes in mammalian cells. Int. Rev. Cytol. 165, 53-119 (1996).
- Corbel, C., Diabangouaya, P., Gendrel, A. -. V., Chow, J. C., Heard, E. Unusual chromatin status and organization of the inactive X chromosome in murine trophoblast giant cells. Development. 140, 861-887 (2013).
- Rossant, J., Tamura-Lis, W. Effect of culture conditions on diploid to giant-cell transformation in postimplantation mouse trophoblast. J. Embryol. Exp. Morphol. 62, 217-227 (1981).
- El-Hashash, A. H., Kimber, S. J. Trophoblast differentiation in vitro: establishment and characterization of a serum-free culture model for murine secondary trophoblast giant cells. Reproduction. 128, 53-71 (2004).
- Chow, J. C., Heard, E. X inactivation and the complexities of silencing a sex chromosome. Curr Opin Cell Biol. 3, 359-366 (2009).
- Chaumeil, J., Okamoto, I., Heard, E. X-chromosome inactivation in mouse embryonic stem cells: analysis of histone modifications and transcriptional activity using immunofluorescence and FISH. Methods Enzymol. 376, 405-419 (2004).
- Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation. Methods Mol. Biol. 463, 297-308 (2008).
- Okamoto, I., Otto, A. P., Allis, C. D., Reinberg, D., Heard, E. Epigenetic dynamics of imprinted XCI during early mouse development. Science. 303, 644-664 (2004).
- Okamoto, I., Arnaud, D., Le Baccon, P., Otte, A. P., Disteche, C. M., Avner, P., Heard, E. Evidence for de novo imprinted X-chromosome inactivation independent of meiotic inactivation in mice. Nature. 438, 369-373 (2005).
- Patrat, C., Okamoto, I., Diabangouaya, P., Vialon, V., Le Baccon, P., Chow, J., Heard, E. Dynamic changes in paternal X-chromosome activity during imprinted X-chromosome inactivation in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. 106, 5198-5203 (2009).
- Geijsen Shea, K., N, Dissection of 6.5 dpc mouse embryos. J. Vis. Exp. (2), e160 (2007).
- Pollex, T., Piolot, T., Heard, E. Live-cell imaging combined with immunofluorescence, RNA, or DNA FISH to study the nuclear dynamics and expression of the X-inactivation center. Methods Mol. Biol. 1042, 13-31 (2013).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9, 671-675 (2012).
- Hemberger, M. IFPA award in placentology lecture – characteristics and significance of trophoblast giant cells. Placenta. 29, 4-9 (2008).
- Carney, E. W., Prideaux, V., Lye, S. J., Rossant, J. Progressive expression of trophoblast-specific genes during formation of mouse trophoblast giant cells in vitro. Mol. Reprod. Dev. 34, 357-368 (1993).
- Shin, J., et al. Maternal Rnf12/RLIM is required for imprinted X-chromosome inactivation in mice. Nature. 467, 977-981 (2010).
- Capodieci, P., Donovan, M., Buchinsky, H., Jeffers, Y., Cordon-Cardo, C., Gerald, W., Edelson, J., Shenoy, S. M., Singer, R. H. Gene expression profiling in single cells within tissue. Nat Methods. 9, 663-665 (2005).
- Beliveau, B. J., Joyce, E. F., Apostolopoulos, N., Yilmaz, F., Fonseka, C. Y., McCole, R. B., Chang, Y., Li, J. B., Senaratne, T. N., Williams, B. R., et al. Versatile design and synthesis platform for visualizing genomes with Oligopaint FISH probes. Proc. Natl. Acad. Sci. 109, 21301-21306 (2012).
- Kenny, D., Shen, L., Kolberg, J. A. Detection of viral infection and gene expression in clinical tissue specimens using branched DNA (bDNA) in situ hybridization. J. Histochem. Cytochem. 50, 1219-1227 (2002).
- Cross, J. C., Baczyk, D., Hemberger, M., Hugues, M., Simmons, D. G., Yamamoto, H., Kingdom, J. C. Genes, development and evolution of the placenta. Placenta. 24, 123-130 (2003).
