High-throughput identificazione di batteri Polimeri repellente per dispositivi medici
Summary
A high-throughput microarray method for the identification of polymers which reduce bacterial surface binding on medical devices is described.
Abstract
Medical devices are often associated with hospital-acquired infections, which place enormous strain on patients and the healthcare system as well as contributing to antimicrobial resistance. One possible avenue for the reduction of device-associated infections is the identification of bacteria-repellent polymer coatings for these devices, which would prevent bacterial binding at the initial attachment step. A method for the identification of such repellent polymers, based on the parallel screening of hundreds of polymers using a microarray, is described here. This high-throughput method resulted in the identification of a range of promising polymers that resisted binding of various clinically relevant bacterial species individually and also as multi-species communities. One polymer, PA13 (poly(methylmethacrylate-co-dimethylacrylamide)), demonstrated significant reduction in attachment of a number of hospital isolates when coated onto two commercially available central venous catheters. The method described could be applied to identify polymers for a wide range of applications in which modification of bacterial attachment is important.
Introduction
Microarrays polimeri sono miniaturizzati piattaforme high-throughput in cui fino a 7.000 polimeri 1 sono stampati su vetrini per l'analisi in parallelo con le cellule procariote o eucariote 2. Il metodo presentato qui si basa su ciò che abbiamo prima descritto nel 2010 3. Questo sistema di screening è stato applicato a numerosi tipi di cellule tra cui epatociti umani 4, cellule staminali 5, tubulare renale cellule epiteliali 2, batteri e agenti patogeni 3,6 protozoi 7. In ogni caso, i polimeri che promuovono o resistere legame delle cellule in fase di studio sono stati identificati 8. Complessi di DNA con polimeri sintetici policationici sono stati utilizzati anche nel formato microarray per high-throughput screening di candidati gene trasfezione 9. Così come screening per le interazioni cellula-substrato, microarrays polimeri sono stati utilizzati anche per valutare le proprietà del materiale 10.
"> La capacità di polimeri sintetici per modulare attacco di batteri su una superficie è ben definito 3,6,11. Numerosi fattori, tra cui carica, idrofobicità e rugosità superficiale della superficie polimerica sono noti per influenzare batteriche. Gli approcci convenzionali vincolanti biomateriali scoperta che resistono legame di batteri attraverso la sequenza o empiricamente progettare e testare un materiale alla volta sono, costosi e processi in termini di tempo ad alta intensità di manodopera. microarray polimeri offrono una valida alternativa per aggirare tali limitazioni.batteri superficiali associati crescere come popolazione complesso definito un biofilm – tali biofilm sono altamente resistenti a molti stress ambientali e antibiotici. Ciò è in parte dovuto alla loro matrice extracellulare densa (composto da proteine, polisaccaridi e acidi nucleici) 12 e in parte a causa della maggiore presenza di robusti "persistor" cellule in biofilm 13. although i precisi meccanismi di associazione di superficie e la successiva formazione di biofilm sono difficili da caratterizzare, in genere si ritiene che ci sono tre diverse fasi di crescita della superficie 14 – 16. , Attaccamento reversibili iniziale è seguita da forte adesione delle cellule, la creazione di un biofilm per la produzione di una proteina extracellulare e della matrice polisaccaride e la proliferazione cellulare. Infine, i rilasci biofilm maturi cellule planctonici, che possono avviare nuove infezioni altrove a vita libera. Batteri-repellente polimeri che impediscono l'attacco iniziale di batteri, e quindi impediscono prime fasi di formazione del biofilm, potenzialmente rappresentano un'ottima soluzione per minimizzare le infezioni. Dato l'aumento della resistenza agli antibiotici (e anche l'intrinseca maggiore resistenza dei batteri di superficie associati 12), mezzi antibiotici libera di ridurre le infezioni sono di particolare interesse. In un ambiente ospedaliero, polimero batteri-repellenterivestimenti possono avere una applicazione medica diretta nella riduzione delle infezioni nosocomiali, che comunemente si formano intorno dispositivi impiantati 17.
Qui, un metodo ad alta produttività per la proiezione di 381 polimeri per l'attività repellente contro una serie di batteri patogeni associati alle infezioni nosocomiali, seguita da convalida colpo e successivo rivestimento e dosaggio dei materiali dei cateteri venosi centrali, è descritto (Figura 1). In breve, i polimeri sono stati avvistati su agarosio rivestite vetrini di stampa a contatto e, dopo l'essiccazione e la sterilizzazione, gli array miniaturizzati sono state incubate con clinicamente importanti colture batteriche. Dopo l'incubazione, i microarray sono state delicatamente lavati e le cellule batteriche aderenti erano macchiate e visualizzate mediante fluorescenza. Successivamente, polimeri che inibito batterica vincolanti sono stati studiati su scala più vasta stendendo su copertura in vetro scivola e visualizzati al microscopio elettronico. respingono selezionatipolimeri prestati sono stati poi rivestiti su cateteri commerciali e dimostrato di ridurre l'attaccamento dei batteri di quasi 100 volte.
Protocol
Representative Results
Discussion
Attachment di batteri ad una superficie è un processo complesso determinato da una vasta gamma di fattori dipende dalle specie batteriche, le proprietà della superficie, il mezzo circostante e l'ambiente fisico. Sebbene alcuni gruppi chimici sono noti per influenzare vincolanti batteriche (poliglicoli, per esempio, resistere tipicamente allegato 11), correlando l'impatto biologico di polimeri con le loro strutture chimiche è difficile, rendendo progettazione razionale di polimeri per funzioni specifiche impegnative. In assenza di meccanismi dettagliati di attacco, altri studi hanno tentato di imitare le superfici repellenti presenti naturalmente, con lungo e ottimizzazione vasta processi 21. Il metodo high-throughput miniaturizzato qui presentata supera queste sfide per facilitare lo screening parallelo di centinaia di polimeri per identificare i cavi per ulteriori studi.
I risultati del metodo microarray principalmente servono a identify probabili candidati piombo. La Figura 2 illustra 22 candidati con bassa vincolante di almeno una specie, mentre la figura 3 illustra la netta riduzione della capacità di legame. Tutte le 22 polimeri a basso vincolante mostrati in figura 2 sono stati portati avanti in esperimenti di scale-up, durante i quali il migliore (in termini di repellenza e rivestimento proprietà) sono stati determinati per essere PU83, PA13 e PA515 (figure 4 e 5). Poliacrilati offrono una maggiore flessibilità in termini di metodi di polimerizzazione e quindi il poliacrilato basso vincolante, PA13, è stato scelto per studi di rivestimento del catetere (figure 6 e 7). Più dettagliate ulteriori lavori su altri candidati è stata effettuata ed è stato riportato altrove 6.
Attraverso una serie di iterazioni sperimentali abbiamo trovato un certo numero di passi minori sono stati fondamentali per il successo e la riproducibilità. Oltre ad agevolare l'adesione dellapolimeri ai vetrini, utilizzando un agarosio sotto-rivestimento fornisce un fondo pulito, come agarosio è altamente resistente alla colonizzazione batterica. Allo stesso modo la coerenza nel polimero stessi visto, sia all'interno della stessa matrice e tra gli array, è vitale e quindi la stampa delle matrici deve essere attentamente controllato. regolazione accurata dei perni della testina di stampa e di riempimento anche uniforme del piatto 384 pozzetti sono tenuti a garantire macchia uniforme. Come alcuni dei polimeri che abbiamo usato in mostra un grado di autofluorescenza, prendendo i dati fluorescenza di fondo per ogni diapositiva prima di incubazione con i batteri era vitale. Per tenere conto di variazioni e di ottenere sono invitati robusti replica i dati di microarray.
La macchia impiegato qui (DAPI) non ha selettività per specie batteriche, vincolanti non specificamente al DNA. Pertanto, buona tecnica asettica è essenziale una volta colture batteriche sono introdotti come contaminanti possono passare inosservati, confondendo l'interprezione dei risultati. Lo stesso vale per esperimenti successivi utilizzando la microscopia elettronica a scansione, dove è possibile solo distinguere aste e cocchi ma non genere o specie.
Dopo lo screening microarray, polimeri promettenti dovrebbero essere scelti per un ulteriore convalida. Nell'esempio qui presentato, sette polimeri di interesse sono stati identificati dal loro netta riduzione della fluorescenza sul microarray e loro inibizione di fissaggio è stata confermata da loro rivestimento su superfici di grandi dimensioni. Figure 4 e 5 mostrano la riduzione legame realizzato su vetrino, un mezzi pratici per testare il comportamento dei polimeri come rivestimenti di massa piuttosto che come macchie di microarray. Successivamente, questi polimeri sono stati rivestiti su dispositivi medici per quantificare con riduzione attacco batterico. È importante che il solvente scelto (vedi sezione protocollo 8) per questi studi rivestimento è benigna al substrato desiderato (qui, il catetere) mentre conservanoing capacità di sciogliere il polimero di interesse, per permettere rivestimento. Qui, abbiamo utilizzato acetone che, così come le proprietà menzionate, ha un punto di ebollizione basso ed evapora rapidamente per lasciare un rivestimento uniforme.
I mezzi di convalida scelto dipenderà dalla specifica applicazione in fase di studio. Come osservazione delle cellule al microscopio elettronico e fluorescenza permette la quantificazione diretta di attaccamento singola cella, abbiamo scelto queste tecniche come complemento per il test colorazione microarray di massa. I risultati sono mostrati nelle figure 6 e 7, che dimostrano l'importanza di tali metodi gratuiti. Le immagini confocali in figura 6 fornisce chiare immagini delle singole celle, mentre il SEM ha il vantaggio di consentire una valutazione della superficie del polimero, che è qui liscia ed uniforme. Questi metodi sono limitati dal campo di vista dei microscopi utilizzati, e quindi è important a prendere una serie di istantanee di avere fiducia nei risultati. Il metodo sopra descritto non può quantificare l'adesione batterica su tutta la superficie, solo dedurre la copertura da un certo numero di piccole regioni. Crediamo che questo sia sufficiente per l'applicazione descritta. Riduzione batterica vincolante potrebbe essere valutata enumerando batteri aderito superficiali sui pezzi interi catetere patinati e non patinati con metodi come descritto altrove 22. Tuttavia tali metodi richiedono superfici biomateriali schermati avere una superficie uniforme, che è difficile da mantenere quando saggi sono eseguiti con dispositivi medici, che spesso hanno una geometria complessa.
Chiaramente, qualsiasi dispositivo destinato ad uso clinico deve passare attraverso sostanziale ulteriori test per garantire la sicurezza e l'efficacia negli esseri umani. Il metodo qui presentato rappresenta l'inizio di questo processo e ulteriore lavoro deve includere conferma di attività in vivo. In questo caso, lo studio c venosaatheters, il lavoro iniziale potrebbe indagare il legame di componenti del sangue e cellule intere al polimero. L'effetto dei componenti del sangue sulla batterica vincolante dovrebbe essere considerata, eventualmente ripetendo i saggi di legame in presenza di siero inattivato o di sangue de-fibrinated 23. La prova definitiva della tecnologia sarà in un modello in vivo, come una infezione modello di impianto sottocutaneo 24.
Dimostriamo il potenziale del metodo microarray polimero per lo screening di polimeri di superficie che alterano. Tali polimeri (entrambi resistenti e promuovere batterica vincolante) hanno un gran numero di applicazioni in medicina, l'industria alimentare e delle biotecnologie, che significa questo metodo può essere utile in molti settori della ricerca. Anche se il lavoro qui utilizza batteri, il metodo potrebbe essere adattato ad altri tipi di cellule e analogamente altri microarray chimici.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank EASTBIO (the East of Scotland BioScience Doctoral Training Partnership funded by the BBSRC) (S. V.) and the Medical Research Council (P.J.G) for funding.
Materials
| Agarose | Sigma | 05066 | |
| Silane-prep slides | Sigma | S4651 | |
| Polymers | Synthesised in-house | Not applicable | |
| NMP | Sigma | 494496 | |
| LB Broth | Oxoid | CM1018 | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| Tetrahydrofuran | Sigma | 401757 | |
| (3-aminopropyl) triethoxysilane coated glass slides | Sigma | Silane-prep | |
| Cacodylate buffer | Sigma | 97068 | |
| Catheter 1 | Arrow International | CS12123E | |
| Catheter 2 | Baxter Healthcare | ECS1320 | |
| Osmium tetroxide | Sigma | 201030 | |
| Equipment | |||
| Contact printer | Genetix | Qarraymini | |
| Microarray microscope | IMSTAR | Pathfinder | |
| Spin Coater | Speedline Technologies | 6708D | |
| Confocal microscope | Leica | SP5 | |
| Image analysis software | Media Cybernetics | Image-Pro Plus | |
| Scanning electron microscope | Philips | XL30CP | |
| Sputter coater | Bal-Tec | SCD050 |
Riferimenti
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