זיהוי תפוקה גבוהה של חיידקים פולימרים דוחה עבור אביזרים ומכשור רפואי
Summary
A high-throughput microarray method for the identification of polymers which reduce bacterial surface binding on medical devices is described.
Abstract
Medical devices are often associated with hospital-acquired infections, which place enormous strain on patients and the healthcare system as well as contributing to antimicrobial resistance. One possible avenue for the reduction of device-associated infections is the identification of bacteria-repellent polymer coatings for these devices, which would prevent bacterial binding at the initial attachment step. A method for the identification of such repellent polymers, based on the parallel screening of hundreds of polymers using a microarray, is described here. This high-throughput method resulted in the identification of a range of promising polymers that resisted binding of various clinically relevant bacterial species individually and also as multi-species communities. One polymer, PA13 (poly(methylmethacrylate-co-dimethylacrylamide)), demonstrated significant reduction in attachment of a number of hospital isolates when coated onto two commercially available central venous catheters. The method described could be applied to identify polymers for a wide range of applications in which modification of bacterial attachment is important.
Introduction
Microarrays פולימרים הם מיניאטורי פלטפורמות תפוקה גבוהה שבה עד 7,000 פולימרים 1 מודפסים על גבי שקופיות זכוכית עבור ניתוח מקביל עם תאים פרוקריוטים או איקריוטיים 2. השיטה המוצגת כאן בונה על מזו שתוארה לראשונה בשנת 2010 3. מערכת סינון זה הוחל על סוגי תאים רבים, כולל hepatocytes אדם 4, תאי גזע 5, לתאי האפיתל צינורי כליות 2, חיידקים 3,6 ופתוגנים protozoan 7. בכל מקרה, פולימרים מקדמים או להתנגד המחייב של התאים נחקרים זוהו 8. קומפלקסים של DNA עם פולימרים סינתטיים polycationic גם שימשו במתכונת microarray להקרנה תפוקה גבוהה של מועמדים transfection גן 9. וכן בדיקות סקר לאיתור אינטראקציות תא-מצע, microarrays הפולימר גם שמש להערכת תכונות חומר 10.
"> היכולת של פולימרים סינתטיים לווסת מצורף של חיידקים על משטח מעוגנת היטב 3,6,11. גורמים רבים כולל תשלום, הידרופוביות חספוס פני השטח של משטח פולימר ידועים בהשפעתם מחייב בקטריאלי. הגישות המקובלות של biomaterials גילוי אשר עמיד מחייב של חיידקים באמצעות ברצף או בעיצוב אמפירי ובדיקת חומר אחד בכל פעם הם עתירים עבודה, יקר ותהליכים זמן רב. microarrays הפולימר להציע חלופה אטרקטיבית עקיף מגבלות כאלה.משטח הקשורים החיידקים לגדול כאוכלוסייה מורכבת כינה ביופילם – biofilms כגון עמידות מאוד בפני לחצים ואנטיביוטיקה סביבתיים רבים. מדובר בין שאר בשל מטריקס הדחוסה (המורכבת של חלבונים, סוכרים וחומצות גרעין) 12 ובחלקה בשל הנוכחות המוגברת של חזקים "persistor" תאי biofilms 13. Althoאיכס המנגנון המדויק של עמותת משטח היווצרות ביופילם עוקבת קשה לאפיין, המקובל לחשוב כי ישנם שלושה שלבים שונים של התפתחות שטח 14 – 16. מצורף ראשונית, הפיך ואחריו הידבקות חזקה של תאים, הקמת biofilm ידי ייצור של חלבון תאי מטריקס פוליסכריד ובחלוקה של תאים. לבסוף, משחרר ביופילם בוגר ללא תאים חיים פלנקטוניים, אשר יכול ליזום זיהומים חדשים במקום אחר. חיידקים-בהדיפת פולימרים המונעים את הקובץ המצורף הראשונית של חיידקים, ולכן למנוע בשלבים המוקדמים של היווצרות ביופילם, פוטנציאל לייצג פתרון מעולה עבור צמצום זיהומים. נוכח העלייה של עמידות לאנטיביוטיקה (וגם ההתנגדות באופן מהותי יותר של חיידקים משטח הקשורים 12), אמצעי ללא אנטיביוטיקה של הפחתת זיהומים הם בעלי עניין מיוחד. בבית חולים, חיידקים בהדיפת פולימרציפוי יכול להיות יישום רפואי ישירות להפחתת זיהומים הנרכשים בבית חולים, המהווים בדרך כלל סביב התקנים מושתלים 17.
כאן, שיטת תפוקה גבוהה להקרנה של 381 פולימרים לפעילות דוחה נגד מגוון רחב של חיידקים פתוגניים הקשורים זיהומים הנרכשים בבית חולים, ואחריו אימות להיט וציפוי עתידי assay של חומרים קטטר מרכזיים ורידים, מתוארת (איור 1). בקצרה, פולימרים נראו על גבי שקופיות זכוכית מצופה agarose ידי הדפסה קשר, לאחר ייבוש ועיקור, מערכי מיניאטורי הודגרו עם תרבויות חיידקים חשיבות קלינית. לאחר הדגירה, microarrays נשטפו בעדינות תאי חיידקיים חסידים הוכתמו ו מדמיינים ידי קרינה. בהמשך לכך, פולימרים אשר עכבות חיידקי מחייב נחקרו בקנה מידה גדול יותר על ידי ציפוי על מכסה זכוכית תלוש ו מדמיינים ידי מיקרוסקופי אלקטרונים. להדוף נבחרפולימרים השאילו היו מצופים אז על צנתרים מסחריים כמפחיתים מצורפים של חיידקים על ידי כמעט 100 לקפל.
Protocol
Representative Results
Discussion
קובץ מצורף של חיידקים על משטח הוא תהליך מורכב נקבע על ידי מגוון רחב של גורמים תלויים המינים של חיידקים, את המאפיינים של פני השטח, סביב המדיום ואת הסביבה הפיסית. למרות קבוצות כימיות מסוימות ידועות בהשפעתם חיידקי מחייב (polyglycols, למשל, בדרך כלל להתנגד מצורף 11), שיוך ההשפעה הביולוגית של פולימרים עם המבנים הכימיים שלהם קשה, מה שהופך תכנון רציונלים של פולימרים עבור פונקציות ספציפיות מאתגרות. בהעדר מנגנונים מצורפים מפורטים, מחקרים אחרים ניסו לחקות משטחים דוחים טבעית המתחוללים, עם אופטימיזציה ממושך ונרחב מעבד 21. שיטת התפוקה גבוהה מיניאטורי שהוצגה כאן מתגברת על אתגרים אלה על ידי הקלת הקרנה מקבילה של מאה פולימרים לזהות מובילים למחקר נוסף.
תוצאות משיטת microarray לשרת בעיקר IDEntify המועמדים להוביל סביר. איור 2 מדגים 22 מועמדים עם נמוך מחייב של לפחות מין אחד, בעוד איור 3 מדגים את צמצום ברור מחייב יכולת. כל 22 הפולימרים הנמוכים מחייב שמוצגים באיור 2 נלקחו קדימה לתוך ניסויים מדרוגים כלפי מעלה, שבמהלכה את הטוב ביותר (מבחינת תכונות repellence וציפוי) נקבעו PU83, PA13, ו PA515 (איורים 4 ו -5). Polyacrylates מציע גמישות רבה יותר מבחינת שיטות פילמור ולכן polyacrylate הנמוך מחייב, PA13, נבחר ללימודי ציפוי קטטר (איורים 6 ו -7). עוד מפורטת עבודה נוספת על מועמדים אחרים בוצעה דווחה במקום אחר 6.
דרך מספר חזרות ניסיוני מצאנו מספר צעדים קלים היו מפתח להצלחה ואת השחזור. כמו גם להקל על ההידבקות שלפולימרים כדי שקופיות הזכוכית, באמצעות agarose תחת ציפוי מספק רקע נקי, כמו agarose הוא עמיד מאוד קולוניזציה חיידקית. כמו כן עקבי בפולימר כתם עצמם, הם בתוך אותו המערך בין מערכים, הוא חיוני ולכן בהדפסת המערכים חייבת להיות מבוקרת בקפידה. התאמה קפדנית של הפינים שבתוך-ראש ההדפסה וגם המילוי אחיד של הצלחת 384 גם נדרשת על מנת להבטיח תצפית אחידה. כפי שחלקכם של הפולימרים השתמשנו הציגה מידת autofluorescence, לקיחת נתוני קרינת רקע לכל שקופית לפני הדגירה עם חיידקים הייתה חיונית. כדי להסביר וריאציות להשיג משכפל נתונים חזקים של microarrays מומלץ.
הכתם מועסק כאן (DAPI) אין סלקטיביות עבור מינים של חיידקים, מחייב הלא ספציפית ל- DNA. לכן, טכניקה מזוהמת טובה חיונית פעם תרביות חיידקים הם הציגו כמזהמים עלולים נעלמו מעיניו, מבלבלות את interpretation של תוצאות. אותו הדבר נכון של ניסויים מאוחר באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק, ושזה רק ניתן להבחין מוטות Cocci אבל לא הסוג או המין.
לאחר סינון microarray, צריכים להיבחר פולימרים מבטיחים לתיקוף נוסף. בדוגמא המוצגת כאן, שבעה פולימרי עניין זוהו על ידי הירידה הברורה שלהם הקרינו על microarray והעיכוב של זיקתם אושר על ידי ציפוי אותם על שטחים גדולים יותר. איורי 4 ו -5 להראות הפחתת כריכת מושגת על coverslips זכוכית, אמצעים מעשיים כדי לבחון את התנהגותו של פולימרים ציפויים בתפזורת ולא כמו כתמים microarray. בהמשך לכך, פולימרים אלו צפים על מכשירים רפואיים לכמת הפחתה מלאה מצורף חיידקים. חשוב כי הממס נבחר (ראה פרוטוקול סעיף 8) ללימודי ציפוי אלה הוא שפיר למצע הרצוי (כאן, קטטר) תוך לשמרing יכולת לפזר את הפולימר של עניין, על מנת לאפשר ציפוי. הנה, השתמשנו אצטון אשר, כמו גם את המאפיינים שהוזכרו, יש נקודת רתיחה נמוכה מתאדה במהירות להשאיר ציפוי אחיד.
אמצעי אימות נבחר יהיה תלוי ביישום הספציפי הנלמד. כפי תצפית של תאים על ידי מיקרוסקופי אלקטרוני קרינה מאפשרת כימות ישירה של קובץ מצורף תא יחיד, בחרנו טכניקות אלה כהשלמה אל assay microarray מכתים בתפזורת. תוצאות מוצגים איורים 6 ו -7, שיש בהם כדי להעיד על החשיבות של שיטות אימות חינם. תמונות confocal באיור 6 לספק תמונות ברורות מאוד של תאים בודדים, בעוד SEM יש ערך המוסף של מאפשר הערכה של פני השטח של הפולימר, אשר הוא כאן חלק ואחידה. שיטות אלו מוגבלים על ידי שדה הראייה של מיקרוסקופים בשימוש, ולכן הוא importaNT לנקוט בשורה של תמונות כדי להיות בטוח בתוצאות. השיטה המתוארת לעיל לא יכול לכמת דבקות בקטריאלי על פני כל השטח, רק להסיק כיסוי ממספר אזורים קטנים. אנו מאמינים כי זה די בבקשה מתואר. צמצום בקטריאלי מחייב יכול להיות מוערך על ידי ספירת חיידקים דבק משטח על חתיכות קטטר כולו ובלי ציפויים בשיטות כמתואר במקום אחר 22. עם זאת שיטות כאלה דורשים המשטחים הביולוגיים הוקרנו יש שטח פנים אחיד, אשר קשה לשמור כאשר מבחנים מבוצעים עם מכשירים רפואיים, אשר לעתים קרובות יש גיאומטריה מורכבת.
ברור, כל תקן המיועד לשימוש קליני חייב לעבור בדיקות נוספות משמעותיות על מנת להבטיח בטיחות ויעילות בבני אדם. השיטה המוצגת כאן מייצגת את תחילת תהליך עבודה ובהמשך זה חייב לכלול אישור של פעילות in vivo. במקרה זה, לומד ג ורידיםatheters, עבודה ראשונית יכולה לחקור את הכריכה של מרכיבי דם ותאיים כולו הפולימר. השפעת מרכיבי דם על חיידקי מחייב צריך להיות גם נחשבת, ככל הנראה על ידי חזרה על המבחנים מחייבים בנוכחות סרום מומת או דה-fibrinated דם 23. המבחן האולטימטיבי של אותו הטכנולוגיה יהיה במודל in vivo כגון מודל זיהום תת עורי שתל 24.
אנו מדגימים את הפוטנציאל של שיטת microarray הפולימר להקרנה של פולימרי משטח-שינוי. פולימרים שכאלה (הן ההתנגדות וקידום חיידקי מחייב) יש מספר רב של יישומים ברפואה, בתעשיית המזון והביוטכנולוגיה, כלומר שיטה זו עשויה להיות שימושי בתחומים רבים של מחקר. למרות העבודה כאן משתמשת חיידקים, השיטה יכולה להיות מותאמת סוגי תאים אחרים וכמובן microarrays כימי אחר.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank EASTBIO (the East of Scotland BioScience Doctoral Training Partnership funded by the BBSRC) (S. V.) and the Medical Research Council (P.J.G) for funding.
Materials
| Agarose | Sigma | 05066 | |
| Silane-prep slides | Sigma | S4651 | |
| Polymers | Synthesised in-house | Not applicable | |
| NMP | Sigma | 494496 | |
| LB Broth | Oxoid | CM1018 | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| Tetrahydrofuran | Sigma | 401757 | |
| (3-aminopropyl) triethoxysilane coated glass slides | Sigma | Silane-prep | |
| Cacodylate buffer | Sigma | 97068 | |
| Catheter 1 | Arrow International | CS12123E | |
| Catheter 2 | Baxter Healthcare | ECS1320 | |
| Osmium tetroxide | Sigma | 201030 | |
| Equipment | |||
| Contact printer | Genetix | Qarraymini | |
| Microarray microscope | IMSTAR | Pathfinder | |
| Spin Coater | Speedline Technologies | 6708D | |
| Confocal microscope | Leica | SP5 | |
| Image analysis software | Media Cybernetics | Image-Pro Plus | |
| Scanning electron microscope | Philips | XL30CP | |
| Sputter coater | Bal-Tec | SCD050 |
Riferimenti
- Hansen, A., Mjoseng, H. K., et al. High-Density Polymer Microarrays: Identifying Synthetic Polymers that Control Human Embryonic Stem Cell Growth. Adv. Healthc. Mat. 3 (6), 848-853 (2014).
- Tourniaire, G., Collins, J., et al. Polymer microarrays for cellular adhesion. Chem. Commun. (20), 2118-2120 (2006).
- Pernagallo, S., Wu, M., Gallagher, M. P., Bradley, M. Colonising new frontiers-microarrays reveal biofilm modulating polymers. J. Mat. Chem. 21 (1), 96-101 (2010).
- Hay, D. C., Pernagallo, S., et al. Unbiased screening of polymer libraries to define novel substrates for functionala hepatocytes with inducible drug metabolism. Stem Cell Res. 6 (2), 92-102 (2011).
- Anderson, D. G., Levenberg, S., Langer, R. Nanoliter-scale synthesis of arrayed biomaterials and application to human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 22 (7), 863-866 (2004).
- Venkateswaran, S., Wu, M., et al. Bacteria repelling poly(methylmethacrylate-co-dimethylacrylamide) coatings for biomedical devices. J. Mat. Chem. B. 2 (39), 6723-6729 (2014).
- Pickering, H., Wu, M., Bradley, M., Bridle, H. Analysis of Giardia lamblia Interactions with Polymer Surfaces Using a Microarray Approach. Environ.l Sci. Technol. 46 (4), 2179-2186 (2012).
- Mizomoto, H. The Synthesis and Screening of Polymer Libraries using a High Throughput Approach. , (2004).
- How, S. E., Yingyongnarongkul, B., Fara, M. A., Díaz-Mochón, J. J., Mittoo, S., Bradley, M. Polyplexes and lipoplexes for mammalian gene delivery: from traditional to microarray screening. Comb. Chem. High Throughput Screen. 7 (5), 423-430 (2004).
- Thaburet, J. -. F., Mizomoto, H., Bradley, M. High-Throughput Evaluation of the Wettability of Polymer Libraries. Macromol. Rapid Commun. 25 (1), 366-370 (2004).
- Hook, A. L., Chang, C. -. Y., et al. Combinatorial discovery of polymers resistant to bacterial attachment. Nat. Biotechnol. 30 (9), 868-875 (2012).
- Hall-Stoodley, L., Stoodley, P. Evolving concepts in biofilm infections. Cell. Microbiol. 11 (7), 1034-1043 (2009).
- Lewis, K. Persister Cells. Ann. Rev. Microbiol. 64 (1), 357-372 (2010).
- Sauer, K., Camper, A. K., Ehrlich, G. D., Costerton, J. W., Davies, D. G. Pseudomonas aeruginosa Displays Multiple Phenotypes during Development as a Biofilm. J. Bacteriol. 184 (4), 1140-1154 (2002).
- Reisner, A., Haagensen, J. A. J., Schembri, M. A., Zechner, E. L., Molin, S. Development and maturation of Escherichia coli K-12 biofilms. Mol. Microbiol. 48 (4), 933-946 (2003).
- Watnick, P. I., Kolter, R. Steps in the development of a Vibrio cholerae El Tor biofilm. Mol. Microbiol. 34 (3), 586-595 (1999).
- Campoccia, D., Montanaro, L., Arciola, C. R. A review of the biomaterials technologies for infection-resistant surfaces. Biomaterials. 34 (34), 8533-8554 (2013).
- Imstar. . Pathfinder Technology for High Content Cellular Screening in Cell Biology and Genetoxicity Software version: 6.04I. , (2012).
- Williams, J. R., Clifford, A. A. . Supercritical Fluid Methods and Protocols. 13, (2000).
- Kuo, J. . Electron microscopy methods and protocols. , (2007).
- Leslie, D. C., Waterhouse, A., et al. A bioinspired omniphobic surface coating on medical devices prevents thrombosis and biofouling. Nat. Biotechnol. 32 (11), 1134-1140 (2014).
- Bechert, T., Steinrücke, P., Guggenbichler, J. P. A new method for screening anti-infective biomaterials. Nat. Med. 6 (9), 1053-1056 (2000).
- May, R. M., Magin, C. M., et al. An engineered micropattern to reduce bacterial colonization, platelet adhesion and fibrin sheath formation for improved biocompatibility of central venous catheters. Clin. Transl. Med. 4, (2015).
- Chen, R., Willcox, M. D. P., Ho, K. K. K., Smyth, D., Kumar, N. Antimicrobial peptide melimine coating for titanium and its in vivo antibacterial activity in rodent subcutaneous infection models. Biomaterials. 85, 142-151 (2016).
