Высокая пропускная способность идентификации бактерий репелленты Полимеры для медицинских приборов
Summary
A high-throughput microarray method for the identification of polymers which reduce bacterial surface binding on medical devices is described.
Abstract
Medical devices are often associated with hospital-acquired infections, which place enormous strain on patients and the healthcare system as well as contributing to antimicrobial resistance. One possible avenue for the reduction of device-associated infections is the identification of bacteria-repellent polymer coatings for these devices, which would prevent bacterial binding at the initial attachment step. A method for the identification of such repellent polymers, based on the parallel screening of hundreds of polymers using a microarray, is described here. This high-throughput method resulted in the identification of a range of promising polymers that resisted binding of various clinically relevant bacterial species individually and also as multi-species communities. One polymer, PA13 (poly(methylmethacrylate-co-dimethylacrylamide)), demonstrated significant reduction in attachment of a number of hospital isolates when coated onto two commercially available central venous catheters. The method described could be applied to identify polymers for a wide range of applications in which modification of bacterial attachment is important.
Introduction
Полимерные микрочипы миниатюризированы с высокой пропускной способностью платформ , в которых до 7000 полимеров 1 напечатанным на стеклянные слайды для параллельного анализа с прокариотических или эукариотических клетках 2. Изложенный здесь метод основан на том , что мы впервые описана в 2010 году 3. Эта система скрининга была применена к многочисленным типам клеток , включая гепатоцитов человека 4, стволовые клетки 5, почечных эпителиальных клеток канальцев 2, бактерий и 3,6 протозойных патогенов 7. В каждом случае полимеры , которые способствуют или резист связывания клеток исследуемых были идентифицированы 8. Комплексы ДНК с синтетическими полимерами поликатионных также использовались в формате микрочипов для высокопроизводительного скрининга трансфекция гена кандидатов 9. А также для скрининга клеток-субстратного взаимодействия, полимерные микрочипы также были использованы для оценки свойств материала 10.
"> Способность синтетических полимеров модулировать прикрепление бактерий к поверхности хорошо установлена 3,6,11. Многих факторов , включая заряд, гидрофобность и шероховатости поверхности полимерной поверхности , как известно, влияют на бактериальную переплета. Общепризнанные подходы обнаружения биоматериалов противящиеся связывание бактерий через последовательно или опытным путем разработки и тестирования одного материала в то время, являются трудоемкими, дорогостоящими и отнимает много времени процессы. Полимерные микрочипов предлагают привлекательную альтернативу для обхода таких ограничений.Поверхностно-ассоциированные бактерии растут как комплекс популяция называется биопленку – такие биопленки обладают высокой устойчивостью ко многим экологическим стрессам и антибиотиками. Это отчасти из – за их плотной внеклеточного матрикса (состоящей из белков, полисахаридов и нуклеиновых кислот) 12 и частично из – за увеличенного наличия надежных "persistor" клеток в биопленки 13. AlthoУф точные механизмы поверхностного объединения и последующего образования биопленки трудно охарактеризовать, как правило , полагают , что существуют три различных стадий роста поверхности 14 – 16. Начальная, обратимое присоединение сопровождается более сильной адгезии клеток, создание биопленки производства внеклеточного белка и полисахарида матрикса и пролиферации клеток. И, наконец, зрелые релизы биопленки свободно живущих планктонные клетки, которые могут инициировать новые инфекции в других местах. Бактерии-отталкивающие полимеры, которые предотвращают первоначальное прикрепление бактерий, и, следовательно, предотвратить ранние стадии образования биопленки, потенциально представляют собой отличное решение для минимизации инфекций. Учитывая повышение резистентности к антибиотикам (а также по своей природе большее сопротивление поверхностно-ассоциированных бактерий 12), к антибиотикам свободных средств уменьшения инфекции, представляют особый интерес. В условиях стационара, бактерии-отталкивающие полимерПокрытия могут иметь прямое медицинское применение в сокращении внутрибольничных инфекций, которые обычно формируются вокруг имплантированных устройств 17.
Здесь, метод с высокой пропускной способностью для скрининга 381 полимеров для репеллента активностью против патогенных бактерий , связанных с внутрибольничных инфекций, с последующим попаданием проверки и последующего покрытия и анализа центрального венозного катетера материалов, описывается (рисунок 1). Вкратце, эти полимеры были замечены на агарозном покрытые предметные стекла с помощью контактной печати и, после сушки и стерилизации, миниатюризированное массивы инкубировали с клинически важных бактериальных культур. После инкубации микрочипы осторожно промывают и прилипшие бактериальные клетки окрашивали и визуализировали с помощью флуоресценции. Впоследствии, полимеры, которые ингибируют бактериальный связывание исследовали в большем масштабе, путем нанесения на стеклянные покровных стеклах и визуализировали с помощью электронной микроскопии. Выбранный отталкиваютсяодолжил полимеры были затем наносили на коммерческих катетеров и показано, чтобы уменьшить прикрепление бактерий почти в 100 раз.
Protocol
Representative Results
Discussion
Прикрепление бактерий к поверхности является сложным процессом, определяется широким спектром факторов, в зависимости от вида бактерий, свойства поверхности, окружающей среды и физической среды. Хотя некоторые химические группы , как известно, влияют на бактериальные связывания (полигликоли, например, как правило , сопротивляются приспособление 11), коррелируют биологическое воздействие полимеров с их химических структур трудно, что делает рациональный дизайн полимеров для конкретных функций сложных. В отсутствие детальных механизмов крепления, другие исследования попытались имитировать встречающиеся в природе отталкивающие поверхности, с длительным и обширной оптимизации процессов 21. Миниатюрная метод с высокой пропускной способностью, представленный здесь преодолевает эти проблемы путем облегчения параллельного скрининга сотен полимеров для идентификации потенциальных клиентов для дальнейшего изучения.
Результаты метода микрочипов в основном служат для Identify вероятных кандидатов свинца. Рисунок 2 иллюстрирует 22 кандидатов с низким связыванием по меньшей мере одного вида, а на рисунке 3 показывает явное снижение связывающей способности. Все 22 низкого связывания полимеров , показанные на рис 2 были сделаны вперед в масштабируемых до экспериментов, в ходе которых в наибольшей степени (с точки зрения гидрофобность и покрытия свойств) были определены как PU83, PA13 и PA515 (рисунки 4 и 5). Полиакрилаты предлагают большую гибкость с точки зрения методов полимеризации и поэтому самым низким связывающий полиакрилат, PA13, был выбран для исследования катетер для нанесения покрытий (6 и 7). Более подробная дальнейшая работа над другими кандидатами было проведено и было сообщено в другом месте 6.
Через ряд экспериментальных итераций мы нашли ряд незначительных шагов были ключом к успеху и воспроизводимости. Помимо содействия адгезииполимеры к предметные стекла с использованием агарозы под-покрытием обеспечивает чистый фон, как агароза обладает высокой устойчивостью к бактериальной колонизации. Точно так же последовательность в полимере себя видит, как в одном массиве и между массивами, имеет жизненно важное значение, и поэтому печать массивов необходимо тщательно контролировать. Тщательное регулировка контакты в печатающей головке, а также равномерного заполнения 384-луночного планшета требуется для обеспечения равномерного пятнистость. Поскольку некоторые из полимеров, которые мы использовали демонстрировали степень флюоресценции, принимая данные фоновой флуоресценции для каждого слайда до инкубации с бактериями имеет жизненно важное значение. Для учета изменений и получить надежные данные о повторности микрочипов рекомендуется.
Пятно, используемое здесь (DAPI) не имеет селективность в отношении бактериальных видов, связывание неспецифически с ДНК. Таким образом, хороший асептических имеет важное значение, как только бактериальные культуры вводятся как загрязняющие вещества могут остаться незамеченными, запутывая interpreставление результатов. То же самое можно сказать и о более поздних экспериментах с использованием сканирующей электронной микроскопии, где можно только различать палочки и кокки, но не рода или вида.
После микрочипов скрининга, перспективные полимеры должны быть выбраны для дальнейшей проверки. В примере , представленном здесь, семь полимеров, идентифицировали по их явное снижение флуоресценции на микрочипе , и их ингибирование прикрепления было подтверждено путем нанесения их на больших поверхностях. На рисунках 4 и 5 показывают уменьшение в связывании достигается на покровных стеклах, А практические средства, чтобы проверить поведение полимеров в виде объемных покрытий, а не как микрочипов пятен. Впоследствии эти полимеры были нанесены на медицинские устройства, чтобы в полной мере количественно снижение прикрепление бактерий. Важно, что растворитель выбран (см раздел протокола 8) для этих исследований покрытия является доброкачественным до желаемой подложки (в данном случае, катетер) в то время как сохранитьИнг способность растворять полимер интерес, с тем чтобы обеспечить покрытие. Здесь мы использовали ацетон, который, как и упоминалось свойства, имеет низкую температуру кипения и быстро испаряется, чтобы оставить однородное покрытие.
Средства проверки выбранной будет зависеть от конкретного применения изучаемого. Поскольку наблюдение клеток с помощью электронной и флуоресцентной микроскопии позволяет осуществлять прямой количественной оценки индивидуального прикрепления клеток, мы выбрали эти методы в качестве дополнения к объемном анализе окрашивания микрочипов. Результаты представлены на рисунках 6 и 7, которые демонстрируют важность бесплатных методов проверки. Конфокальный изображения на Рисунке 6 обеспечивают очень четкие изображения отдельных клеток, в то время как СЭМ имеет дополнительное преимущество, что позволяет провести оценку поверхности полимера, который здесь гладкой и однородной. Эти методы ограничены полем зрения микроскопов, и поэтому она является IMPORTAнт, чтобы сделать серию снимков, чтобы иметь уверенность в результатах. Описанный выше способ не может количественно оценить прикрепление бактерий по всей поверхности, только вывести покрытие из ряда малых регионов. Мы считаем, что этого достаточно для применения описанного. Снижение бактериальной связывания может быть оценена с помощью перечисляя поверхности прилипших бактерий на всей мелованной и немелованной частей катетера с использованием методов , как описано в другом месте 22. Однако такие методы требуют биоматериала поверхностей просеивают, чтобы иметь однородную площадь поверхности, что трудно поддерживать, когда анализы выполняются с помощью медицинских устройств, которые часто имеют сложную геометрию.
Очевидно, что любое устройство, предназначенное для клинического применения должно пройти существенное дальнейшее тестирование, чтобы гарантировать безопасность и эффективность в организме человека. Метод , представленный здесь представляет собой начало этого процесса и дальнейшей работы должны включать подтверждение активности в естественных условиях. В этом случае, изучая венозный грatheters, первоначальная работа могла бы исследовать связывание компонентов крови и целых клеток к полимеру. Влияние компонентов крови на бактериальный связывания также следует рассматривать, возможно , путем повторения анализов связывания в присутствии инактивированной сыворотки или де-fibrinated крови 23. Окончательное испытание технологии будет в модели в естественных условиях , таких как модель 24 инфекции подкожного имплантата.
Мы демонстрируем потенциал метода полимерного микрочипов для скрининга поверхностных изменяющих полимеров. Такие полимеры (как противостоящие и способствующие связывания бактериальных) имеют большое количество применений в медицине, пищевой промышленности и биотехнологии, а это означает этот метод может быть полезен во многих областях исследований. Хотя работа здесь используются бактерии, метод может быть адаптирован к другим типам клеток и также другие химические микрочипов.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank EASTBIO (the East of Scotland BioScience Doctoral Training Partnership funded by the BBSRC) (S. V.) and the Medical Research Council (P.J.G) for funding.
Materials
| Agarose | Sigma | 05066 | |
| Silane-prep slides | Sigma | S4651 | |
| Polymers | Synthesised in-house | Not applicable | |
| NMP | Sigma | 494496 | |
| LB Broth | Oxoid | CM1018 | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| Tetrahydrofuran | Sigma | 401757 | |
| (3-aminopropyl) triethoxysilane coated glass slides | Sigma | Silane-prep | |
| Cacodylate buffer | Sigma | 97068 | |
| Catheter 1 | Arrow International | CS12123E | |
| Catheter 2 | Baxter Healthcare | ECS1320 | |
| Osmium tetroxide | Sigma | 201030 | |
| Equipment | |||
| Contact printer | Genetix | Qarraymini | |
| Microarray microscope | IMSTAR | Pathfinder | |
| Spin Coater | Speedline Technologies | 6708D | |
| Confocal microscope | Leica | SP5 | |
| Image analysis software | Media Cybernetics | Image-Pro Plus | |
| Scanning electron microscope | Philips | XL30CP | |
| Sputter coater | Bal-Tec | SCD050 |
Riferimenti
- Hansen, A., Mjoseng, H. K., et al. High-Density Polymer Microarrays: Identifying Synthetic Polymers that Control Human Embryonic Stem Cell Growth. Adv. Healthc. Mat. 3 (6), 848-853 (2014).
- Tourniaire, G., Collins, J., et al. Polymer microarrays for cellular adhesion. Chem. Commun. (20), 2118-2120 (2006).
- Pernagallo, S., Wu, M., Gallagher, M. P., Bradley, M. Colonising new frontiers-microarrays reveal biofilm modulating polymers. J. Mat. Chem. 21 (1), 96-101 (2010).
- Hay, D. C., Pernagallo, S., et al. Unbiased screening of polymer libraries to define novel substrates for functionala hepatocytes with inducible drug metabolism. Stem Cell Res. 6 (2), 92-102 (2011).
- Anderson, D. G., Levenberg, S., Langer, R. Nanoliter-scale synthesis of arrayed biomaterials and application to human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 22 (7), 863-866 (2004).
- Venkateswaran, S., Wu, M., et al. Bacteria repelling poly(methylmethacrylate-co-dimethylacrylamide) coatings for biomedical devices. J. Mat. Chem. B. 2 (39), 6723-6729 (2014).
- Pickering, H., Wu, M., Bradley, M., Bridle, H. Analysis of Giardia lamblia Interactions with Polymer Surfaces Using a Microarray Approach. Environ.l Sci. Technol. 46 (4), 2179-2186 (2012).
- Mizomoto, H. The Synthesis and Screening of Polymer Libraries using a High Throughput Approach. , (2004).
- How, S. E., Yingyongnarongkul, B., Fara, M. A., Díaz-Mochón, J. J., Mittoo, S., Bradley, M. Polyplexes and lipoplexes for mammalian gene delivery: from traditional to microarray screening. Comb. Chem. High Throughput Screen. 7 (5), 423-430 (2004).
- Thaburet, J. -. F., Mizomoto, H., Bradley, M. High-Throughput Evaluation of the Wettability of Polymer Libraries. Macromol. Rapid Commun. 25 (1), 366-370 (2004).
- Hook, A. L., Chang, C. -. Y., et al. Combinatorial discovery of polymers resistant to bacterial attachment. Nat. Biotechnol. 30 (9), 868-875 (2012).
- Hall-Stoodley, L., Stoodley, P. Evolving concepts in biofilm infections. Cell. Microbiol. 11 (7), 1034-1043 (2009).
- Lewis, K. Persister Cells. Ann. Rev. Microbiol. 64 (1), 357-372 (2010).
- Sauer, K., Camper, A. K., Ehrlich, G. D., Costerton, J. W., Davies, D. G. Pseudomonas aeruginosa Displays Multiple Phenotypes during Development as a Biofilm. J. Bacteriol. 184 (4), 1140-1154 (2002).
- Reisner, A., Haagensen, J. A. J., Schembri, M. A., Zechner, E. L., Molin, S. Development and maturation of Escherichia coli K-12 biofilms. Mol. Microbiol. 48 (4), 933-946 (2003).
- Watnick, P. I., Kolter, R. Steps in the development of a Vibrio cholerae El Tor biofilm. Mol. Microbiol. 34 (3), 586-595 (1999).
- Campoccia, D., Montanaro, L., Arciola, C. R. A review of the biomaterials technologies for infection-resistant surfaces. Biomaterials. 34 (34), 8533-8554 (2013).
- Imstar. . Pathfinder Technology for High Content Cellular Screening in Cell Biology and Genetoxicity Software version: 6.04I. , (2012).
- Williams, J. R., Clifford, A. A. . Supercritical Fluid Methods and Protocols. 13, (2000).
- Kuo, J. . Electron microscopy methods and protocols. , (2007).
- Leslie, D. C., Waterhouse, A., et al. A bioinspired omniphobic surface coating on medical devices prevents thrombosis and biofouling. Nat. Biotechnol. 32 (11), 1134-1140 (2014).
- Bechert, T., Steinrücke, P., Guggenbichler, J. P. A new method for screening anti-infective biomaterials. Nat. Med. 6 (9), 1053-1056 (2000).
- May, R. M., Magin, C. M., et al. An engineered micropattern to reduce bacterial colonization, platelet adhesion and fibrin sheath formation for improved biocompatibility of central venous catheters. Clin. Transl. Med. 4, (2015).
- Chen, R., Willcox, M. D. P., Ho, K. K. K., Smyth, D., Kumar, N. Antimicrobial peptide melimine coating for titanium and its in vivo antibacterial activity in rodent subcutaneous infection models. Biomaterials. 85, 142-151 (2016).
