High-throughput Identificatie van bacteriën Repellent Polymers for Medical Devices

1. Bereiding van Agarose Coated Slides Opmerking: Voor het vervaardigen van het polymeer microarrays worden glasplaatjes-aminoalkylsilane bekleed bekleed met agarose IB om niet-specifieke achtergrondbinding verkort en de evaluatie van polymeren die binden of afstoten bacteriën 6. Silaancoating vergemakkelijkt de binding van agarose op de objectglaasjes. Vormen een 2% (w / v) oplossing van agarose IB in gedestilleerd water in een fles van 250 ml. Na afdekken van de fles los, verwarm de suspensie in een microgolfoven in 30 seconden perioden tot opgelost. Zorg ervoor dat de kap niet goed is afgesloten om eventuele drukopbouw te voorkomen. Verwijder de fles regelmatig en schud zachtjes. Zorgen dat de vaste opgelost en de oplossing helder is. Giet dit agarose oplossing in een bekerglas van 100 ml, en plaats in een 65 ° C waterbad tot een vloeibare oplossing te handhaven. Dompel de silaan gecoate dia's in de agarose oplossing, uniforme coating, en wipe de achterkant van de slede met een tissuepapier. Droog de glaasjes met de beklede kant naar boven, in een stofvrije omgeving (bijvoorbeeld in een kast of zuurkast) gedurende minimaal 24 uur. Bevestigen van een uniforme bekleding door visuele inspectie. Coating kan gemakkelijk worden beoordeeld door de ademhaling op de slide – condens zal vormen op ongecoat regio's. Slechts slides volledig en gelijkmatig bedekt moet worden gebruikt voor microarray afdrukken. 2. Voorbereiding van Polymer Solutions voor afdrukken Bereid oplossingen (1% w / v) van een selectie van voorgevormde polymeren bestaande uit polyacrylaten, polyacrylamiden en polyurethanen in N-methylpyrrolidon (NMP) in glazen flesjes. (Bereiden 1 ml van elk polymeer). Vortex totdat het polymeer volledig is opgelost. Synthese van polymeren elders 6 beschreven. Met behulp van een micro-pipet, vul elk putje van een 384 microwell plaat met 25 pi polymeeroplossing, ervoor te zorgen dat er geen kruis Contaling en elk putje bevat een unieke polymeer. Gebruik NMP als negatieve controle in tenminste 2 putjes. Noteer de identiteit van de polymeer-oplossing in elk putje op een plaat met sjabloon of spreadsheet-bestand. 3. Printing Polymer Microarrays Met behulp van een printer Contact LET OP: Het afdrukken van microarrays werd uitgevoerd met behulp van een contact printer. Specifieke instructies betreffende polymeer microarray afdrukken worden hieronder gegeven. Voor algemene richtlijnen over het gebruik van de aanbevelingen van de printer en de veiligheid, volg de handleiding van de fabrikant. Hoewel we een contact printer, kan een geschikte handmatige stempelen inrichting ook worden gebruikt. Zoals geadviseerd in de printer handleiding, het creëren van een routine (zie stap 3.3) dat het drukken van 384 vloeistoffen (de polymeeroplossingen of NMP) in viervoud maakt, met behulp van een 32-pins microarraying kop (ingericht als 8 rijen en 4 kolommen). Print 1536 plekken ingericht als 48 rijen en 32 kolommen. Programmeer de routine om af te drukken in 12 secties, dwz., 32 oplossingen tegelijk, zodat de printer kan worden gestopt na het afdrukken van elke sectie om voor het reinigen van pennen. Om een ​​drukkerij routine te maken: Open de software en van de beschikbare opties te kiezen 'Maak een nieuwe routine'. Selecteer het tabblad 'Beschrijving' voor het invoeren van gegevens van het experiment. Selecteer het tabblad 'Head' en kies '32 pins microarraying head '. Selecteer het tabblad 'Source' en kies plaathouder (bron plaat houder (1×5)), typeplaatje (plate 384 x 6000), de totale platen (1) en de bron bestelling (door kolommen). In het tabblad 'Slide design', kies '3×1' 'slide' en kies arraying door 'Field nummer'. Selecteer vervolgens 'arraying patroon'. Input 'Spot view' als 'lay-out' en 'Pattern dimensies' als 'Row count' (6), 'Column count' (8), 'Row pitch' (750) en "Column pitch '(560). Kies een sectie naar sparren afdrukkent. In de 'Slide layout' tab-ingang het aantal dia's gebruikt voor het afdrukken. Selecteer het tabblad 'Afdrukken' voor het invoeren van de drukkerij parameters (aantal postzegels per inkt: 1, aantal zegels per spot: 5, stampen tijd: 200 msec, inkten tijd: 100 msec). LET OP: Een routine is nu gemaakt voor het afdrukken van 384 vloeistoffen (de polymeeroplossingen of NMP) in viervoud, met behulp van een 32-pins microarraying kop (ingericht als 8 rijen en 4 kolommen). In totaal moet de routine 1536 plekken ingericht als 48 rijen en 32 kolommen met een rij steek van 750 urn en de kolom steek van 560 urn te drukken. Plaats de met agarose gecoate glaasjes op het platform en zorgen voor een goede vacuümafdichting op de objectglaasjes zijn plaats te houden. Pas de printkop zodat alle pennen op dezelfde hoogte. Controleer dit door het hoofd handmatig verlagen op een glasplaatje en wordt bevestigd dat de pennen bewegen op hetzelfde moment. Als er verschillen zijn met de hoogte, aan te passen met behulp van de sleeve op de pin omhoog of omlaag. Plaats de plaat goed op de plaat houder in de juiste richting, dwz., Goed A1 is om de top rechts van de houder en zorgen voor de wells plaat wordt stevig bevestigd. Met de hoogteversteller, opdat de hoogte van de plaathouder is zodanig dat bij het kiezen van de polymeeroplossingen de pennen niet de bodem van de putjes raken. Opmerking: Dit is belangrijk voor gelijkmatige polymeer spotten en ook om morsen van polymeeroplossingen in aangrenzende putjes, waardoor kruisbesmetting veroorzaken. Selecteer het tabblad 'Start' en kies de 'Run soort' als 'normaal'. Klik op 'Uitvoeren' en bevestig dat glijbaan, well plaat, enz., Zijn in de positie als daarom wordt gevraagd. Afdrukken 1 sectie per keer (32 oplossingen op een moment; 12 delen), waardoor voor het reinigen van de pennen tussen de secties. Reinig de pennen grondig met een papieren handdoek gedrenkt in aceton, gevolgd door droge tissue papier om te zorgen voor de pinnen volledig droog. Na voltooiing van het afdrukken van de microarrays, plaats ze in een houder en drogen gedurende de nacht in een vacuümoven ingesteld op 45 ° C aan de NMP te verwijderen in het polymeer vlekken. Na sterilisatie met UV licht gedurende 30 minuten, de microarrays klaar voor inoculatie van bacteriën. Voordat het enten van dia's met bacteriën, neem een ​​meting van de achtergrond fluorescentie (zoals beschreven in paragraaf 5). Met deze meting bij de berekening van bacteriële binding. 4. Enten van Polymer Microarrays met Bacteriën OPMERKING: Zorg voor een goede aseptische techniek. Alle behandeling van kweken worden uitgevoerd in een steriele omgeving: ofwel met een Bunsen brander of in een stroomkast. Culturen worden gekweekt met zuurstofbeschikbaarheid, groeimedium en temperatuur aangepast aan de behoeften van iedere soort. Bereid overnachtkweken door het enten 5 ml Luria-Bertani bouillon (LB: 10 g L -1 bacto-trypton, 5 g L -1 NaCl en 10 g L <sup> -1 gistextract) met een kolonie van een plaat. Incubeer overnacht bij 37 ° C, onder schudden bij 200 rpm. Bereid vriezer voorraden 's nachts culturen door toevoeging van glycerol (10% concentratie in totaal) en opslaan van de voorraad bij -80 ° C. Om het aantal cellen bepaald uit monsters van de ontdooide bacteriële voorraden Voer seriële verdunningen van elk bestand en groeien de bacteriën overnacht op vaste media. Nauwkeurige bepaling van het aantal cellen in aandelen zorgt voor een passende enting van elke soort 6. Bereid inocula voor microarray. Enkele soort kweken worden gekweekt zoals hierboven en rechtstreeks op de microarrays. BacMix-1 is een bacterieel mengsel van Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae), Staphylococcus saprophyticus (S. saprophyticus) en Staphylococcus aureus (S. aureus). BacMix-2 is een bacterieel mengsel bestaande uit Streptococcus mutans (S. mutans), S. aureus </em>, K. pneumoniae en Enterococcus faecalis (E. faecalis). Ofwel mengcultuur produceren, meng overnachtingen in gelijke volumes (3 ml per stuk) en verdun vier keer met verse LB (tot ongeveer 50 ml uiteindelijk volume). Plaats-UV gesteriliseerd polymeer microarrays in rechthoekige 4 putjes en incubeer ze met 6 ml gemengde bacteriële kweken bij 37 ° C onder zacht schudden (30 rpm) gedurende 5 dagen. Na incubatie voorzichtig spoel de microarrays tweemaal met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCI, 10 mM Na 2 HPO 4, 1,8 mM KH 2PO 4) en incubeer met een oplossing van 1 pg ml-1 van 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) kleuring in PBS gedurende 30 min. Was de gebrandschilderde microarray dia's in een frisse goed plaat door het bedekken met PBS en voorzichtig te zwenken, het veranderen van de PBS een keer. Droog onder een luchtstroom. Breng een glazen afdekplaat slip aan de microarray glijbaan en afdichting op zijn plaats met lijm. eenmaal dry, steriliseren het buitenoppervlak met 70% (v / v) ethanol. Veilig te verwijderen culturen op basis van hun inperkingsniveau. 5. Microarray Imaging and Analysis Leg enkele beelden voor elke polymeer plek in helderveld en DAPI (Ex / Em = 358 nm / 361 nm) kanalen. Voer handmatig met een fluorescentiemicroscoop of middels een geautomatiseerde fluorescentie microscoop (met een XYZ stadium bestuurd door een beeldacquisitie software) uitgerust met een 20X objectief. OPMERKING: Raadpleeg de handleiding 18 voor het bedienen van de software en het aanpassen van de microscoop om beelden met behulp van helderveld en DAPI kanalen te verkrijgen. Controleer of de versterking en belichtingstijd voor het vastleggen van alle microarrays zijn hetzelfde. Het verkrijgen van de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van elke plek in de DAPI kanaal door te kiezen voor de spot gebied en kwantificeren van de fluorescentie met een beeld processing software. Voor de achtergrondfluorescentie van elke vlek, OBTAin beelden van het polymeer vlekken op overgenomen microarray geïncubeerd met alleen medium zonder bacteriën. Aftrekken van de achtergrond fluorescentie van de intensiteit van de spot op fluorescentie verkregen uit bacteriën. Bereken gemiddelde genormaliseerde waarde van de vier plaatsen, die elk polymeer, bij vergelijking bacteriën binden van verschillende polymeren 6. Identificeer de polymeren die het minst bacteriële binding (laagste fluorescentie) als 'hit' polymeren 6 vertonen. 6. Coating van Cover Slips voor 'Hit' Validation Om Coat Coverslips met Polymers: Bereid oplossingen treffer polymeren (~ 2% w / v) in tetrahydrofuran (THF), of ander geschikt oplosmiddel. Spin coat ronde glazen dekglaasjes van geschikte grootte met de polymeeroplossingen met een spinbekleder bij 2000 tpm gedurende 10 sec. LET OP: Bij afwezigheid van een spin coater, dekglaasjes of andere materialen kan dip gecoat zijn, hoewel rotatiecoating produceert een uniform oppervlak. Droog de beklede dekglaasjes in een convectieoven bij 40 ° C overnacht en gesteriliseerd met UV licht gedurende 30 minuten voorafgaand aan het inoculeren bacteriën. Om Coat Coverslips met Agarose voor negatieve controles: Schone dekglaasjes hetzij door plasmabehandeling gedurende 10 minuten of onder te dompelen in 1 M NaOH gedurende 4 uur. Dompel de dekglaasjes in acetonitril overnacht bevattende 1% (3-aminopropyl) triethoxysilaan. Reinig de dekglaasjes met aceton 3 keer en in een oven (100 ° C) gedurende 1 uur. Dip coat het gedroogde dekglaasjes met 1% agarose oplossing gehandhaafd in een waterbad van 60 ° C. Plaats de agarose gecoate dekglaasjes op vlakke oppervlak stofvrij omgevingsomstandigheden gedurende 24 h en gesteriliseerd met UV licht gedurende 30 minuten voorafgaand aan het inoculeren bacteriën. 7. Bevestiging en analyse van Cover Slip Met behulp van Scanning Electron Microscope (SEM) Nasterilisatie met UV licht gedurende 30 minuten, plaats de dekglaasjes (polymeer / agarose bekleed of onbekleed glas) in een standaard 12-well plaat of 24-well plaat (afhankelijk van de grootte van de dekglaasjes) en incubeer met bacteriën zoals beschreven in sectie 4. Na incuberen met bacteriën, was de onbeklede en beklede dekglaasjes tweemaal met 0,1 M cacodylaatbuffer (pH 7,4) en bevestig met 2,5% (w / v) glutaaraldehyde in 0,1 M cacodylaatbuffer (pH 7,4) gedurende 2 uur. Post-fix monsters met 1% (w / v) osmiumtetroxide gedurende 1 uur bij kamertemperatuur en drogen met ethanol sequentiële wasbeurten bij 50, 70, 90 en 100% (v / v) gedurende 30 minuten elk. Droge monsters CO 2 volgens standaardprotocollen 19. De droogtijd hangt af van de aard van het monster. Coat monsters in een goud / palladium legering (60/40%) met een sputter coater met stroom op 30 mA en vacuüm bij 0,75 Torr. Onderzoek onder een elektronenmicroscoop volgens standaardprotocollen 20. LET OP: Ensure adequate veiligheidsmaatregelen om de risico's als gevolg van de opslag, verwerking en afvoer van osmiumtetroxide te beheren, want het is zeer giftig. Visueel vergelijken beelden van de niet-gecoate dekglaasjes en die bekleed met agarose of 'hit' polymeren bacteriële binding / afstotende vermogen van de polymeren te bevestigen. LET OP: Weerstand van gehechtheid moet goed zichtbaar als een vermindering van de cellen aanwezig zijn. Kies de meest veelbelovende 'hit' niet-bindende polymeren voor de coating studies met medische apparaten (bijv centraal veneuze katheters) 6. 8. Selectie van een oplosmiddel voor Coating katheters Evalueer verschillende oplosmiddelen op hun verenigbaarheid met de inwonende deel van de katheter, evenals hun vermogen om de "hit" polymeer op te lossen. Gesneden delen cath-1 en tot cilindrische stukken 5 mm lang, en meet met een digitale schuifmaat. Evalueer diverse oplosmiddelen zoals acetic acid, ammonia, aceton, acetonitril, diethylether, tetrahydrofuran (THF), dimethylformamide (DMF), N-methyl-2-pyrrolidon (NMP), ethanol, methanol, ethyleenglycol, tolueen en xyleen. Dompel katheter stukken in de oplosmiddelen voor 12 uur en beoordelen visueel integriteit van de katheter en duidelijkheid oplosmiddel. OPMERKING: Kies een oplosmiddel dat niet leidt tot de katheters opzwellen en desintegreren of tot een troebele oplosmiddel. Het oplosmiddel moet de 'hit' polymeren ontbinden. 9. Analyse van de bacteriële Attachment op katheters door confocale microscopie Bereid 2,5% (w / v) polymeeroplossingen in aceton of een ander geschikt oplosmiddel zoals bepaald punt 8. Plaats 5 mm katheter stukjes in een kleine glazen flesjes (5 ml) en dompel hen in 1 ml van de polymeeroplossing gedurende 2 min . Verwijder het polymeeroplossing en droog de katheter stukjes overnacht in een vacuümoven bij 40 ° C. Bereid entstof door het mengen van ontdooide bacteriële stocks tot ongeveer 10 6 cellen van elke soort te geven in 50 ml LB 6. Steriliseren zonder deklaag katheter stukken met UV licht gedurende 30 minuten en geïncubeerd met 1 ml LB geïnoculeerd in een 24-puts plaat bij 37 ° C gedurende 3 dagen onder zacht schudden 6. Na incubatie was de catheters met PBS (2x 2 ml), bevestig de bacteriën met 10% paraformaldehyde in PBS gedurende 30 minuten en wassen met PBS (1 ml). Vlek de bacteriën op katheter stukken met DAPI (1 pg ml – 1) gedurende 20 minuten en wassen met PBS (1 ml). Verkrijgen confocale beelden van de katheter stukken met de volgende instellingen: 405nm blauwe laser diode, detector range 414-502 nm, pin hole – Airy1, beeldformaat – 1024 × 1024 pixels, voxel breedte – 105,2 nm, Z-stacks spacing 0.5μ m , vergroting – 40X 1,25. Voltooi de confocale beeldvorming door-Z stapelen 50 beelden over 100 pm lengte van de katheter. Analyseren van de beelden met behulp van suitable analyse software: plat de-Z gestapelde beelden in de Z-vlak, met behulp van de functie om de scherptediepte te verlengen, tot een enkel beeld van een katheter stuk te maken. Opmerking: Dit beeld moet vervolgens worden geanalyseerd om het gebied van de katheter waarop bacteriën verkrijgen na achtergrond correctie met de functie 'plat achtergrond. 10. Analyse van de bacteriële Attachment op katheters met SEM Bereid 10% polymeeroplossing (w / v) in aceton. Druk op een pipet tip (voor 200 ul micropipet) in het midden gedeelte van de snede stuk van de katheter om het te houden en dompel het stuk in het polymeer oplossing voor ongeveer 30 sec. Droog de beklede stuk in omgevingsomstandigheden gedurende 30 min. Breng een tweede coating door opnieuw onder te dompelen in de polymeer-oplossing en droge overnachting in omgevingscondities. Na UV behandeling en incubatie met bacterieën stukken (n = 3) met PBS (2 x 1 ml) en overbrengen naar 48-well platen bevattende 10% formaldehyde in PBS gedurende 30 min. Na vaststelling, was de stukken met PBS (1 ml), droog gedurende de nacht bij kamertemperatuur monteren op stomp met geleidende carbon schijven en goud laag met een sputter coater (zie stap 7,5). Verkrijgen van beelden met behulp van een scanning elektronenmicroscoop 6.